Name: Approches quantitatives pour la notation in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Découvrez les méthodes quantitatives pour quantifier les exophers neuronaux chez C. elegans par imagerie en fluorescence. Ces approches permettent d'étudier l'élimination des agrégats cellulaires et ouvrent des perspectives thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives.

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Nous reconnaissons les subventions suivantes aux NIH : R01AG047101 et R37AG56510. Les membres des laboratoires Driscoll et Grant ont largement contribué à l’élaboration et à l’ajustement des protocoles décrits, avec des expériences rigoureuses et une communication solide.

<ol><li>Davis, A. A., Leyns, C. E. G., Holtzman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+Spread+of+Protein+Aggregates+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular Spread of Protein Aggregates in Neurodegenerative Disease.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 545-568 (2018).</li>
<li>Davis, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+degradation+of+axonal+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular degradation of axonal mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), 9633-9638 (2014).</li>
<li>Torralba, D., Baixauli, F., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+Know+No+Boundaries%3A+Mechanisms+and+Functions+of+Intercellular+Mitochondrial+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria Know No Boundaries: Mechanisms and Functions of Intercellular Mitochondrial Transfer.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 107(2016).</li>
<li>Stahl, P. D., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Exosomes+and+Microvesicles+Integrators+of+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%2C+Md.%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Exosomes and Microvesicles Integrators of Homeostasis.</a> Physiology (Bethesda, Md.). 34 (3), 169-177 (2019).</li>
<li>Melentijevic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-elegans+neurons+jettison+protein+aggregates+and+mitochondria+under+neurotoxic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">C-elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress.</a> Nature. 542 (7641), 367(2017).</li>
<li>Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+a+prion+domain+from+cell-to-cell+by+vesicular+transport+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 9 (3), 1003351(2013).</li>
<li>Tyson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+animal+model+defines+genetic+contributions+for+neuron-to-neuron+transfer+of+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Novel animal model defines genetic contributions for neuron-to-neuron transfer of alpha-synuclein.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+spreading+of+huntingtin+aggregates+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 5427-5433 (2015).</li>
<li>Pearce, M. M. P., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+neuronal+huntingtin+aggregates+to+phagocytic+glia+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain.</a> Nature Communications. 6, 6768(2015).</li>
<li>Fu, H., Li, J., Du, P., Jin, W., Cui, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+wastes+are+extracellularly+disposed+by+excretosomes%2C+nanotubes+and+exophers+in+mouse+HT22+cells+through+an+autophagic+vesicle+clustering+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Metabolic wastes are extracellularly disposed by excretosomes, nanotubes and exophers in mouse HT22 cells through an autophagic vesicle clustering mechanism.</a> bioRxiv. 10 (1), (2019).</li>
<li>Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-reoxygenation+regulates+mitochondrial+dynamics+through+the+hypoxia+response+pathway%2C+SKN-1%2FNrf%2C+and+stomatin-like+protein+STL-1%2FSLP-2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2.</a> PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).</li>
<li>Cannon, M. B., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox-sensitive+green+fluorescent+protein%3A+probes+for+dynamic+intracellular+redox+responses.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox-sensitive green fluorescent protein: probes for dynamic intracellular redox responses. A review.</a> Methods in Molecular Biology. 476, 51-65 (2008).</li>
<li>Perkins, L. A., Hedgecock, E. M., Thomson, J. N., Culotti, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+sensory+cilia+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mutant sensory cilia in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 117 (2), 456-487 (1986).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+The+Online+Review+of+C.+Elegans+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Santelli, J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+growth+and+aging+of+Caenorhabditis+elegans+in+the+presence+of+fluorodeoxyuridine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Synchronous growth and aging of Caenorhabditis elegans in the presence of fluorodeoxyuridine.</a> Journal of Gerontology. 34 (1), 28-36 (1979).</li>
<li>Weicksel, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+small+molecule+that+disrupts+a+key+event+during+the+oocyte-to-embryo+transition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel small molecule that disrupts a key event during the oocyte-to-embryo transition in C. elegans.</a> Development. 143 (19), 3540-3548 (2016).</li>
<li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+long-term+immobilization+in+a+hydrogel-microbead+matrix+for+high-resolution+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+and+other+small+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Reversible and long-term immobilization in a hydrogel-microbead matrix for high-resolution imaging of Caenorhabditis elegans and other small organisms.</a> PloS One. 13 (3), 0193989(2018).</li>
<li>Toth, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+sprouting+and+synapse+deterioration+in+the+aging+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurite sprouting and synapse deterioration in the aging Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Journal of Neuroscience. 32 (26), 8778-8790 (2012).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 109, (2015).</li>
<li>Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+neuronal+RNAi+in+C.+elegans+using+SID-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1.</a> Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).</li>
<li>Maher, K. N., Catanese, M., Chase, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+knockdown+in+C.+elegans+using+dsRNA+feeding+libraries+to+generate+robust+loss-of-function+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene knockdown in C. elegans using dsRNA feeding libraries to generate robust loss-of-function phenotypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50693(2013).</li>
</ol>

La caractérisation des mécanismes moléculaires in vivo de l’élimination des agrégats et des organelles sous la forme de grands exophes n’en est qu’à ses balbutiements. Il reste à régler les questions relatives à la désignation des cargaisons pour expulsion, à la collecte polarisée de ces cargaisons dans la cellule, à la réglementation de la décision de générer des exophers, à la machinerie qui sert de médiateur aux extrusions et à l’interaction des exopherons avec la machinerie dégradatrice d’une cellule voisine. En outre, la visualisation in vivo des connexions tubulaires qui peuvent passer des matériaux biologiques qui incluent le calcium, les agrégats, et les mitochondries est intéressante et la biologie sous-étudiée dans son propre droit. Les questions de savoir pourquoi certaines cellules sont plus sujettes à la production d’exopher que d’autres sont également non résolues, mais peuvent commencer à être génétiquement disséquées avec les approches décrites dans ce protocole.
Décrit en détail dans ce protocole sont les approches pour atteindre la notation reproductible de la production d’exopher, avec l’attention à distinguer les exopheurs des somas cellulaires voisins, le moment des analyses pour capturer le pic de la production d’exopher, et le contrôle strict des conditions de croissance pour éliminer les contraintes involontaires qui peuvent moduler les niveaux d’exopher. La distinction du grand exopher précoce, ou la dispersion de la « nuit étoilée » dans l’hypoderme environnant peut être quantité comme preuve de la production d’exopher. Cela étant dit, les neurones exprimant mCherry dans des conditions basales sont le plus souvent associés à 5-25% des neurones d’un type spécifique produisant un exopher. L’introduction contrôlée de conditions de stress pourrait être appliquée pour augmenter la production d’exopher à la détection aussi élevé que 90% des neurones produisant des extrusions, particulièrement utile pour les écrans génétiques ou pharmacologiques pour les modificateurs.
Dans les maladies neurodégénératives humaines, de grands agrégats peuvent se transférer des neurones malades dans les cellules voisines pour favoriser la propagation de la pathologie. Le mécanisme d’exopher pourrait se produire par l’intermédiaire d’un mécanisme conservé utilisé pour l’extrusion globale à travers phyla. Définir les molécules in vivo qui améliorent l’efficacité de ce processus (considéré comme un contrôle plus efficace de la protéostase) ou bloquent- ils pourraient être exploités pour influencer la conception de nouvelles stratégies de lutte contre les maladies neurodégénératives multiples. En tant que tel, le protocole décrit ici pourrait être utilisé pour les écrans de mutagenèse génétique classique, les écrans RNAi à l’échelle du génome qui assomment systématiquement les gènes pour identifier les exhausteurs et les suppresseurs, ou pour des études d’intervention médicamenteuse qui identifient les modificateurs pharmacologiques candidats de ce processus. L’approche est simple, bien que quelque peu laborieuse. Les exophers sont si grands qu’ils peuvent être vus avec un microscope à dissection à grossissement élevé. Pourtant, les neurones C. elegans sont relativement petits et regarder leurs organites ou leurs membranes nécessitent des images confocales de puissance supérieure et est un processus lent. Les options pour un débit plus élevé pourraient impliquer des approches d’imagerie à haute teneur en format de plaque multi-puits.
L’application d’une approche normalisée à la notation exopher devrait sous-tendre une dissection génétique concertée du processus par lequel les neurones peuvent organiser et éliminer les débris cellulaires.

Les défis neurotoxiques des agrégats et des mitochondries dysfonctionnelles ont longtemps été considérés comme intrinsèques aux cellules, mais plus récemment, il est devenu clair que les protéines mal repliées sur la maladie humaine provenant d’un neurone peuvent également se propager aux cellules voisines, favorisant la pathologie1. De même, les mitochondries de mammifères peuvent être envoyées hors de la cellule de leur production originale pour la dégradation transcellulaire2 ou pour le sauvetage des populations mitochondriales dans les cellules voisines contestées3. Des vésicules de différentes tailles ont généralement été observées pour transférer des matériaux cellulaires vers les cellules voisines ou vers l’environnement fluide4. Certains vésicules extrudées approchent de la taille du soma neuronal moyen (soma moyen de neurone tactile ~ 6 μm) et peuvent accueillir de grands agrégats et organites.
Un exemple frappant de grande extrusion de vésicule qui peut transporter des agrégats de protéines et des organites se produit dans les neurones récepteurs tactiles de C. elegans qui expriment un nombre élevé de reporter de copie construct encodage d’une agrégation nocive-sujette, mCherry-résistant à la dégradation5. Les extrusions des neurones tactiles, appelées exophers, ont un diamètre moyen d’environ 4 μm, comprennent sélectivement mCherry ou d’autres agrégats, et sont livrées directement dans l’hypoderme voisin, qui entoure normalement les neurones récepteurs tactiles. L’hypoderme tente une dégradation à base de lysosome, mais certains contenus non digestibles tels que les agrégats de mCherry peuvent être ré-extrudés par l’hypoderme dans le pseudocoelom rempli de liquide de l’animal, à partir de laquelle le mCherry peut être absorbé par des cellules de charognard à distance appelées coélomocytes pour le stockage à long terme (Figure 1, Figure 2)5.
Les grandes vésicules extrudées exophaires quittent la cellule entourée d’une membrane plasmatique à récepteur tactile et peuvent contenir des protéines, des mitochondries et des lysosomes de maladies humaines agrégées. Le processus de production d’exopher semble impliquer le tri d’espèces potentiellement toxiques (par exemple, un mCherry exprimé sujet à l’agrégation est séparé des protéines solubles et inoffensives comme le GFP qui reste principalement dans le soma neuronal). De cette façon, l’expulsion dirigée des entités menaçantes est accomplie par le neurone5. Un défi de protéostase, tel que le stress induit par l’abattissement d’autophagie, l’inhibition protéasome médiée par MG132, ou l’expression transgénique des protéines de la maladie humaine telles que la polyglutamine étendue Q128 associée à la maladie de Huntington ou le fragment Aβ1-42impliquant la maladie d’Alzheimer, peut augmenter le nombre de neurones qui produisent des exophers5.
Comme les exophers n’ont été documentés que récemment, ce que l’on sait de leur biologie mérite la description. Des exophers ont été découverts dans les neurones récepteurs tactiles C. elegans les plus étudiés. Il y a six neurones tactiles mécanosensoriels C. elegans qui ont des corps cellulaires répartis autour du corps (Figure 3A) et sont appelés cellules microtubules parce que leur ultrastructure comporte 15 microtubules protofilament distinctifs. Les neurones récepteurs tactiles sont l’AVM antérieur (neurone microtubule ventral antérieur), l’ALMR et l’ALML (neurones latéraux antérieurs microtubules à droite et à gauche), le PVM plus central (neurone microtubule ventral postérieur), et le PLMR postérieur et PLML (neurones latéraux postérieurs microtubules à droite et à gauche) dans la queue. Fait intéressant, les six neurones récepteurs tactiles produisent des exophers à des taux différents, en dépit d’exprimer le même transgène offensant (Figure 3C). Des six neurones sensibles mécanosensoriels, le neurone ALMR subit l’exophergenesis plus souvent que les autres neurones tactiles. La quantitation des nombres d’exopher des neurones tactiles est donc généralement établie en se concentrant sur l’ALMR.
L’exophégenèse est un processus dynamique qui commence généralement par un gonflement du cytoplasme neuronal (figure 1A-B). Le contenu cellulaire, les organites ou les agrégats protéiques sont recueillis d’un côté du soma neuronal, le plus souvent vers l’extrémité postérieure du neurone ALMR (loin de la neurite de projection), formant un domaine pré-exopher (PED) (Figure 1B). La saillie précoce est observée lorsque le PED commence à se projeter vers l’extérieur, formant un bourgeon saillant reconnaissable. Le bourgeon tardif est défini lorsque le diamètre le plus large du domaine pré-exopher est environ 1/3 plus grand que le diamètre de la constriction du cou soma-exopher (figure 1C). Les exophers peuvent être éjectés dans presque n’importe quelle direction du soma, mais la plupart des exophers sortent postérieurement du corps cellulaire et restent dans approximativement le même plan focal que le soma originaire.
L’exopher peut s’éloigner du soma d’origine lorsque le cou du bourgeon se rétrécit en un mince filament. Les exophers peuvent rester attachés au soma par ce filament (figure 1D, flèche)et peuvent plus tard se détacher. Les contenus cellulaires tels que le calcium, les agrégats et les mitochondries peuvent être transférés par l’intermédiaire de ce filament dans l’exopherattaché 5, bien que la majeure partie du matériel extrudé soit mise dans le compartiment exopher par l’événement massif en herbe. Les exophers sont considérés comme matures lorsqu’il n’y a pas de tube de connexion visible ou de filament mince et que l’exopher est complètement séparé du soma d’envoi (figure 1E).
Les exomères produits par C. elegans touchent immédiatement l’hypoderme, le tissu qui entoure le neurone tactile. Le plus souvent, le vésicule exopher semble voyager dans l’hypoderme postérieurement vers la queue, et peut être assez éloigné de la soma avant que le contenu exopher apparaissent ciblés pour la dégradation (par exemple, la distance peut être ~100 μm loin de la soma (Figure 1F)). La vésicule exophaire fluorescente se décompose en de nombreux vésicules plus petites dans l’hypoderme, prenant une apparence appelée « nuit étoilée » (figure 1G et figure 2). Au stade de la « nuit étoilée », on peut observer des matériaux fluorescents punctate dispersés à travers le syncytium hypodermique en de nombreux petits points de fluorescence par rapport à l’exopher solitaire d’origine. Nuit étoilée peut sembler punctate sous le grossissement bas et avec le grossissement plus élevé, peut sembler punctate et/ou réseauté dans l’hypoderme. Le signal fluorescent de la nuit étoilée est généralement plus faible que l’exopher et la fluorescence exprimée par neurone (Figure 2B-C). La dispersion de mCherry en beaucoup de vesicules punctate est pensé pour impliquer la maturation phagosome et la fusion avec le réseau endosome/lysosomal de la cellule hypodermique. Certains matériaux exophaires sont probablement dégradés dans le réseau lysosomal hypodermique, mais les espèces résiduelles qui sont résistantes à la dégradation (comme les agrégats de mCherry) sont jetées hors de l’hypoderme dans le pseudocoelom, un compartiment fluide qui peut contenir des débris cellulaires. Le matériau fluorescent est plus tard pris en charge par les cellules charognardes éloignées appelées coélomocytes (Figure 2C), qui peuvent se concentrer, stocker, et à nouveau tenter la dégradation de mCherry.
Le phénomène de l’extrusion et du transfert d’agrégats semble conservé à travers le phyla, ayant été rapporté dans des modèles génétiques tels que C. elegans5,6,7 et D. melanogaster8,9 ainsi que dans plusieurs modèles de mammifères. Des extrusions exophéro-semblables ont été rapportées pour les cellules de mammifères10, une observation suggérant que les mécanismes conservés pourraient sous-être l’expulsion d’agrégat et d’organelle. La production d’exopher peut donc être un mécanisme conservé de la gestion des débris cellulaires qui constitue une branche fondamentale, mais autrefois non reconnue, de la protéostase neuronale et du contrôle de la qualité mitochondriale, qui, lorsqu’elle est déséquilibrée, pourrait contribuer activement à la maladie neurodégénérative. L’identification des molécules impliquées dans la discrimination et le tri des débris, le transport vers un lieu subcellulaire distinct, l’extrusion, la formation/scission de la connexion tubulaire reliant le soma et l’exopher tardif, et la reconnaissance de la grande vésicule extrudée pour la dégradation à distance par une cellule voisine restent pour des travaux futurs. Les études sur les modèles de nématodes et de mouches seront d’une importance cruciale pour définir les mécanismes de collecte et de transfert d’agrégats et d’orgales, en utilisant des approches génétiques impartiales et des outils biologiques cellulaires puissants offerts par ces modèles pour identifier les molécules participantes dans le contexte physiologique.
Les premières étapes critiques dans le déchiffrement des mécanismes opératoires dans la biologie exopher impliquent la définition de protocoles pour la quantification in vivo exopher in vivo. Le modèle C. elegans offre un avantage particulier pour de tels efforts puisque le corps est transparent et les exophers peuvent être facilement observés lorsqu’ils contiennent des protéines ou des organites fluorescents. Des exomères ont été générés par les neurones dopaminergiques C. elegans PDE et CEP, les neurones sensoriels ASE et ASER, et les neurones amphid deteinture-remplissage 5. Parce que les exophes produits par les neurones récepteurs tactiles sont mieux caractérisés, l’accent est mis ici sur l’utilisation des neurones tactiles pour l’analyse exopher. Toutefois, l’approche de base peut être appliquée pour mesurer la production d’exophér à partir de n’importe quelle cellule. Les protocoles de détection et de quantitation des exophers produits par les neurones récepteurs tactiles C. elegans qui expriment transgénétiquement la protéine mCherry sont décrits, en mettant l’accent sur les cargaisons qui peuvent être surveillées et les contraintes temporelles dans la notation. Cet article définit les approches vers l’identification in vivo exopher, et la quantitation des conditions environnementales et génétiques qui modulent la production d’exopher. Les protocoles mettent l’accent sur l’attention critique portée aux conditions constantes de non-stress pour la détermination de la production d’exopher de base et pour les comparaisons entre les génotypes.

<table><tbody><tr><td>95B Scientific Caméra CMOS</td><td>Photometrics Prime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 000 &mu ; L pointes à faible rétention</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL pipette sérologique</td><td>Appleton Woods</td><td>CC214</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu ; L embouts à faible rétention</td><td>Sarstedt</td><td>70.1130.105</td><td></td></tr><tr><td>Hypochlorite de sodium à 13 %</td><td>Acros Organics</td><td>AC219255000</td><td></td></tr><tr><td>tubes à centrifuger de 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Flacons erlenmeyer de 2 L</td><td>Fournitures de laboratoire scientifique</td><td>FLA4036</td><td></td></tr><tr><td>pipette sérologique de 25 mL</td><td>Appleton Woods</td><td>CC216</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu ; L embouts à faible rétention</td><td>Sarstedt</td><td>70.765.105</td><td></td></tr><tr><td>50 mL pipette sérologique</td><td>Appleton Woods</td><td>CC117</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2'-désoxyuridine 98 %</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L16497.ME</td><td></td></tr><tr><td>9 cm stériles Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>11309283</td><td></td></tr><tr><td>éthanol absolu</td><td>Vwr</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Souche de C. elegans de type sauvage</td><td>Fourni par CGC</td><td>N2</td><td>Souche de C. elegans</td></tr><tr><td>chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>cholestérol</td><td>Acros</td><td>110190250</td><td></td></tr><tr><td>phosphate de sodium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Souche S3264</td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td>Fourni par CGC</td><td>Op50</td><td>Souche E coli</td></tr><tr><td>FBS10 Microscope standard</td><td>Meyer Instruments</td><td>KSC 410-1-100-1</td><td>FBS10 Standard avec socle à plaque, tête trinoculaire 100/100 et zoom rabattable</td></tr><tr><td>pipette en verre 270 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB50255</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermofisher scientific</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Épandeurs d’inoculation</td><td>Fisher Scientific</td><td>11821741</td><td></td></tr><tr><td>LB medium gélules</td><td>MP biomedicals</td><td>3002-031</td><td></td></tr><tr><td>LDI &ndash ; Illuminateur à diode laser</td><td>89 North</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lévamisole</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16595-80-5</td><td></td></tr><tr><td>M4 multipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000012</td><td></td></tr><tr><td>sulfate</td><td>de magnésium Sigma Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>monobasique phosphate de potassium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Multitron Incubateur à agitation standard</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td>INFO28573</tr><tr><td>Nalgene 1 L Centrifugeuses</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pipette P10</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipette</td><td>Eppendorf Research Plus</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>pipeteboy 2</td><td>VWR</td><td>612-0927</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles de polystyrène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00131491</td><td></td></tr><tr><td>RC5C plus centrifugeuse au sol</td><td>Sorvall</td><td>9900884</td><td></td></tr><tr><td>Lames de cytologie annulaires réutilisables</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22037242</td><td></td></tr><tr><td>SK4005 zdIs5[Pmec-4GFP]</td><td>contract Driscoll lab</td><td></td><td>GFP exprimée dans les neurones tactiles chlorure</td></tr> de <tr><td>sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13422</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/4880/53</td><td></td></tr><tr><td>Tactrol 2 Autoclave</td><td>Priorclave</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Thermofisher scientific</td><td>28313</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>X-Light V2 Unité Confocale à Disque Rotatif</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZB4065 bzIs166[Pmec-4mCherry]</td><td>contrat Driscoll lab</td><td></td><td>mCherry exprimé dans les neurones tactiles</td></tr><tr><td>ZB4067 bzIs167[Pmec-4mitogfp Pmec-4mCherry4] ; igIs1[Pmec-7YFP Pmec-3htt57Q128 ::cfp lin-15+]</td><td>contrat Driscoll lab</td><td></td><td>Q128 exprimé dans les neurones tactiles</td></tr><tr><td>ZB4509 bzIs166[Pmec-4mCherry] ; bzIs168[Pmec-7LMP-1 ::GFP]</td><td>contrat Driscoll lab</td><td></td><td>mitoROGFP exprimé dans les neurones tactiles</td></tr><tr><td>ZB4528 bzIs166[Pmec-4mCherry] ; zhsEx17 [Pmec-4mitoLS ::ROGFP]</td><td>contrat Marqueur d’autophagie de laboratoire</td><td></td> Driscoll <td>exprimé dans les neurones tactiles</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

approches quantitatives pour la notation in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in c. elegans

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

La toxicité des protéines mal repliées et du dysfonctionnement mitochondrial sont des facteurs essentiels qui favorisent le déclin neuronal fonctionnel associé à l’âge et les maladies neurodégénératives entre les espèces. Bien que ces défis neurotoxiques aient longtemps été considérés comme intrinsèques aux cellules, des preuves considérables soutiennent maintenant que les protéines mal repliées sur les maladies humaines provenant d’un neurone peuvent apparaître dans les cellules voisines, un phénomène proposé pour favoriser la propagation de la pathologie dans les maladies neurodégénératives humaines.
Les neurones adultes C. elegans qui expriment les protéines agrégéssantes peuvent extruder de grandes vésicules entourées de membrane (~4 μm) qui peuvent inclure les protéines agrégées, les mitochondries et les lysosomes. Ces grands vésicules sont appelées « xopher » et sont distinctes des exosomes (qui sont environ 100x plus petits et ont une biogenèse différente). Jeter les débris cellulaires dans les exophers peut se produire par un mécanisme conservé qui constitue une branche fondamentale, mais autrefois non reconnue, de la protéostase neuronale et le contrôle de la qualité mitochondriale, pertinente aux processus par lesquels les agrégats se propagent dans les maladies neurodégénératives humaines.
Alors que les exophers ont été principalement étudiés chez les animaux qui expriment une copie élevée transgénique mCherry dans les neurones tactiles, ces protocoles sont également utiles dans l’étude de l’exophergenesis en utilisant des organites fluorescents marqués ou d’autres protéines d’intérêt dans diverses classes de neurones.
Décrit ici sont les caractéristiques physiques des exophers C. elegans, les stratégies pour leur détection, les critères d’identification, le moment optimal pour la quantitation, et les protocoles de croissance animale qui contrôlent les contraintes qui peuvent moduler les niveaux de production d’exophe. Ensemble, les détails des protocoles décrits ici devraient servir à établir une norme pour l’analyse quantitative des exophérs dans les laboratoires. Ce document vise à servir de ressource sur le terrain pour les laboratoires qui cherchent à élaborer des mécanismes moléculaires par lesquels les exopheurs sont produits et par lesquels les exopheurs sont réagis par les cellules voisines et éloignées.

Ce protocole décrit les approches de détection et de quantitation des grandes extrusions d’agrégats et/ou d’orgelles (~4 μm) produites par les cellules de C. elegans sous forme d’exophers à membrane. Nous décrivons les souches, les conditions de croissance, les critères de notation, le moment et les considérations de microscopie nécessaires pour faciliter la dissection de ce mécanisme d’expulsion des débris.

Approches quantitatives pour la notation in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Nous caractérisons les mécanismes in vivo de l’extrusion globale et organelle des neurones par l’intermédiaire d’un processus appelé exophergenèse, biologie mal comprise qui est probablement pertinente à la pathologie neurodégénérative de la maladie se propager. Ces approches sont nécessaires pour atteindre la notation reproductible des exophers neuronaux extrudés et démontrer une plate-forme pour la dissection mécaniste de l’élimination cellulaire de déchets par transfert neuronal aux cellules voisines. La définition des mécanismes in vivo de la façon dont les neurones éjectent les agrégats peut effectivement influencer la conception de nouvelles stratégies pour aider au traitement des maladies neurodégénératives humaines.Pour les conditions basales, abritez C.Elegans du même âge biologique à une température constante de 20 degrés Celsius. Pour l’imagerie vivante de la dynamique intracellulaire et des caractéristiques de l’exophergenèse, placez jusqu’à 20 animaux sur un tampon d’agaros sur une lame de microscope en verre et immobilisez les animaux. Placez soigneusement un glissement de couverture sur les vers paralysés et placez la lame sur la scène d’un microscope à fluorescence confocal.Utilisez un objectif de 10 à 40 x pour identifier le plan Z désiré à Brightfield, en prenant des notes sur le positionnement du ver, l’orientation de la queue de la tête et l’emplacement de la vulve, qui sont des repères pour l’identification neuronale et exophère ultérieure. En restant dans le même plan Z, passez à la visualisation de fluorescence à large champ à 10 à 40x pour le journaliste cytosolic choisi, et faites défiler dans l’axe Z pour observer la profondeur de l’animal et l’expression de fluorescence dans le plan focal. La tête aura un anneau nerveux fluorescent, et la queue plus pointue contiendra un à deux somas visibles de neurone latéral postérieur.Grossissement plus élevé avec une lentille 63x peut aider à identifier l’anneau nerveux, les processus neuronaux, et les corps soma. Il est d’abord utile d’identifier l’anneau nerveux situé dans la tête de l’animal et les processus neuronaux lauraux. Pour ce faire, commencez à la tête du ver et faites défiler lentement l’axe Z pour identifier le plan de l’anneau nerveux où les processus neuronaux sont fixés.Une fois que l’anneau nerveux a été identifié, dans la vue de fluorescence suivre le processus neuronal attaché latéralement dans la direction postérieure vers la vulve, où le soma sera apparent. Une fois que le corps ou le corps rond de soma sont au point, il est important d’identifier tous les neurones à proximité. Pour l’identification des neurones tactiles, trouvez d’abord l’ALML, l’ALMR et l’AVM soma, qui devraient être les signaux les plus brillants et marqués par un corps cellulaire rond à la fin du processus.Une fois que le soma neuronal le plus au point a été localisé, utilisez la cellule AVM, une cellule ventrale, pour aider à assigner l’orientation. Si le neurone AVM est dans le même plan que l’ALM, alors l’animal se repose sur le côté et le neurone latéral est l’ALMR. Si le neurone AVM n’est pas dans le même plan que l’ALM en question, le neurone tactile le plus proche du plan focal est le neurone ALML.Il est également utile d’identifier le neurone PVM, qui est un neurone tactile ventral situé près de la queue. Le plan de mise au point du PVM indiquera si le neurone tactile antérieur est l’ALML ou l’ALMR. Si l’ALM en question est dans le même plan que le PVM, alors le neurone tactile observé est le neurone ALML.Une fois que l’ALM le plus au point a été identifié et assigné, il est important de déterminer les positions des autres organismes soma près de la zone d’intérêt et dans tous les plans Z, afin de ne pas les confondre avec des exophères. Une fois que le neurone tactile d’intérêt a été localisé, l’ALMR ou ALML, inspecter le neurone pour les grands domaines d’exopher saillants, assez grand pour être considéré comme un exopher bourgeon, qui est au moins un cinquième de la taille du soma d’origine. Si aucun domaine de bourgeon ou d’exopher n’est observé, inspectez davantage le soma neuronal pour un filament mince attaché émanant du corps de soma.Les exophères attachés ont tendance à être situés plus près du soma d’origine et dans un plan Z similaire. Pour identifier un exopher inaccessible, recherchez les protéines fluorescentes expulsées concentrées, qui sont souvent plus brillantes que le soma. Bien que représenté ici, il ya un grand exopher.Il peut y avoir plus d’une entité fluorescente provenant d’un seul soma. Recherchez des exophères non attachés dans différents plans focaux et dans la région latérale éloignée d’où le soma d’origine a été trouvé. Les exophères dépassent généralement loin du soma dans une direction postérieure du processus neuronal.Vérifiez s’il y a de gros objets sphériques qui ne sont pas positionnés et identifiés comme des somas neuronaux. Bien que les exophères soient généralement des structures sphyriques, elles peuvent se dégrader au fil du temps, acquérant une forme plus irrégulière. Recherchez la présence d’événements nocturnes étoilés et, par exemple, de multiples événements exopher.Pour éviter de confondre et de sortir de l’avion soma pour un exopher, il est essentiel d’identifier tous les corps de soma à proximité, même somas hors de discussion au début de l’observation. Un soma étendu ou pointu peut être observé, mais une extension sans un site clair de constriction ne doit pas être notée comme exopher. Rejeter les petits bourgeons résolus qui n’atteignent pas un cinquième de la taille du soma dans la quantification des événements exopher.Bien que les neurites matures puissent s’étendre considérablement avec l’âge, et que les protéines fluorescentes puissent migrer vers l’extrémité distale de ces structures, ne comptez pas les excroissances neurite comme exophères. Pour identifier les entités fluorescentes qui ne sont pas des exophères, assurez-vous d’exclure toute autofluorescence, qui peut être confondue avec des débris vésiculaires nocturnes étoilés sous fluorescence à large champ. Pour exclure les signaux fluorescents embryonnaires, passez de la fluorescence à l’illumination des champs lumineux, et vérifiez l’association du signal avec les œufs dans l’utérus.Ce tableau fournit un résumé des différents neurones tactiles exprimés journalistes fluorescents qui ont été utilisés pour surveiller la production d’exophères. Les cargaisons qui sont connues pour être extrudées chez les exophères comprennent des agrégats tels que Q128, une fusion de répétitions humaines de polyglutamine élargie huntington, lysosomes GFP marqués avec la protéine membranaire associée lysosomale, et mitochondries étiquetées avec GFP matrix-localisé. Le GFP cytoplasmique n’est pas fortement expulsé, et est préférentiellement maintenu dans le soma, bien que GFP puisse être employé pour visualiser faiblement des exophers.En général, la production d’exopher par la mCherry exprimant les neurones ALMR dans des conditions basales commence le premier jour de l’âge adulte et varie d’environ cinq à 25% des ALMR examinés dans le délai principal de production d’exopher du jour adulte un à trois. Des contraintes particulières et des perturbations génétiques peuvent augmenter considérablement la production d’exopher dans les neurones ALMR. Il est crucial de localiser tous les neurones à proximité avant d’inspecter le neurone d’intérêt et les environs pour les domaines exophères, exophères intacts, ou des événements nocturnes étoilés.Lorsque vous êtes à l’aise avec l’identification manuelle des exophères, des méthodes améliorées de débit pour le dépistage à grande échelle à l’aide de l’imagerie à haute teneur peuvent être utilisées, ce qui permet l’analyse du génome entier et la dissection de l’exophergenèse mécaniste.

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