Un modèle de boucle hémodynamique in vitro pour étudier l’hémocytocompatibilité et l’activation cellulaire hôte des dispositifs médicaux vasculaires

Ce modèle de boucle hémodynamique permet aux chercheurs de tester la compatibilité in vitro de l’hémo des dispositifs vasculaires tels que les tubes de perfusion ou les enchevêtrés. dans des conditions normalisées. Ainsi, cette technique n’exerce aucun impact sur le sang par la force mécanique et évite ainsi les résultats trompeurs par l’activation intrinsèque des composants sanguins.

Avant de tenter une expérience, il faut pratiquer un assemblage de pièces mécaniques approprié, une construction parfaite du système de fermeture de boucle et une charge sanguine lente dans les boucles. Pour préparer l’assemblage de la boucle, utilisez un coupe-tube pour couper 250 centimètres de long, cinq millimètres de diamètre intérieur morceaux de tube sur une surface plane. Et branchez les terminaisons ouvertes des tubes dans un court morceau de tube de silicium raccordant le diamètre extérieur du tube d’investigation pour générer une forme de boucle.

Serrez soigneusement la vis de verrouillage du connecteur de bande de tension et ajustez la force de fermeture de sorte qu’il n’y ait pas d’espace entre les deux flexions. Si la vis de verrouillage est complètement resserrée et que la tension de la bande de polycarbonate semble trop faible pour combler l’écart entre les deux flexions, ouvrez le système de verrouillage et coupez quelques millimètres de la bande de tension. Pour préparer un assemblage de boucle stent, ouvrez deux des boucles et sortez le tube du système de bande de tension.

Insérez ensuite le stent au milieu du tube selon les instructions du fabricant. Lorsque le nombre approprié de boucles pour l’expérience ont été générés sécuriser les boucles dans le berceau de boucle de l’unité de rotation, en dehors d’un bain d’eau de 37 degrés et attacher le berceau de boucle à l’unité de rotation à l’intérieur du bain d’eau. Ensuite, remplissez une seringue de 10 millilitres pour chaque deux boucles de sang à recueillir avec 150 microlitres ou solution fraîchement préparée de stock d’héparine et utilisez un papillon de calibre 21 pour recueillir doucement le sang dans les seringues, en prenant soin d’éviter l’homolyse ou l’activation cellulaire due à un vide excessif.

Lorsque tout le sang a été recueilli transférer le sang à un bécher en verre et utiliser une pipette sérologique de cinq millilitres, pour mélanger doucement le sang et l’héparine. Lorsqu’une solution homogène a été obtenue avec la pointe pipette pas complètement insérée dans le tube, remplissez soigneusement chaque boucle de cinq millilitres de sang. Fermez chaque boucle une fois qu’elle a été remplie et confirmez que la boucle, la bande de tension et le rack sont correctement fixés.

Faites ensuite pivoter les boucles pendant trois heures à 30 révolutions par minute. À la fin de la rotation, laissez les boucles rester dans la grille pendant deux minutes pour laisser le sang s’accumuler au fond de la boucle avant d’ouvrir soigneusement les connecteurs et de tirer le sang des doublons en beakers en verre de 10 millilitres individuels. Lorsque tout le sang a été recueilli rincer chaque tube avec 10 millilitres de PBS et utiliser un scalpel pour couper soigneusement un échantillon d’un centimètre de l’extrémité de chaque tube.

Incuber les échantillons pendant la nuit dans 2% de glutaraldehyde à quatre degrés Celsius, suivi d’une incubation de 15 minutes et 1% de tétoxyde d’osmium à température ambiante. À la fin de l’incubation du tétoxyde d’osmium, déshydrater les échantillons dans une série ascendante d’éthanol pendant 20 minutes par concentration, suivi d’une déshydratation de 30 minutes dans 100% d’éthanol. À la fin de l’incubation 100% éthanol, laissez sécher les échantillons pendant la nuit à température ambiante avant d’imaginer les échantillons en scannant la microscopie électronique à une tension d’accélération de cinq kilovolts, à l’aide d’un micro scanner à rayons X.

Pour l’analyse cytométrique de flux des échantillons de sang. Transférez 100 microlitres de sang de chaque échantillon dans chacun des neuf tubes FACS de cinq millilitres et fixez les échantillons avec l’ajout de 100 microlitres de formaldéhyde de 4 % par tube pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Après lavage, suspendez chaque granulé dans un millilitre de tampon de lyse de globule rouge par tube, pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, laver les échantillons par centrifugation dans un millilitre de PBS par tube et placer les échantillons sans leurs surnatants sur la glace. Pour préparer une seule tache perles de compensation ajouter quatre gouttes de perles positives et quatre gouttes de perles négatives à des volumes individuels d’un millilitre de tampon FACS, et vortex les solutions pour obtenir des suspensions de perles homogènes. Ajouter 100 microlitres de chaque solution à chacun des tubes FACS de quatre ou cinq millilitres étiquetés comme indiqué et laver les perles avec un millilitre de tampon FACS par tube.

Ajouter ensuite 100 microlitres du cocktail d’anticorps vortex approprié à chaque expérimental et fluorescence moins un tube avec mélange doux. Pendant 30 minutes d’incubation à température ambiante, à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les échantillons avec un millilitre de tampon FACS frais par échantillon et réutilisez les granulés dans 250 microlitres de tampon FACS par tube.

Avant d’analyser les perles sur les échantillons de cellules par cytométrie d’écoulement, selon les protocoles standard. Les distributions de cellules sanguines peuvent être visualisées sur toute la surface de deux bloops épissés par micro CT et la numérisation de l’imagerie au microscope électronique alors qu’aucun caillot n’est observé en boucle fermée sans lacunes. L’analyse du nombre entier de cellules sanguines, ne montre pas de différences significatives dans les nombres d’érythrocytes entre l’une des conditions testées, le nombre de plaquettes et de leucocytes cependant, sont considérablement réduits dans le groupe de boucle de latex et les nombres libres d’hémoglobine sont considérablement augmentés, indiquant une biocompatibilité très pauvre du latex.

Tandis que tous les dispositifs vasculaires examinés induisent une activation accrue du système de coagulation et du composant de compliment. Les boucles de PVC enduites d’héparine présentent une tendance à la diminution des niveaux des deux types d’activations par rapport aux boucles en PVC recouvertes de polymère. Les boucles de latex présentent les niveaux les plus élevés d’élastase TNF IL-6 et PMN, mettant en évidence l’activation puissante des leucocytes par latex.

Les plaquettes positives CD41 récupérées dans les tubes de latex présentent une intensité médiane de fluorescence excessivement élevée pour le CD62P, tandis que l’expression intégrée est considérablement réduite sur les granulocytes et les lymphocytes. D’intérêt, les niveaux intégraux sont plus élevés dans les monocytes des tubes de latex, suggérant des interactions activées de plaquette de monocyte. En effet, la coloration des agrégats de plaquettes monocytes révèle une tendance accrue à l’agrégation dans les boucles en latex et en stent.

Malgré la fréquence réduite des monocytes dans les boucles de latex. Pour éviter l’activation intrinsèque des composants sanguins, il est important d’assurer une fermeture de boucle appropriée et de manipuler le sang avec soin. Ainsi, à la suite de cette procédure, il est possible d’analyser l’interaction entre les protéines allogéniques ou TRUCKs et les composants sanguins qui sont utilisés dans l’inflammation ou la recherche pharmaceutique.