Isolement des cellules CD8⁺ T résidentes du rein de souris pour l’analyse de cytométrie de flux

Les cellules CD8+T comportent des caractéristiques distinctes dans différents tissus, comme un exemple critique de tissu non muqueux et non lymphoïde. Il est essentiel de caractériser directement les cellules réniennes pour bien comprendre la biologie des cellules T. Ici nous démontrerons notre méthode commode pour isoler les cellules CD8+T réniennes-résidentes accommodant l’analyse suivante de cytométrie de flux.

Cette méthode pourrait fournir un aperçu des études des cellules CD8+T d’effecteur et de mémoire générées après des infections aussi bien que des réponses autoimmunes. La procédure sera effectuée par le Dr Chaoyu Ma, chercheur scientifique pour mon laboratoire. Commencez par diluer l’anticorps alpha biotine anti CD8 à 15 microgrammes par millilitre dans PBS, en vous assurant qu’il y a suffisamment pour administrer 200 microlitres à chaque souris.

Avant l’injection, chauffer la veine arrière de la souris avec une lampe thermique aérienne pendant cinq à dix minutes pour la dilater. Dessinez 200 microlitres du mélange d’anticorps pré dilué dans une seringue à insuline de calibre 28 et éliminez les bulles d’air en déplaçant le piston de haut en bas. Pliez l’aiguille pour créer un angle de 150 degrés entre l’aiguille et la seringue, biseauter, de sorte que l’aiguille est parallèle à la veine de la queue.

Retenez la souris avec un restrainer de rongeur et pulvérisez la queue avec 70% d’éthanol pour rendre la veine clairement visible. Tenez la queue à l’extrémité distale avec le pouce et les doigts du milieu de la main non dominante, puis placez l’index sous le site d’injection. Avec la main dominante insérer l’aiguille dans la veine en parallèle vers la direction du cœur et injecter lentement 200 microlitres de l’anticorps.

Retirer l’aiguille et compresser doucement le site d’injection jusqu’à ce que le saignement s’arrête. Après avoir euthanasié la souris, disséquez le rein avec des ciseaux et transférez-le dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre. Laissez les échantillons sur la glace jusqu’à ce qu’ils soient traités plus avant.

Préparer des assiettes de six puits avec trois millilitres de solution de digestion dans chaque puits, en utilisant un puits par souris, et les stocker sur la glace. Ajouter 300 microlitres de solution de digestion dans chaque tube d’échantillon et hacher les échantillons de rein avec un ciseaux à ressort droit. Transférer les échantillons de rein hachés dans les plaques de six puits avec la solution de digestion.

Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius avec un basculement doux pendant 45 minutes, puis homogénéiser le tissu avec la bride de piston d’une seringue de trois millilitres et le transférer dans des tubes coniques de 15 millilitres. Faites tourner les échantillons à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le supernatant et resuspendez la pastille en trois millilitres de RPMI avec 10%FCS.

Faites tourner l’échantillon à 500 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, puis retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec cinq millilitres de gradient de densité moyen et de mélange RPMI. Placez la pointe d’une pipette de trois millilitres contenant trois millilitres de gradient de densité de 67% moyenne et PBS directement au fond de chaque tube et relâchez lentement la solution de sorte que la solution lourde forme une couche distincte au fond. Faites tourner les échantillons à 900 fois g pendant 20 minutes avec des réglages réduits de l’accélérateur et des freins, puis retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse sans déranger les couches.

Retirez la couche supérieure avec une pipette de transfert sans toucher la couche de lymphocyte et transférez la couche de lymphocyte à un nouveau tube de 15 millilitres. Remplissez le tube avec PBS et 5%FCS, puis mélangez en inversant lentement le tube quatre à six fois. Après avoir centrifugé les échantillons à 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes, retirez le supernatant et réutilisez la pastille cellulaire avec 500 microlitres de milieu RPMI complet.

Les cellules sont maintenant prêtes pour la coloration de cytométrie d’écoulement. Même après l’enrichissement des lymphocytes à médiation centrifugeuse de densité, il était très courant de voir une grande partie des non-lymphocytes dans le produit final. Cependant, après avoir gagné sur les lymphocytes vivants, les lymphocytes CD8+T étaient faciles à identifier.

Comme prévu, seules les cellules CD8+T extra-vasculaires ont efficacement acquis des phénotypes de cellules T de mémoire résident tissulaire, tels que la déréglementation du CD69 et la downregulation du Ly6C. Contrairement aux souris infectées, la grande majorité des cellules CD8+T isolées de jeunes souris naïves logées dans l’installation de FPS ont été étiquetées avec un anticorps alpha CD8 et appartenaient donc au compartiment intravasculaire. Cette technique a considérablement accéléré l’étude des cellules immunitaires résidentes des tissus dans les organes densément vascularisés.