Un modèle murin d’exposition foetale à l’inflammation maternelle pour étudier les effets de la chorioamnionite aiguë sur le développement intestinal nouveau-né

Nous avons développé un modèle de chorioamnionite pour simuler l’exposition foetale à l’inflammation maternelle (FEMI) sans complications des organismes vivants pour examiner les effets de FEMI sur le développement du tractus intestinal de la progéniture. Ceci permet l’étude des causes mécanistes pour le développement des dommages intestinaux suivant chorioamnionitis.

Ce protocole FEMI permet d’étudier les effets à long terme sur les nouveau-nés suite à une exposition fœtale à l’inflammation maternelle. Ceci est particulièrement pertinent pour le développement de l’entérocolite nécrosante, ou ECN. Cette technique imite l’inflammation stérile qui est souvent observée dans la chorioamnionite, et l’absence de bactéries vivantes peut avoir des effets confondants sur le tractus intestinal en développement et le microbiome.

L’étape la plus importante de ce protocole est l’injection de LPS pour induire FEMI. Il est extrêmement important qu’une dose appropriée de LPS soit utilisée et que l’injection ne provoque pas de traumatisme intrapéritonéal chez la souris gravide. Commencez par diluer le stock LPS de un à 100 avec une solution saline stérile pour une concentration de travail de 20 microgrammes par millilitre.

Injecter les mères gestantes au jour de gestation E15. Pesez les souris immédiatement avant l’injection pour déterminer la posologie appropriée de LPS, en utilisant un volume équivalent de solution saline normale pour les animaux témoins. Vortex la solution LPS trois fois pendant 15 secondes à puissance élevée.

Ensuite, aspirez-le dans une seringue d’un millilitre. Utilisez la technique du débroussaillage pour retenir la souris enceinte et maintenez-la en position couchée dorsale. Insérez environ un quart à la moitié d’une aiguille de calibre 30 de huit millimètres biseautée vers le haut, recouvrant le quadrant inférieur droit de l’abdomen à un angle de 30 à 40 degrés.

Tirez sur le piston de la seringue pour assurer une pression négative. Procédez ensuite à l’injection si une pression négative est présente. Surveillez les souris pendant environ 30 minutes, puis remettez-les dans des cages pour le reste de la grossesse.

Accoucher des petits par voie vaginale à E20 et leur permettre de rester avec les mères, en recevant des repas à volonté. Récoltez les intestins au 14e jour postnatal. À l’aide de ciseaux et de pinces, faites une incision verticale le long de la ligne médiane de l’abdomen, à travers la peau et le péritoine, sur toute la longueur de l’abdomen.

Excisez l’intestin grêle de l’estomac vers le caecum et retirez le mésentère. Isolez le tiers distal de l’intestin grêle, en éliminant l’intestin grêle proximal, le caecum et le côlon. Divisez la portion d’iléon en deux à l’aide de ciseaux.

Placez ensuite la moitié proximale dans une solution de stabilisation de l’ARN pour la quantification de l’ARN et la moitié distale dans du formol tamponné à 10 % neutre pour la préparation des lames. Sectionnez les tissus incrustés de paraffine en tranches de cinq micromètres d’épaisseur et montez-les sur des lames de verre. Déparaffiniser les lames, puis colorer les sections avec de l’hématoxyline et de l’éosine selon les procédures standard.

Utilisez la microscopie optique pour évaluer les lésions intestinales généralisées par deux enquêteurs distincts en aveugle sur une échelle de trois points, en évaluant l’intégrité des villosités et la séparation de la membrane basale. Attribuez un score de zéro pour décrire une muqueuse normale. Attribuez un score de un pour décrire une lésion bénigne, qui comprend le développement de l’espace de Gruenhagen sous-épithélial, la vacuolisation ou le soulèvement sous-épithélial limité à la lamina propria ou aux extrémités des villosités.

Attribuez un score de deux pour décrire une blessure grave, indiquée par un soulèvement épithélial et une vacuolisation supérieure à la moitié des villosités, une distorsion des villosités ou une ulcération de la muqueuse et une désintégration de la lamina propria. Immerger les lames dans le xylène deux fois pendant 10 minutes. Rincez-les ensuite avec de l’éthanol à 100 %.

Immergez les lames pendant trois minutes dans 100 % d’éthanol, 90 % d’éthanol, 70 % d’éthanol et 50 % d’éthanol. Ensuite, lavez les lames sous l’eau courante pendant cinq minutes, en faisant face à la section à l’opposé de l’eau pour éviter la perte d’échantillon de tissu. Filtrez la solution de coloration au bleu Alcian avec un filtre à café standard et utilisez-la pour tacher les lames pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez-les à l’eau courante du robinet pendant deux minutes. Diluez un milligramme d’acide périodique dans 200 millilitres d’eau doublement distillée et immergez les lames dans cette solution pendant cinq minutes. Après un lavage d’une minute à l’eau courante, colorez les lames avec le réactif de Schiff pendant 10 minutes et lavez-les à nouveau pendant cinq minutes.

Ensuite, tachez-les avec de l’hématoxyline pendant une minute et lavez-les à l’eau pendant deux minutes. Plongez-les dans de l’alcool acide pendant une minute, puis dans l’eau du robinet de Scott pendant une minute, puis lavez-les sous l’eau courante du robinet pendant une minute. Pour déshydrater les lames, trempez chaque lame 10 fois dans de l’éthanol à 70 %, à 90 % d’éthanol, puis à 100 % d’éthanol.

Immergez les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant 10 minutes, puis immergez-les deux fois dans du xylène frais pendant trois minutes à chaque fois. Placez une goutte de support de montage sur l’échantillon et une lamelle sur le dessus. Comptez les cellules caliciformes au microscope.

Pour chaque morceau de tissu intestinal, comptez le nombre de cellules caliciformes et de 500 cellules épithéliales. Exprimez ensuite les cellules caliciformes sous la forme d’un rapport pour 100 cellules épithéliales. Comptez les cellules de Paneth.

Pour chaque morceau de tissu intestinal, notez le rapport entre les cellules de Paneth et la crypte intestinale, en comptant 100 cryptes intestinales pour chaque morceau de tissu intestinal. L’exposition fœtale à l’inflammation maternelle, ou FEMI, au 15e jour embryonnaire entraîne une perte de grossesse dose-dépendante et un taux dose-dépendant du travail prématuré. L’EMEF induit une lésion intestinale importante à la naissance et à huit semaines de vie.

Cette lésion se produit en l’absence de tout stimulus supplémentaire pour les animaux, ce qui suggère que le FEMI seul perturbe l’homéostasie normale du tractus intestinal murin du nouveau-né. Le nombre de cellules caliciformes productrices de mucine et de cellules Paneth productrices de peptides antimicrobiens dans le tiers distal du tractus intestinal grêle a été quantifié. Il a été constaté que le FEMI perturbait la composition normale de l’épithélium intestinal en induisant la perte des deux types de cellules, par rapport aux animaux sans FEMI.

Pour étudier les effets de l’EMFE sur la réponse inflammatoire néonatale, divers marqueurs inflammatoires sériques ont été quantifiés, notamment l’interleukine-1 bêta, l’interleukine-10, le KCGRO et l’interleukine-6, à partir du sérum de petits avec et sans FEMI. FEMI a significativement augmenté la cascade inflammatoire pour toutes les cytokines à P0. La cascade inflammatoire aux âges ultérieurs différait en fonction du point temporel et des cytokines. Il est intéressant de noter qu’il y avait des niveaux similaires d’IL6 aux groupes P7 à P28 dans les groupes FEMI et fictifs.

Cependant, il y avait des niveaux significativement plus élevés dans le groupe FEMI à P56, malgré l’absence d’intervention secondaire. Il est essentiel d’effectuer une courbe de dose initiale de LPS, car différents stocks de LPS peuvent avoir des puissances différentes. Nous avons constaté que nos résultats néonatals dépendent de la dose de LPS utilisée pour induire l’EMFE.