Surveillance en temps réel de l’activation de l’aurora kinase A à l’aide de biocapteurs FRET conformationnels dans des cellules vivantes

Cette méthode peut être utilisée pour détecter l’activation de la kinase A Aurora, de manière rapide et robuste à l’aide de biocapteurs fluorescents, en s’appuyant sur les principes de la FRET. En mesurant l’efficacité de la FRET de manière rapide et en ligne, nous pouvons déterminer instantanément si la kinase A d’Aurora s’active ou non. L’appareil FRET-FLIM est relativement facile à monter et peut être utilisé sur n’importe quel microscope à film blanc doté d’un port latéral libre.

Après avoir sélectionné une paire FRET acceptée par le donneur dans la base de données des protéines fluorescentes, dans le menu des outils, sélectionnez la visionneuse de spectres, cliquez sur fermer pour contourner la fenêtre de bienvenue et entrez le nom de la paire de force florale à visualiser dans la boîte de recherche. Pour simuler les propriétés de la paire donneur, accepteur avec une source lumineuse spécifique, sélectionnez un laser donné et cliquez sur normaliser l’émission à celle-ci. Pour ajuster les spectres de force de la flore à la longueur d’onde souhaitée.

Le lendemain de la synchronisation, remplacez le Supernat sans cortisol par du PBS stérile préchauffé et lavez les cellules en les berçant doucement deux fois à température ambiante. Après le deuxième lavage, nourrissez la culture avec un milieu d’imagerie stérile préchauffé et placez rapidement les cellules dans la chambre thermostatique du microscope. Pour l’acquisition FLET-FLIM, allumez le laser, la caméra, la configuration du microscope et le logiciel d’imagerie.

Sélectionnez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées pour le quatre floral donneur et réglez le temps d’exposition dans le logiciel d’imagerie. Avant de lancer les acquisitions FLET-FLIM, vérifiez la formation du fuseau bipolaire dans les cellules au microscope à l’aide d’une source de lumière externe. Lorsque le fuseau est apparu, sélectionnez au moins un objectif 63 fois et localisez une cellule en métaphase.

Ajustez les coordonnées X, Y Z pour placer la cellule au centre du champ de vision et sélectionnez un seul plan Z dans lequel le fuseau mitotique est plus visible ou plus intense. Démarrez ensuite l’enregistrement. La majorité des configurations commerciales disponibles génèrent à la fois une micrographie de fluorescence et une carte de durée de vie pixel par pixel.

Enregistrez les deux images. Pour calculer les valeurs de durée de vie Delta pour la paire d’accepteurs donneurs, sélectionnez la région d’intérêt, correspondant à des sous-régions spécifiques avant d’extraire les valeurs de durée de vie, à partir de la carte de durée de vie pixel par pixel entière. Calculez ensuite la durée de vie moyenne des cellules exprimant le vecteur donneur uniquement, pour obtenir la durée de vie moyenne du donneur.

Pour la comparaison des valeurs FLIM, soustrayez chaque valeur de durée de vie indépendante calculée de la durée de vie moyenne du donneur pour chaque cellule dans chacune des conditions expérimentales analysées, afin d’obtenir la valeur de durée de vie Delta pour chaque condition. Les valeurs de durée de vie Delta pour le donneur seul, les constructions traitées par inhibiteur de biocapteur kinase et inhibiteur pharmacologique par exemple, peuvent ensuite être comparées. Après avoir synchronisé les cellules dans G2M et les avoir libérées dans la mitose, la durée de vie de toutes les constructions transfectées au niveau du fuseau mitotique peut être mesurée.

Comme prévu, dans cette analyse, les valeurs de durée de vie de GFP-AURAKA et d’AURAKA-mTurquoise2 étaient proches de zéro. Indiquant que les valeurs mesurées pour ces constructions fluctuaient autour de la valeur moyenne. À l’inverse, les valeurs Delta à vie pour GFP AURAKA-mCherry étaient statistiquement différentes de la condition donneuse seule.

La valeur de durée de vie Delta augmentant d’environ 130 picosecondes. Des observations similaires ont été faites pour shadowG-AURAKA-mTurquoise2, et pour super YFP-AURAKA-mTurquoise2. Les valeurs de durée de vie Delta augmentant respectivement d’environ 150 et 220 picosecondes par rapport à la condition donneuse seule.

Dans cette analyse, les valeurs de Delta Lifetime dans les cellules, exprimant les constructions du donneur uniquement autour de zéro, semblent être pseudo-colorées en jaune. Alors que des différences plus significatives sont observées sous la forme d’un signal pseudo coloré rouge violet dans les cellules exprimant l’un ou l’autre biocapteur. Cet effet a également été observé lorsque le biocapteur GFP-AURAKA-mCherry a été traité avec un inhibiteur pharmacologique.

Dans les constructions avec des biocapteurs morts en kinase, les valeurs de durée de vie Delta étaient significativement plus élevées, par rapport à la condition du donneur seul. Mais sont également nettement inférieurs à leurs homologues normaux. Assurez-vous que la variabilité de la condition du donneur uniquement fluctue autour de sa valeur principale, et que la valeur est significativement différente de la durée de vie des constructions du biocapteur.

Comme les biocapteurs AURORA-kinase A fonctionnent bien avec les accepteurs sombres, on peut envisager de le coupler à un second biocapteur pour suivre son activité enzymatique vers un substrat.