Un modèle biomimétique pour le cancer du foie pour étudier les interactions tumeur-stroma dans un environnement 3D avec tunable propriétés bio-physiques

Ce protocole présente un modèle biomimétique 3D avec compartiment stromal fibrotique d’accompagnement. Préparé avec des hydrogels physiologiquement pertinents dans des rapports imitant les propriétés biophysiques de la matrice extracellulaire stromal, un médiateur actif des interactions cellulaires, de la croissance tumorale et de la métastase.

Ce modèle récapitule à la fois les microenvironnements pré-malins et tumoraux en incorporant des hydrogels physiologiquement pertinents avec une rigidité réglable et des lignées cellulaires hépatocellulaires et associées au stroma. Ce modèle est modulaire et rentable, peut être préparé avec de l’équipement de base et des matériaux facilement disponibles et peut être utilisé pour étudier des interactions complexes tumeur-stroma. Ce modèle d’interaction tumeur-stroma peut donner un aperçu de l’hépatocarcinogenèse.

Et c’est très important à la fois pour une perspective mécaniste et une perspective de traitement. Jenny Rosenquist, doctorante du laboratoire Angstrom, fera la démonstration de la procédure avec Carlemi Calitz. Pour préparer 10 millilitres d’une solution mère de fibrinogène de 80 milligrammes par millilitre, ajoutez d’abord 2,21 grammes de chlorure de calcium et cinq milligrammes d’aprotinine à des volumes individuels de 20 millilitres d’eau distillée.

Ajoutez ensuite 2,051 millilitres de la solution mère d’aprotinine et 100 microlitres de la solution mère de chlorure de calcium à 7,849 millilitres de PBS. Ensuite, ajoutez progressivement 800 milligrammes de fibrinogène et 200 milligrammes de chlorure de sodium à la solution sans remuer ni secouer et placez le tube de solution mère de fibrinogène horizontalement sur un agitateur. Après deux à cinq heures d’agitation à 300 tours par minute, filtrez la solution obtenue pour éliminer les grumeaux qui se sont formés pendant la préparation.

Pour le revêtement de collagène des inserts de culture cellulaire, dans une armoire de biosécurité, utilisez une pince à épiler stérilisée pour inverser les inserts sur le couvercle de la plaque de culture cellulaire. Ensuite, mélangez 115 microlitres d’acide acétique glacial avec 25 millilitres d’eau distillée avant d’ajuster la solution avec de l’eau distillée supplémentaire jusqu’à un volume final de 100 millilitres avant de filtrer. Pour préparer deux millilitres d’une solution de collagène de 100 microgrammes par millilitre, ajoutez 40 microlitres d’une solution de collagène de cinq milligrammes par millilitre à 1,9 millilitre de la solution mère d’acide acétique glacial de 20 millimolaires.

Ajoutez 100 microlitres de la solution de collagène obtenue au fond de chaque insert. Lorsque les inserts ont séché, placez une entretoise imprimée en 3D personnalisée sur les inserts. Après deux à trois heures de séchage à l’air, lavez les inserts en les plaçant brièvement, couche de collagène vers le bas, dans des puits individuels d’une plaque de 12 puits contenant un millilitre de PBS frais par puits et par lavage.

Après le dernier lavage, replacez les inserts sur le couvercle de la plaque pour une à deux heures de séchage à l’air. Couvrez ensuite les inserts inversés avec le bas de la plaque et placez les inserts dans l’incubateur de culture cellulaire. Avant d’ensemencer les cellules, ajoutez 3,99 grammes d’hydroxyde de sodium à 100 millilitres d’eau distillée et filtrez la solution à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre.

Ensuite, lavez deux fois les cultures de cellules de stellate hépatique et de carcinome hépatique T175 avec 10 millilitres de PBS par lavage avant de traiter les cellules avec six millilitres de trypsine pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules se sont détachées, inactivez les enzymes avec six millilitres de DMEM à 37 degrés Celsius 10 % et transférez chaque culture cellulaire dans des tubes individuels de 15 millilitres. Sédimenter les cellules par centrifugation.

Et remettez les granulés en suspension dans cinq millilitres de 10 % de DMEM préchauffé par tube. Après le comptage, diluez les deux populations cellulaires à 10 à la sixième cellules par millilitre de concentrations moyennes et collectez les cellules par centrifugation. Après avoir éliminé les surnageants, ajoutez le volume approprié de DMEM 10 % préchauffé dans les cellules comme indiqué dans le tableau et neutralisez le volume approprié de collagène à quatre degrés Celsius avec 10 microlitres par millilitre d’hydroxyde de sodium à quatre degrés Celsius.

Ajoutez le collagène neutralisé réfrigéré à la suspension cellulaire. Le milieu deviendra jaune. Après avoir soigneusement mélangé la suspension avec une pointe de pipette coupée, le support deviendra rose vif.

Ajoutez le volume approprié de fibrinogène à 37 degrés Celsius comme indiqué dans le tableau et utilisez une pointe de pipette coupée pour bien mélanger la suspension. Après le mélange, ajoutez 0,1 kilo d’unités internationales de thrombine pour 10 milligrammes de fibrinogène dans chaque tube et utilisez une pointe de pipette modifiée de 200 microlitres pour ajouter 200 microlitres de suspension cellulaire au fond de chaque insert. Laissez les gels se réticuler pendant 15 minutes à température ambiante avant de placer doucement la partie inférieure de la plaque sur les gels, puis placez les inserts dans l’incubateur pour une réticulation supplémentaire à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes.

À la fin de l’incubation, placez les inserts dans des puits individuels d’une plaque à 12 puits et ajoutez deux millilitres de DMEM 10 % préchauffé dans chaque puits. Pour l’ensemencement des cellules endothéliales sur les inserts, laver une culture de cellules endothéliales vasculaires humaines T175 avec 10 millilitres de PBS avant de détacher les cellules avec de la trypsine à 37 degrés Celsius comme démontré. Remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu de croissance endothéliale pour le comptage et remettez les cellules en suspension à 10 à quatre cellules par millilitre de concentration de milieu de croissance endothéliale.

Ajoutez ensuite 500 microlitres de cellules en haut de chaque insert et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 21 jours. Pour mesurer les modules de stockage des formations de gel, utilisez un rhéomètre 60 minutes après l’ensemencement pour effectuer des balayages de fréquence de 0,1 à 20 Hertz à 0,26 % et 37 degrés Celsius avec une force axiale constante de 0,1 Newtons à l’aide d’une plaque parallèle de huit millimètres de diamètre avec une géométrie en acier inoxydable. Dans cette analyse représentative, 10 formulations des combinaisons d’hydrogels de fibrinogène et de collagène ont été préparées pour déterminer quelles formulations pouvaient imiter une rigidité hépatique similaire à celle observée lors du développement d’un carcinome hépatocellulaire.

Le module de stockage de chaque concentration a ensuite été déterminé à l’aide d’un rhéomètre. Parmi ces 10 formules, les deux milligrammes par millilitre de collagène de type 1 à 10 milligrammes par millilitre de fibrinogène, ce qui correspond aux valeurs de rigidité hépatique au début de la fibrose, deux milligrammes par millilitre de collagène de type 1 à 30 milligrammes par millilitre de fibrinogène, ce qui correspond à la cirrhose et deux milligrammes par millilitre de collagène de type 1 et 40 milligrammes par millilitre de fibrinogène qui correspond au carcinome hépatocellulaire ont été sélectionnés. L’analyse d’AlamarBlue a montré une réduction globale de la viabilité cellulaire au sein des co-cultures 2D, qui est plus faible que prévu sur la base des valeurs de concentration inhibitrice connues signalées par rapport à un témoin non traité.

Dans le modèle 3D, cependant, une augmentation de la résistance à la doxorubicine a été observée. Assurez-vous d’agir rapidement lors de l’ensemencement de la suspension cellulaire d’hydrogels sur les inserts, car un flux de travail rationalisé est essentiel au succès du protocole. L’optimisation des techniques d’isolement de l’ARN et des protéines permettra d’étudier davantage les interactions tumeur-stroma au niveau transcriptionnel et translationnel.