Détection de l’expression de microARN dans les reins de souris néphropathiques immunoglobulines A
8 juillet 2020
Les microARN sont impliqués dans la pathogenèse de la néphropathie à IgA. Nous avons développé une méthode fiable pour détecter les niveaux d’expression des microARN dans les reins d’un modèle murin de néphropathie à IgA (souris HIGA). Cette nouvelle méthode facilitera la vérification de l’implication des miARN dans la néphropathie à IgA.
Cette méthode peut être utilisée pour vérifier facilement le changement de microARN dans la néphropathie IGA à l’aide d’un petit modèle animal, ce qui permet d’étudier la néphropathie IGA sans biopsie rénale humaine. Le protocole peut fournir de nouvelles informations sur la génétique de la néphropathie IGA, ce qui peut potentiellement aider à la découverte de nouveaux diagnostics et de nouvelles méthodes thérapeutiques pour la maladie rénale. Après vous être assuré que la souris est correctement anesthésiée, utilisez des ciseaux chirurgicaux et des pinces pour faire une incision médiane de trois à quatre centimètres dans la paroi abdominale de la souris et identifier les deux côtés du rein.
Incisez les côtes et le diaphragme pour exposer le cœur. Après avoir incisé l’oreillette droite, injectez du PBS dans le ventricule gauche jusqu’à ce que la couleur du rein passe au jaune pâle, indiquant que tout le corps de la souris est perfusé de PBS. Coupez l’artère rénale, la veine rénale et l’uretère, puis retirez le rein.
Homogénéiser les échantillons de rein de 30 milligrammes à l’aide d’un homogénéisateur au silicium et de 700 microlitres de réactif de lyse à base de phénol guanidine à température ambiante. Transférez le lysat dans la colonne de broyage du biopolymère et centrifugez-le à 15 000 G pendant deux minutes à température ambiante. Poursuivez la purification de RBNA en suivant les instructions du manuscrit.
Après le lavage final, ajoutez 30 microlitres d’eau sans nucléase dans la colonne de spin à base de membrane de silice et centrifugez-la à 8 000 G pendant une minute pour éluer l’ARN. Pour la synthèse de l’ADNc, préparez un mélange principal avec deux microlitres de mélange d’acides nucléiques, deux microlitres de mélange de transcriptase inverse et quatre microlitres de tampon pour un total de huit microlitres par échantillon. Ajoutez huit microlitres du mélange principal dans chaque puits d’une bande de tube à huit puits.
Diluer l’ARN total dans de l’eau sans nucléases. Ensuite, ajoutez 12 microlitres de la solution d’ARN total dans chaque puits de la bandelette. Placez les échantillons dans le thermocycleur et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes, puis à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Pour effectuer une PCR quantitative en temps réel, préparez le mélange maître selon les instructions du manuscrit, puis ajoutez 22,5 microlitres du mélange maître dans chaque puits d’une plaque de réaction à 96 puits. Ajoutez 2,5 microlitres de l’ADNc préparé dans chaque puits. Placez la plaque de réaction dans l’instrument de PCR en temps réel.
Ensuite, programmez-le pour une activation initiale à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivie de 40 cycles de dénaturation à 94 degrés Celsius pendant 15 secondes, de recuit à 55 degrés Celsius pendant 30 secondes et d’extension à 70 degrés Celsius pendant 30 secondes. Quantifier l’expression des gènes à l’aide de la méthode CT delta-delta. Ce protocole a été utilisé pour étudier les niveaux d’expression des microARN dans les reins des souris HIGA en utilisant les reins des souris Balb/c comme contrôle.
Les niveaux d’expression de trois microARN associés à la néphropathie IGA ont été mesurés. Les niveaux relatifs d’expression des microARN des deux groupes ont été comparés à l’aide d’un test T, un P inférieur à 0,05 étant statistiquement significatif. miR-155-5p a été exprimé à des niveaux 3,3 fois plus élevés dans le groupe HIGA par rapport au groupe témoin, et miR-21-5p a été exprimé à des niveaux 1,58 fois plus élevés.
L’expression de miR-1461-5p ne différait pas significativement entre les deux groupes. Lors de la tentative de ce protocole, il est important de porter un masque, des gants et une casquette et de garder la table et les outils du laboratoire propres afin d’éviter que les nucléases dans l’environnement n’affectent l’expérience. Cette méthode expérimentale est actuellement utilisée dans la pratique dans notre laboratoire.
Son objectif est d’établir de nouvelles méthodes diagnostiques et thérapeutiques pour la néphropathie IGA.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode fiable pour détecter les niveaux d'expression des microARN dans les reins d'un modèle murin de néphropathie à IgA. Cette méthode permet d'étudier le rôle des microARN dans la néphropathie à IgA sans avoir besoin de biopsies rénales humaines.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Néphrologie
- Recherche sur les microARN
- Modèles animaux
Contexte
- La néphropathie à IgA est une maladie rénale caractérisée par le dépôt d’IgA dans les glomérules.
- Les microARN jouent un rôle important dans la pathogenèse de diverses maladies, notamment les troubles rénaux.
- La compréhension de l'expression des microARN peut fournir des informations sur les mécanismes des maladies.
- Les méthodes actuelles d'étude des microARN nécessitent souvent des procédures invasives.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode d'évaluation des niveaux de microARN dans un modèle murin de néphropathie à IgA.
- Faciliter la recherche sur les aspects génétiques de la néphropathie à IgA.
- Explorer des approches diagnostiques et thérapeutiques potentielles pour les maladies rénales.
Méthodes utilisées
- Utilisation de souris HIGA comme modèle pour la néphropathie à IgA.
- Administration d'anesthésie à la souris avant la chirurgie.
- Techniques chirurgicales pour accéder aux reins, incluant une incision médiane et l'ablation des organes.
- Perfusion de la souris avec du PBS en vue de l'extraction rénale.
Résultats principaux
- La méthode développée permet une vérification facile des modifications des microARN dans la néphropathie à IgA.
- Les connaissances acquises grâce à cette méthode peuvent conduire à de nouveaux outils diagnostiques.
- Potentiel de découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter la néphropathie à IgA.
- Suppression du besoin de biopsies rénales humaines dans les études préliminaires.
Conclusions
- Cette méthode améliore la compréhension du rôle des microARN dans la néphropathie à IgA.
- Elle ouvre de nouvelles voies de recherche en génétique des maladies rénales.
- Cette approche pourrait avoir un impact significatif sur les développements futurs en matière de diagnostics et de thérapeutiques.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Ce protocole permet aux équipes de recherche et développement en biopharmacie d'analyser l'expression des microARN dans un modèle murin validé de néphropathie à IgA, soutenant ainsi la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les programmes relatifs aux maladies rénales. En fournissant une méthode reproductible pour détecter des niveaux modifiés de microARN sans prélèvements biopsiques humains, il facilite la découverte précoce de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques avec une confiance prédictive améliorée. Cette approche s'inscrit dans les efforts menés en phase de découverte pour explorer les mécanismes de la maladie et hiérarchiser les candidats en vue de leur développement préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en quantifiant les variations d'expression des miARN associés à la maladie chez les souris HIGA par rapport aux témoins.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole fiable pour la validation fonctionnelle de cibles, utilisant la qRT-PCR afin de mesurer les niveaux de miR-155-5p, miR-21-5p et miR-146a-5p.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en identifiant les miARN présentant des variations d'expression statistiquement significatives (par exemple, un facteur 3,3 pour le miR-155-5p) comme biomarqueurs ou cibles potentiels.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Fournit des données quantitatives et reproductibles d'expression des miARN, adaptées à la standardisation des dosages dans les campagnes de criblage de découverte.
- Valeur opérationnelle : Met en place un protocole standardisé de purification de l'ARN et de synthèse d'ADN complémentaire compatible avec les plateformes de qRT-PCR à haut débit.
- Préparation du dosage : Génère des valeurs de CT normalisées à l'aide de la méthode delta-delta CT, permettant la comparaison entre échantillons et la confirmation des résultats positifs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur translationnelle : Utilise un modèle murin HIGA pertinent pour la maladie afin de relier les découvertes à la validation préclinique des voies médiées par les miARN.
- Dérisquage mécanistique : Permet d'évaluer les modifications de l'expression des miARN liées au dépôt d'IgA, réduisant ainsi l'ambiguïté concernant le mécanisme cible avant l'identification d'un candidat thérapeutique.
- Continuité préclinique : Soutient les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant des lectures cohérentes et quantifiables issues des tissus rénaux à travers les différents groupes d'étude.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte précoce, soutenant la vérification d'hypothèses dans la validation de cibles et générant des résultats quantitatifs pour les flux de travail de criblage et d'analyse qui éclairent les décisions d'identification de composés leaders.
- Découverte en biologie : Permet de clarifier les voies biologiques en mesurant les variations d'expression des miARN associées à la pathogenèse de la néphropathie à IgA dans un modèle murin génétique.
- Écrantage : Produit des données quantitatives normalisées sur les miARN, adaptées à l'évaluation des effets de composés sur des voies cibles dans des tests ultérieurs.
- Analyse : Génère des valeurs delta-delta CT et des mesures de variation d'expression permettant aux équipes de comparer les conditions et d'évaluer la significativité statistique à l'aide de tests T.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes sur les miARN réalisées en phase exploratoire à la continuité préclinique grâce à l'utilisation d'un modèle validé de néphropathie à IgA présentant une pertinence phénotypique.
- Réutilisation institutionnelle : Met en place un protocole réutilisable d'extraction d'ARN et de RT-qPCR applicable à plusieurs cibles de miARN dans divers projets sur les maladies rénales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce à la mesure directe de la dysrégulation des miARN dans un modèle de maladie.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité et la standardisation par des paramètres définis de purification de l'ARN, de synthèse d'ADN complémentaire et de qRT-PCR (par exemple, centrifugation à 8 000 G, incubation à 37 °C).
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en fournissant des données d'expression statistiquement significatives (p < 0,05) permettant de prioriser les cibles fortement associées à la maladie.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des biomarqueurs ou cibles thérapeutiques basés sur les miARN, fondée sur l'ampleur du changement d'expression et la reproductibilité.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie sur rongeurs, en manipulation des ARN et en qRT-PCR afin de prévenir la dégradation par les nucléases et de garantir l'intégrité des échantillons.
- Dépend de l'accès à un équipement d'homogénéisation, une centrifugeuse, un thermocycleur et un appareil de PCR en temps réel doté de détection de fluorescence.
- Implique une standardisation entre les équipes concernant la quantité d'ARN utilisée (30 mg de rein), les volumes de réactifs (700 μL de réactif de lyse) et les conditions de cyclage (activation à 95°C, 40 cycles).
- Exige l'adaptation de jeux d'amorces spécifiques aux cibles de microARN tout en maintenant des températures constantes d'hybridation (55°C) et d'élongation (70°C).
- Limité à l'analyse terminale de l'ARN ; ne fournit pas de résolution spatiale ou au niveau cellulaire unique au sein du tissu rénal sans méthodologies supplémentaires.
