Infection des larves de poisson zèbre par des spores d’Aspergillus pour l’analyse des interactions hôte-pathogène

Ce protocole démontre un modèle d’infection par une larve de poisson-zèbre aspergillus, que nous pouvons utiliser pour étudier les réponses immunitaires innées à ce champignon. Le principal avantage du modèle larvaire de poisson-zèbre est que nous pouvons visualiser les interactions entre les cellules immunitaires et les agents pathogènes et la progression de l’infection à l’intérieur d’un animal hôte vivant tout au long d’une infection de plusieurs jours. Les résultats de ce modèle pourraient être applicables à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’aspergillose invasive chez les patients immunodéprimés.

La micro-injection de spores dans les larves de poisson-zèbre est une technique difficile qui nécessite beaucoup de pratique avant d’obtenir des résultats cohérents et reproductibles. Pour effectuer des micro-injections, utilisez l’ensemble fourni avec un injecteur de pression, une unité de pression d’aspirateur, une pédale, un porte-micropipette, un micro-manipulateur et un support et une plaque magnétiques. Le tout relié à une source d’air comprimé.

Ouvrez la vanne d’air comprimé. Et allumez le micro-injecteur. Réglez la pression à environ 25 psi, le renforcement à 60 millisecondes et l’unité de pression de l’aspirateur à 1 psi.

À l’aide d’une pointe de pipette à micro-chargeur, chargez l’aiguille de micro-injection de trois à cinq microlitres de PBS ou de suspension de spores avec du rouge de phénol. Montez ensuite l’aiguille sur le micromanipulateur. Aspergillus fumigatus est un pathogène opportuniste de l’homme.

Il existe un risque de perforation cutanée avec l’aiguille chargée. L’aiguille doit être très étroitement attachée au micro-injecteur, et les chercheurs doivent toujours porter des gants et porter une attention particulière aux mouvements de leurs mains autour de l’aiguille pour éviter les perforations. Positionnez le micromanipulateur de manière à ce que l’extrémité de l’aiguille soit visible au stéréomicroscope au grossissement le plus faible.

Zoomez à un grossissement de 4x, en gardant l’aiguille en vue. Ensuite, utilisez des pinces tranchantes pour couper l’extrémité de l’aiguille. Appuyez sur la pédale d’injection pour visualiser la taille de la gouttelette.

Et continuez à couper l’aiguille jusqu’à ce qu’environ trois nanolitres de suspension de spores sortent. Lorsque vous êtes prêt, écartez le micromanipulateur et l’aiguille pour éviter de heurter accidentellement l’aiguille pendant que vous disposez les larves sur la plaque d’injection. Versez la tricaïne E3 de la plaque d’injection.

Et transférez environ 24 larves anesthésiées de deux jours dans la plaque avec le moins d’E3 possible. Ensuite, disposez les larves en fonction de la direction dans laquelle elles font face, en plaçant toutes les larves orientées vers la droite dans une rangée et toutes orientées vers la gauche dans une rangée en dessous. Avec le microscope réglé sur le grossissement le plus bas, ramenez le micromanipulateur, de sorte que l’aiguille soit proche des larves à un angle de 30 à 60 degrés.

Zoomez sur le grossissement le plus élevé. Et utilisez des boutons de réglage précis pour ajuster davantage la position de l’aiguille. Injectez la suspension de spores dans le liquide à côté des larves pour vérifier que 30 à 70 spores sortent de l’aiguille.

Déplacez ensuite la plaque de manière à ce que l’aiguille soit directement au-dessus et positionnée près des premières larves. En commençant par les larves qui sont tournées vers l’aiguille. Insérez l’aiguille à travers le tissu autour de la vésicule otique et percez-la dans le ventricule du cerveau postérieur, en déplaçant la plaque si nécessaire pour obtenir la bonne orientation de la larve.

Vérifiez visuellement que l’extrémité de l’aiguille se trouve au centre du ventricule du cerveau postérieur. Appuyez ensuite sur la pédale pour injecter les spores et rétracter doucement l’aiguille. Après avoir injecté toutes les larves dans les deux rangées, écartez à nouveau l’aiguille.

Et zoomez à un grossissement plus faible. Le colorant rouge phénolique doit toujours être visible dans le cerveau postérieur de chaque larve. Éliminez toutes les larves dont les injections n’ont pas abouti et transférez les larves restantes dans une boîte de Pétri en les lavant de l’assiette avec de l’E3 frais. Rincez la larve deux fois avec de l’E3 et assurez-vous qu’elle se remet de l’anesthésie.

Immédiatement après l’injection, transférez huit des larves dans des tubes individuels de 1,7 millilitre et euthanasiez-les. Préparez 1 mL de PBS avec de l’ampicilline et de la kanamycine. Retirez autant de liquide que possible des tubes contenant les larves.

Ajoutez ensuite 90 microlitres de PBS avec des antibiotiques. Homogénéiser les larves dans un TissueLyser à 1800 oscillations par minute, pendant six minutes. Ensuite, faites-les tourner à 17 000 fois G pendant 30 secondes.

Pipetez la suspension homogénéisée de chaque tube jusqu’au milieu d’une plaque GMM étiquetée et étalez-la à l’aide d’un écarteur jetable en forme de L. En prenant soin d’éviter de s’étaler contre le bord. Incuber les assiettes à l’envers à 37 degrés Celsius pendant deux à trois jours.

Ensuite, comptez le nombre de colonies formées. Divisez les larves injectées restantes dans deux boîtes de 3,5 millimètres. L’un pour le traitement de la toxicomanie et l’autre pour le contrôle.

Retirez autant de liquide que possible et ajoutez E3 avec la commande du véhicule dans un plat. Et E3 avec le traitement de l’intérêt pour l’autre. À l’aide d’une pipette, transférez chaque larve dans un puits dans une plaque à 96 puits.

Et surveiller leur survie pendant sept jours. Le jour de l’imagerie, préparez une boîte de Pétri de 3,5 millimètres avec 100 micromolaires de PTU et une avec de la tricaïne E3. Ajoutez de la tricaïne E3 dans les chambres d’un appareil Z-wedge E et utilisez une micropipette P100 pour éliminer les bulles d’air des chambres et du canal de retenue.

Retirez ensuite tout l’excès de tricaïne E3 à l’extérieur des chambres. Pipetez une larve et transférez-la dans la boîte avec le PTU E3. Transférez-le ensuite dans la tricaïne E3, avec le moins de liquide possible.

Après 30 secondes, transférez les larves anesthésiées dans la chambre de chargement du dispositif de blessure et de piégeage. Retirez la tricaïne E3 de la chambre de blessure et libérez-la dans la chambre de chargement afin de déplacer la queue des larves dans le canal de restriction. Assurez-vous que la larve est positionnée sur son côté latéral, dorsal ou dorsolatéral afin que le cerveau postérieur puisse être imagé avec une lentille d’objectif inversée.

Après avoir photographié la larve à l’aide d’un microscope confocal, libérez de la tricaïne E3 dans la chambre de blessure pour pousser la larve du canal de retenue dans la chambre de chargement. Ramassez la larve et transférez-la dans la boîte avec de la tricaïne E3. Transférez-le ensuite dans le plat avec du PTU E3 avec le moins de liquide possible.

Rincez-le au PTU et transférez-le dans la plaque à 48 puits. Des spores d’Aspergillus ont été micro-injectées dans le cerveau postérieur de larves de poisson-zèbre, un résultat d’infection a été surveillé. Très peu de décès ont été observés chez les larves de type sauvage, 80 à 100 % des larves ayant survécu à l’ensemble de l’expérience.

Une diminution significative de la survie a été observée chez les larves immunodéprimées. Lorsque des unités formant des colonies à partir de larves de type sauvage infectées ont été quantifiées, la persistance des spores et la lenteur de la clairance au fil du temps ont été observées. Le nombre de spores survivant un, deux, trois, cinq et sept jours après l’infection a été normalisé en fonction du nombre de spores injectées, afin de comparer la persistance et la clairance entre les répliques.

Lorsque les macrophages ont été marqués, la concentration de microphages chez environ 50 % des larves a généralement été observée à partir de deux à trois jours après l’infection. Le recrutement des neutrophiles a été retardé, se produisant principalement après une germination fongique. Alors que la charge fongique a persisté pendant toute l’expérience chez la majorité des larves.

Une clairance a été observée chez certains cinq jours après l’infection. Chez un autre sous-groupe de larves, une dissémination fongique vers des zones situées à l’extérieur du cerveau postérieur a été observée. La zone autour de la vésicule otique est l’un des endroits où cette dissémination a été trouvée.

La germination fongique était généralement observée au bout de cinq jours chez 60 % des larves. La surface des grappes de phagocytes, le recrutement des macrophages et le recrutement des neutrophiles ont varié au fil du temps chez toutes les larves. Certains ont tendance à augmenter tout au long de l’expérience, et d’autres à se résoudre au fil du temps.

Cette procédure peut être combinée à une manipulation génétique du poisson-zèbre, comme avec CRISPR, pour déterminer la nécessité de voies d’hôte spécifiques dans une réponse immunitaire innée réussie à l’aspergillus. Ce protocole a permis de visualiser les interactions entre les cellules immunitaires innées d’aspergillus en temps réel, chez des hôtes vivants et intacts.