Activation optogénétique des voies afférentes dans les tranches de cerveau et modulation des réponses par des anesthésiques volatils

Ce protocole peut être utilisé pour déterminer si les anesthésiques volatils perturbent certains synopsis plus que d’autres, pour déterminer si leurs effets sont de type cellulaire ou spécifiques à une voie, et pour déterminer quels effets se produisent au niveau de la population. Le principal avantage de cette technique est la spécificité avec laquelle nous pouvons évaluer les effets des anesthésiques volatils. Nous pouvons cibler des voies et des types de cellules spécifiques en testant simultanément l’activité de la population.

Commencez par préparer le bloc de tissu pour la section. Soulevez doucement le cerveau de la cavité crânienne et placez-le sur le papier filtre. Faites une coupe le long du plan sagittal du cerveau parallèlement à la ligne médiane et placez le bloc de tissu sur ce plan sagittal.

Guidez le papier filtre sur le modèle de blocage et alignez le cerveau avec le contour du modèle sous-jacent. Faites une coupe parallèle dans le plan coronal comme indiqué par les lignes sur le gabarit, en ajoutant une petite goutte de tranchage aCSF pour garder le papier filtre humide si nécessaire. Placez le bloc de tissu à quatre degrés Celsius en coupant l’aCSF et appliquez une petite quantité de colle sur l’étage de l’échantillon glacé.

Soulevez le bloc de tissu du tranchage aCSF et évacuez l’excès de solution avec un coin d’une serviette absorbante. Collez le plan coronaire postérieur du bloc de tissu au stade de l’échantillon, la surface dorsale du cerveau faisant face à la lame de saphir. Prélevez des tranches de cerveau coronal de 500 micromètres d’épaisseur et placez-les sur un treillis en nylon à 34 degrés Celsius en tranchant un LCR.

Laissez le récipient atteindre la température ambiante. Pour préparer des sacs expérimentaux de LCR avec de l’isoflurane dissous, ajoutez 600 millilitres de LCa expérimental et 600 millilitres de mélange gazeux à 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone dans un sac de gaz polytétrafluoroéthylène vide. Étiquetez ce contrôle de sac.

Ajoutez 300 millilitres d’aCSF expérimental dans un autre sac de gaz polytétrafluoroéthylène et étiquetez ce sac isoflurane. Procédez à la préparation du sac d’isoflurane selon les instructions du manuscrit. Configurez les protocoles de simulation de lumière en attribuant de manière aléatoire des formes d’onde à chaque profil.

Chaque profil avec sa forme d’onde attribuée correspond à une impulsion de déclenchement d’une entrée TTL numérique ou d’un essai. Lorsque vous avez terminé, enregistrez la séquence de profils. Pour placer la sonde multicanaux dans la lame de tissu cérébral ex vivo, perfuser un aCSF expérimental à bulles de trois à six millilitres par minute, puis transférer la tranche de cerveau contenant la zone d’intérêt sur la grille de maille de la chambre de perfusion du microscope.

Ancrez la tranche de cerveau avec une harpe en platine. Faites pivoter la grille de maille de sorte que la ligne de contacts de l’électrode à l’extrémité distale de la sonde multicanaux soit approximativement perpendiculaire à la surface du pelage. Sous un éclairage à large champ et un contrôle précis du micromanipulateur, abaissez la sonde multicanaux vers la surface de la tranche.

Engagez le cube filtrant approprié pour la visualisation de la protéine rapporteure fluorescente exprimée dans les terminaisons axonales des afférences corticales. Si nécessaire, tournez la tranche pour aligner plus précisément la sonde avec la surface de la peau. Positionnez la sonde juste au-dessus du plan de la tranche à 200 micromètres de la position cible finale le long de l’axe des x, en laissant au moins un canal à l’extérieur de la zone de tissu enregistrée.

Insérez lentement la sonde dans la tranche le long de son axe longitudinal. Pour minimiser les dommages aux tissus, n’avancez la sonde que dans la mesure où les pointes pointues sont à peine visibles sous la surface du tissu. Basculez la source expérimentale d’aCSF vers la solution de contrôle en sac et identifiez la cellule marquée par fluorescence pour l’enregistrement ciblé par patch clamp.

Limitez l’ouverture au plus petit diamètre et engagez l’objectif à immersion dans l’eau haute puissance, en prenant soin d’éviter tout contact entre la sonde multicanaux et la lentille de l’objectif. Faites la mise au point sur le tissu. Centrez la lumière sur une zone de tissu adjacente à la sonde multicanaux, mais ne la chevauchant pas.

Engagez le jeu de filtres approprié pour permettre l’imagerie des cellules exprimant le marqueur fluorescent dépendant de Cre. Soulevez l’objectif pour créer suffisamment d’espace pour abaisser une pipette patch. Chargez une pipette patch avec la solution interne et montez-la sur le porte-électrode.

À l’aide d’une seringue d’un millilitre, appliquez une pression positive correspondant à environ 0,1 millilitre d’air. Abaissez la pipette patch dans la solution en mettant la pointe au point sous guidage visuel, et obtenez un enregistrement de la cellule entière à partir de la cellule ciblée. Les animaux utilisés dans ce protocole ont exprimé la protéine rapporteure fluorescente tdTomato dans des interneurones positifs à la somatostatine ou à la parvalbumine.

Ces interneurones ont été ciblés pour le serrage du patch sous guidage visuel avec le cube de filtre approprié engagé. Des potentiels postsynaptiques ont été observés dans les interneurones en réponse à un train de quatre impulsions lumineuses de deux millisecondes. Les potentiels de terrain locaux ont également été enregistrés.

La densité de la source de courant et l’activité multi-unités ont été extraites des potentiels de champ locaux. L’amplitude des puits de courant extraits de la densité de la source de courant a augmenté en fonction de l’intensité lumineuse. Une équation logistique non linéaire à trois paramètres a été ajustée aux données pour des comparaisons entre les parcours.

L’amplitude potentielle postsynaptique a également augmenté avec l’amplitude du puits de courant. Les réponses synaptiques aux entrées thalamocorticales et cortico-corticales ont été mesurées dans des conditions de contrôle, d’isoflurane et de récupération. Les réponses post-synaptiques de la somatostatine et des stimuli cortico-corticaux et les puits de courant évoqués ont été supprimées dans des conditions d’isoflurane.

Lors de la préparation des tranches de cerveau, le maintien de la santé des tissus est primordial. Il est important de garder le tissu au frais tout au long de la procédure de tranchage, en agissant rapidement sans endommager le tissu. Les enregistrements extracellulaires multicanaux peuvent être post-traités de différentes manières.

Par exemple, le filtrage passe-haut du signal à large bande isole l’activité de pic de population, tandis que les calculs de densité de source actuels mettent en évidence l’activité synaptique. Ensemble, ces techniques nous ont permis d’explorer les effets anesthésiques sur des composants isolés spécifiques des circuits corticaux, donnant ainsi un aperçu des mécanismes sous-jacents à la perte de conscience in vivo.