Manipulation de cellules souches neurales et de neurones dans les tranches de cerveau à l’aide de microinjection robotique

Cette technique permet d’examiner de plus près les cellules individuelles dans les tissus vivants. En traquant et en manipulant des cellules individuelles, nous pouvons mieux comprendre la formation des tissus pendant le développement. La démonstration visuelle de cette méthode permet aux utilisateurs potentiels de décider si cette technique pourrait être utile pour leur travail.

En outre, il permet aux utilisateurs de voir comment l’application est gérée, ce qui serait difficile à saisir à partir du texte seul. Ce protocole peut être appliqué à tous les tissus dont la surface est évaluable. Nous avons ciblé différentes cellules dans les mêmes tissus, différents tissus dans la même espèce, et aussi différentes espèces.

Lorsque vous essayez ce protocole, il est important de rester concentré et de travailler rapidement. Tout l’équipement doit être préparé avant de commencer la dissection. Commencez par installer le logiciel d’auto-injecteur et en tirant les pipettes de microinjection des capillaires en verre borosilicate avec le puller micropipette.

Conserver les pipettes jusqu’à trois jours à l’abri de la poussière. Faire fondre 3% de large gamme d’agarose à l’aide d’un four à micro-ondes. Ne laissez pas l’agarose se solidifier en la gardant dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius.

Décongelez un aliquot un SCM et réchauffez 10 à 12 millilitres SIM et 20 millilitres de la solution de Tyrode à 37 degrés Celsius à l’aide d’un bain d’eau. Mélanger le traceur fluorescent avec les autres produits chimiques à injecter, puis centrifuger la solution de microinjection à 16 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Recueillir le supernatant et le transférer dans un nouveau tube.

Conserver la solution de microinjection sur la glace jusqu’à utilisation. Utilisez les têtes des embryons de souris E13.5 à E16.5 pour préparer des tranches de tissu organotypique du télencéphale. Enlever la peau et ouvrir le crâne avec des forceps se déplaçant le long de la ligne médiane.

Disséquer le cerveau embryonnaire du crâne ouvert et enlever les méninges qui recouvrent le tissu cérébral à partir du côté ventral du cerveau. Laissez tout le cerveau disséqué dans la solution de Tyrode sur le bloc chauffant de 37 degrés Celsius. Verser l’agarose fondue large gamme dans un moule d’intégration jetable.

Lorsqu’il refroidit à 38 à 39 degrés Celsius, transférez soigneusement jusqu’à quatre cerveaux dans l’agarose à l’aide d’une pipette Pasteur. Remuer l’agarose autour du tissu à l’aide d’une spatule ou d’une paire de forceps Dumont numéro un sans toucher le tissu. Laisser l’agarose se solidifier à température ambiante.

Une fois que l’agarose s’est solidifiée, coupez l’excès entourant le tissu. Remplissez le plateau tampon de PBS. Orientez le cerveau avec l’axe caudal rostral du tissu perpendiculaire au plateau et coupez 250 tranches de micromètre à l’aide d’un vibratome.

Remplir une boîte de Pétri de 3,5 centimètres de deux millilitres de supports préchauffés, puis utiliser une pipette Pasteur en plastique pour transférer 10 à 15 tranches dans ce plat. Une fois terminé, transférer la boîte de Pétri avec les tranches dans l’incubateur de culture de tranche. Maintenir les tranches à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée.

Allumez l’ordinateur, le microscope, la caméra microscope, les manipulateurs, la plate-forme de pression et le capteur de pression. Chargez l’application en cliquant sur le fichier, lancez l’application.py dans le dossier principal téléchargé à partir de GitHub et spécifiez les paramètres de l’appareil dans l’écran popup.

Pour éviter l’engorgement indésirable, créez une pression extérieure avant de submerger la pipette dans la solution. Faites glisser la barre de pression de compensation à 24 à 45 % et cliquez sur les valeurs définies. Ensuite, réglez la pression en tournant le bouton de soupape de pression mécanique à un à deux PSI comme indiqué par le capteur de pression.

Transférer les tranches au centre d’une boîte de Pétri de 3,5 centimètres contenant deux millilitres de SIM préchauffé, puis placer la boîte de Petri sur le stade de microinjection qui a été préchauffé à 37 degrés Celsius. Chargez la pipette de microinjection avec 1,4 à 1,6 microlitres de solution de microinjection à l’aide d’une pipette en plastique à longue pointe et insérez la pipette de microinjection dans le support de pipette. En utilisant le grossissement le plus bas sur le microscope, mettre la tranche au point et guider la micropipette vers ce champ de vision afin qu’elle soit concentrée sur le même plan que la cible de tranche.

Passez la sortie du microscope à la caméra pour voir le FOV et l’application. Cliquez sur le bouton grossissement en haut à gauche de l’interface pour lancer l’étalonnage de l’appareil. Lorsqu’une fenêtre invite à sélectionner le grossissement, sélectionnez le 10X et appuyez sur OK. Le logiciel suppose que l’objectif interne est 10X.

Recentrer la pointe pipette à l’aide de la roue micrométrique du microscope et cliquez sur la pointe pipette avec le curseur. Ensuite, appuyez sur le bouton étape 1.1 et appuyez sur OK dans la fenêtre popup. La pipette se déplacera dans la direction y.

Cliquez sur le bout de la pipette et appuyez sur le bouton étape 1.2. Enfin, entrez 45 dans la boîte d’angle pipette et appuyez sur l’angle défini. Entrez les paramètres souhaités dans le panneau de contrôle de microinjection automatisé et réglez la vitesse à 100% Une fois terminé, cliquez sur les valeurs définies.

Cliquez sur le bouton de bord de tirage et faites glisser le curseur le long de la trajectoire désirée dans la fenêtre popup pour définir la trajectoire de l’injection. Pour les neurones microinjecteurs, ciblez le côté basal du télencéphale. Apportez la pipette au début de la ligne et cliquez sur sa pointe, puis cliquez sur la trajectoire de course pour commencer le microinjection.

Répétez cette étape pour chaque plan d’injection ciblé. Immerger les tranches dans le mélange de collagène, puis transférer les tranches avec 200 à 300 microlitres de collagène dans un puits de 14 millimètres d’un plat de fond en verre de 35 millimètres. Assurez-vous que les tranches sont couvertes de la moindre quantité de collagène possible, ce qui est la condition optimale pour les nutriments et l’absorption d’oxygène.

Orienter les tranches à l’aide de deux paires de forceps et incuber la boîte de Pétri pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius sur un bloc chauffant pour permettre au collagène de se solidifier. Déplacez la boîte de Pétri dans l’incubateur de culture de tranches pendant 40 minutes supplémentaires, puis ajoutez deux millilitres de MCS préchauffé. À la fin de la culture, sortir les tranches de l’incubateur de culture tranche et aspirer le SCM.

Laver les tranches incorporées de collagène avec du PBS, puis ajouter 4% de paraformaldéhyde et laisser le tissu à température ambiante pendant 30 minutes. Déplacez-le à quatre degrés Celsius pour la fixation pendant la nuit. Le lendemain, aspirer la solution de paraformaldéhyde et laver les tranches avec du PBS.

Retirer les tranches du collagène à l’aide de deux paires de forceps au microscope stéréo. Utilisez un four à micro-ondes pour faire fondre le point de fusion de 3 % bas surgi, puis versez-le dans un moule d’intégration jetable et laissez-le refroidir à environ 38 ou 39 degrés Celsius. Transférer les tranches de tissu dans ce moule en s’assurant que le côté peler de la tranche est orienté vers le haut, puis laisser l’agarose refroidir à température ambiante et solidifier.

Couper l’agarose supplémentaire entourant les tranches. Orientez le bloc d’agarose pour vous assurer que la surface coupée est parallèle à la lame de coupe du vibratome et coupez 50 sections micromètres d’épaisseur. Remplissez un plat de 24 puits de PBS et transférez les sections dans ce plat à l’aide d’un pinceau à pointe fine, puis effectuez l’immunofluorescence selon les protocoles standard.

Des images représentatives des cellules progénitrices injectées avec succès et des neurones nouveau-nés sont montrées ici. Lorsqu’elles sont injectées avec Dextran Alexa 488, les cellules semblent complètement remplies de colorant. La microinjection automatisée peut fournir un débit significativement plus élevé par rapport à la microinjection manuelle.

En outre, l’étiquetage EDU confirme que la viabilité cellulaire n’est pas affectée par l’automatisation. Le maintien de la tranche organotypique en culture permet de suivre la progression de la lignée des cellules microinjectées. La microinjection en cellules souches neurales simples fournit une excellente résolution cellulaire unique.

Par conséquent, il a été utilisé pour disséquer la biologie cellulaire de la progression des cellules souches neurales et la transition du destin. Ce protocole a été utilisé pour étudier le couplage jonctionnel dans les neurones nouveau-nés en injectant lucifer jaune avec Dextran A555. Une proportion de neurones pyramidaux nouveau-nés ont été couplés par des jonctions d’écart aux neurones voisins, ce qui est compatible avec l’idée que les neurones immatures communiquent par jonction d’écart.

Nous avons utilisé cette technique pour étudier la biologie cellulaire du développement du cerveau et de l’évolution du cerveau. Nous avons étudié plusieurs gènes candidats qui affectaient le comportement des cellules souches neurales et nous avons pu découvrir et comprendre comment ils fonctionnent, comment ils affectent la progression de la lignée des cellules souches neurales, et la production de neurones pendant le développement du cerveau.