Un modèle épithélial bronchique d’interface air-liquide pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules aéroportées pour l’essai de toxicité
13 mai 2020
Décrit est la culture cellulaire et la méthode d’exposition d’un modèle bronchique in vitro pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules pour l’essai de toxicité.
Ce protocole décrit comment cultiver et exposer les cellules épithéliales bronchiques humaines par l’air. Il s’agit d’un modèle plus réaliste pour étudier l’exposition du poumon aux particules inhalées. Les cellules pulmonaires préparées avec ces méthodes, pour ressembler à l’environnement réel dans le poumon. Les cellules produiront du mucus, formeront une barrière étanche et resteront viables pendant plusieurs semaines. Cette méthode peut être utilisée pour étudier les effets toxiques des particules en suspension dans l’air. Il peut également être utilisé pour étudier les maladies infectieuses des voies respiratoires et les médicaments pris par inhalation. Lorsque vous essayez ce protocole pour la première fois, gardez à l’esprit que la génération d’un agile nécessite les connaissances d’un spécialiste. Il nécessite également un équipement dédié pour la mesure. Commencez par diluer les cellules dans un milieu de culture cellulaire préchauffé ou CCM, à une concentration de 500 000 cellules par millilitre pour les inserts à 6 puits. Et 250 000 cellules par millilitre pour les inserts à 12 puits. Placez une plaque de culture cellulaire avec des inserts dans des conditions aseptiques et remplissez la face latérale basale avec du CCM préchauffé. Après avoir mélangé la suspension cellulaire, pipetez-la sur le dessus de la membrane dans l’insert de culture cellulaire. Couvrez l’assiette et incubez-la à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Cultivez les cellules dans des conditions immergées pendant sept jours, pour leur permettre d’atteindre la confluence, en changeant le CCM tous les deux à trois jours. Pour mesurer la résistance électrique transépithéliale, utilisez un voltohmmètre épithélial chargé, complété par un jeu d’électrodes à baguettes. Nettoyez les électrodes avec de l’éthanol à 70 %. Placez l’électrode la plus longue dans le milieu de culture externe, jusqu’à ce qu’elle touche le fond du plat. Et l’électrode plus courte dans le fluide, sans toucher la membrane. Commencez à collecter des mesures sur l’insert vide sans cellules. Attendez que la mesure se stabilise et notez la résistance en ohms. Cette mesure est la résistance de la membrane d’insertion sans aucune cellule ou résistance à blanc. Répétez la mesure pour chaque insert et soustrayez la résistance à blanc pour obtenir la résistance réelle, et multipliez par la surface de l’insert. Retirez le milieu du côté apical des inserts et ajoutez du CCM préchauffé sur le côté basolatéral du puits. Le fluide doit toucher la membrane par le bas, mais ne pas fuir sur le haut de l’insert. Cultivez les cellules à l’interface air-liquide dans l’incubateur, à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant sept jours. Changement du milieu basolatéral tous les deux à trois jours. Peu de temps avant l’exposition aux particules, préparez une suspension de nanoparticules à 1 %. Pré-mouiller les NP avec 96 % d’éthanol. Ajouter de l’eau pure à une concentration finale de 1 % de NPs. Mettre le flacon dans un bécher sur de la glace. Sonicez la suspension pendant 16 minutes, ajoutez un mélange dans la bouteille avec la dispersion, puis connectez la bouteille à une pompe péristaltique via un petit tube et ajustez le débit à 25 millilitres par heure. Un jour avant l’exposition, allumez la station d’exposition automatisée ou AES et laissez l’armoire atteindre une température de 37
Aperçu
Cette étude porte sur le développement d'un modèle bronchique in vitro afin de simuler une exposition répétée par inhalation à des particules en suspension dans l'air pour des tests de toxicité. Les cellules épithéliales bronchiques humaines cultivées présentent une viabilité prolongée et une production de mucus réaliste, ce qui rend le modèle adapté aux études toxicologiques et à la recherche sur les maladies infectieuses.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Toxicologie
- Biologie respiratoire
- Modèles in vitro
Contexte
- La nécessité de modèles d'exposition pulmonaire réalistes
- Importance de l'étude des particules inhalées
- Applications dans la recherche sur la vectorisation de médicaments et les maladies infectieuses
Méthodes utilisées
- Techniques de culture cellulaire pour les cellules épithéliales bronchiques humaines
- Conditions de culture en interface air-liquide
- Mesure de la résistance électrique transepithéliale
Résultats principaux
- Les cellules forment une barrière étanche et produisent du mucus
- La viabilité est maintenue pendant plusieurs semaines dans des conditions contrôlées
- La méthode est validée pour être utilisée dans des évaluations toxicologiques
Conclusions
- Le modèle développé imite efficacement l'exposition pulmonaire aux particules inhalées
- Implications importantes pour les tests de toxicité et la recherche respiratoire
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les modèles in vitro réalistes d'épithélium bronchique sont essentiels pour les tests prédictifs de toxicité par inhalation et pour la recherche sur la délivrance respiratoire de médicaments. Le système air-liquide (ALI) utilisant des cellules Calu-3 permet des études d'exposition répétée à faible dose qui imitent étroitement les conditions des voies respiratoires humaines, offrant ainsi une meilleure confiance translationnelle lors de l'évaluation précoce de composés. Cette approche répond au besoin de modèles physiologiquement pertinents et reproductibles dans les filières biopharmaceutiques respiratoires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet de réduire les risques mécanistiques liés aux effets des composés inhalés sur l'épithélium des voies respiratoires.
- Prend en charge la validation fonctionnelle des cibles en maintenant les jonctions serrées et la production de mucus pendant des périodes prolongées.
- Facilite une évaluation prédictive fiable de la toxicité respiratoire et des analyses de sécurité.
Développement de criblages et de tests
- Offre un système validé et reproductible pour la mesure quantitative de l'intégrité de la barrière épithéliale.
- Permet la standardisation des tests pour des expositions répétées à de faibles concentrations de particules.
- Permet une évaluation fiable des effets des composés aéroportés en conditions d'écoulement continu.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles de voies respiratoires pertinents pour les études translationnelles de biomarqueurs liés aux maladies.
- Assure la continuité entre la découverte in vitro et les flux de travail précliniques de toxicologie par inhalation.
- Réduit le risque d'échec en phase avancée en modélisant des scénarios d'exposition réalistes.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce modèle bronchique en culture à l'interface air-liquide s'intègre dans la continuité découverte-préclinique pour les thérapeutiques respiratoires et la toxicologie par inhalation.
- Découverte en biologie : Soutient les tests d'hypothèses sur la fonction barrière des voies respiratoires et la toxicité des particules.
- Criblage : Fournit des mesures reproductibles et quantitatives de la résistance transepithéliale et de la viabilité.
- Analyse : Permet une surveillance continue de la concentration d'exposition et de la dose administrée.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats in vitro aux études précliniques d'inhalation en utilisant des critères d'évaluation pertinents pour les maladies.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre une plateforme standardisée adaptable à diverses études sur les particules en suspension dans l'air et les médicaments.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les essais de toxicité respiratoire.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'extensibilité des protocoles d'exposition répétée.
- Valeur stratégique : Permet de mieux évaluer les décisions de poursuite ou d'abandon et d'optimiser l'efficacité du capital dans le développement de portefeuilles respiratoires.
- Impact sur le portefeuille : Facilite la priorisation ajustée au risque des composés et formulations inhalés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture cellulaire en condition d'interface air-liquide et en mesure de la barrière épithéliale.
- Requiert un instrument dédié pour l'exposition en flux continu et la surveillance de la résistance.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'exposition et de l'analyse des données.
- Adaptable à divers types et concentrations de particules aéroportées dans les limites du modèle.
- Dépend du maintien de la viabilité cellulaire et de l'intégrité des jonctions serrées pendant des périodes prolongées de culture.
