Name: Un pipeline bioinformatique pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression génique à l’aide de l’ARN-seq (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Découvrez un pipeline bioinformatique pour analyser l'évolution moléculaire et l'expression génique par ARN-seq chez Hydra vulgaris. Cette méthode permet d'étudier les gènes opsines et leur rôle dans la détection de la lumière.

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Nous remercions Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad et Aline G. Rangel pour leurs conseils et leurs conseils dans l’intégration de certaines de ces étapes dans notre flux de travail. Nous sommes également reconnaissants à Katherine Williams, Elisabeth Rebboah et Natasha Picciani pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par une bourse de recherche médicale de la Fondation George E. Hewitt à A.M.M.

Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de l’UC Irvine.
1. Préparation de la bibliothèque RNA-seq
<ol><li>Isolez l’ARN à l’aide des méthodes suivantes.<ol>
<li>Prélever des échantillons. Si l’ARN doit être extrait ultérieurement, congeler instantanément l’échantillon ou le placer dans une solution de stockage d’ARN15 (Table des matériaux).</li>
		<li>Euthanasier et disséquer l’organisme pour séparer les tissus d’intérêt.</li>
		<li>Extraire l’ARN total à l’aide d’un kit d’extraction et purifier l’ARN à l’aide d’un kit de purificationde l’ARN( Table des matériaux ) REMARQUE: Il existe des protocoles et des kits qui peuvent mieux fonctionner pour différentes espèces et types de tissus16,17. Nous avons extrait l’ARN de différents tissus corporels d’un papillon18 et d’un Hydra gélatineux 19 (voir discussion).</li>
		<li>Mesurer la concentration et la qualité de l’ARN de chaque échantillon(Table des matériaux). Utilisez des échantillons dont le nombre d’intégrité de l’ARN (NRI) est supérieur à 8, idéalement plus près de9 20 pour construire des bibliothèques d’ADNc.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construisez la bibliothèque et la séquence d’ADNc comme suit.<ol>
<li>Construisez des bibliothèques d’ADNc selon le manuel d’instructions de préparation de la bibliothèque (voir discussion).</li>
		<li>Déterminer la concentration et la qualité del’ADNc (Table des matières).</li>
		<li>Multiplexez les bibliothèques et séquencez-les.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Accéder à un cluster d’ordinateurs
REMARQUE: L’analyse de l’ARN-seq nécessite la manipulation de fichiers volumineux et est mieux effectuée sur un cluster informatique(table des matériaux).
<ol><li>Connectez-vous au compte de cluster d’ordinateurs à l’aide de la commande ssh username@clusterlocation sur une fenêtre d’application de terminal (Mac) ou PuTTY (Windows).</li>
</ol>3. Obtenir des lectures RNA-seq
<ol><li>Obtenir des lectures d’ARN-seq à partir de l’installation de séquençage ou, pour les données générées dans une publication, à partir du dépôt de données où elles ont été déposées (3.2 ou 3.3).</li>
	<li>Pour télécharger des données à partir de référentiels tels que ArrayExpress, procédez comme suit :<ol>
<li>Effectuez une recherche sur le site à l’aide du numéro d’adhésion.</li>
		<li>Recherchez le lien pour télécharger les données, puis cliquez avec le bouton gauche de la souris et sélectionnez Copier le lien.</li>
		<li>Dans la fenêtre du terminal, tapez wget et sélectionnez Coller le lien pour copier les données dans le répertoire à des fins d’analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour télécharger les données NCBI Short Read Archive (SRA), procédez comme suit :<ol>
<li>Sur le terminal, téléchargez SRA Toolkit v. 2.8.1 en utilisant wget. Remarque : téléchargement et l’installation de programmes sur le cluster d’ordinateurs peut nécessiter un accès root, contactez l’administrateur de cluster de votre ordinateur si l’installation échoue.</li>
		<li>Terminez l’installation du programme en tapant tar -xvf $TARGZFILE.</li>
		<li>Recherchez dans NCBI le numéro d’accession SRA pour les échantillons que vous souhaitez télécharger, il devrait avoir le format SRRXXXXXX.</li>
		<li>Obtenez les données RNA-seq en tapant [sratoolkit location]/bin/prefetch SRRXXXXXX dans la fenêtre du terminal.</li>
		<li>Pour les fichiers appariés, tapez [emplacement du sratoolkit]/bin/fastq-dump --split-files SRRXXXXXX pour obtenir deux fichiers fastq (SRRXXXXXX_1.FASTQ et SRRXXXXXX_2.FASTQ). REMARQUE: Pour faire un assemblage Trinity de novo, utilisez la commande [sratoolkit location]/bin/fastq-dump --defline-seq '@$sn[_$rn]/$ri' --split-files SRRXXXXXX
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Trim adaptateurs et lectures de faible qualité (facultatif)
<ol><li>Installez ou chargez Trimmomatic21 v. 0.35 sur le cluster informatique.</li>
	<li>Dans le répertoire où se trouvent les fichiers de données RNA-seq, tapez une commande qui inclut l’emplacement du fichier jar trimmomatic, les fichiers FASTQ d’entrée, les fichiers FASTQ de sortie et des paramètres facultatifs tels que la longueur et la qualité de lecture. Remarque : la commande varie en fonction de la qualité brute et souhaitée et la longueur des lectures. Pour illumina 43 bp lit avec les amorces Nextera, nous avons utilisé: java -jar / data / apps / trimmomatic / 0.35 / trimmomatic-0.35.jar PE $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ paired_READ1. FASTQ unpaired_READ1. FASTQ paired_READ2. FASTQ unpaired_READ2. FASTQ ILLUMINACLIP:adapters.fa:2:30:10 LEADING:20 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:17 MINLEN:30.
</li>
</ol>5. Obtenir l’assemblage de référence
<ol><li>Recherchez sur Google, EnsemblGenomes et NCBI Genomes and Nucleotide TSA (Transcriptome Shotgun Assembly) un génome de référence ou un transcriptome assemblé pour l’espèce d’intérêt(Figure 1). REMARQUE : Si un génome de référence ou un transcriptome n’est pas disponible ou de mauvaise qualité, passez à l’ÉTAPE 6 pour générer un assemblage de novo.</li>
	<li>S’il existe un génome de référence ou un transcriptome assemblé, téléchargez-le sous forme de fichier fasta où l’analyse sera effectuée en suivant les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Trouvez le lien pour télécharger le génome, cliquez avec le bouton gauche de la souris et copiez le lien.</li>
		<li>Dans la fenêtre du terminal, tapez wget et collez l’adresse du lien. Si disponible, copiez également le fichier GTF et le fichier FASTA des protéines pour le génome de référence.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Générer un assemblage de novo (alternative à l’étape 5)
<ol><li>Combinez les fichiers fastq RNA-seq READ1 et READ2 pour tous les échantillons en tapant cat *READ1. FASTQ > $all_READ1. FASTQ et cat *READ2. FASTQ > all_READ2. FASTQ dans la fenêtre du terminal.</li>
	<li>Installez ou chargez Trinity22 v.2.8.5 sur le cluster informatique.</li>
	<li>Générer et assemblage en tapant sur le terminal : Trinity --seqType fq --max_memory 20G --left $all_READ1. FASTQ --droite $all_READ2. FASTQ.
</li>
</ol>7. Lecture de la carte au génome (7.1) ou au transcriptome de novo (7.2)
<ol><li>La carte se lit sur le génome de référence en utilisant STAR23 v. 2.6.0c et RSEM24 v. 1.3.0.<ol>
<li>Installez ou chargez STAR v. 2.6.0c. et RSEM v. 1.3.0 au cluster informatique.</li>
		<li>Indexer le génome en tapant rsem-prepare-reference --gtf $GENOME. GTF --star -p 16 $GENOME. FASTA $OUTPUT.
</li>
		<li>Mappez l’expression et calculez l’expression pour chaque exemple en tapant rsem-calculate-expression -p 16 --star --paired-end $READ 1. FASTQ $READ 2. FASTQ $INDEX $OUTPUT.
</li>
		<li>Renommez le fichier de résultats en quelque chose de descriptif à l’aide de mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
</li>
		<li>Générez une matrice de tous les nombres en tapant rsem-generate-data-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cartographier l’ARN-seq à l’assemblage de novo Trinity à l’aide de RSEM et de nœud papillon.<ol>
<li>Installez ou chargez Trinity22 v.2.8.5, Bowtie25 v. 1.0.0 et RSEM v. 1.3.0.</li>
		<li>Mappez l’expression de lecture et de calcul pour chaque échantillon en tapant [trinity_location]/align_and_estimate_abundance.pl --prep-reference --transcripts $TRINITY. FASTA --seqType fq --left $READ 1. FASTQ --droite $READ 2. FASTQ --est_method RSEM --nœud papillon aln_method --trinity_mode --output_dir $OUTPUT.
</li>
		<li>Renommez le fichier de résultats en quelque chose de descriptif à l’aide de mv RSEM.genes.results $sample.genes.results.
</li>
		<li>Générez une matrice de tous les nombres en tapant [trinity_location]/abundance_estimates_to_matrix.pl --est_method RSEM *[gènes/isoformes].results
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Identifier les gènes d’intérêt
REMARQUE: Les étapes suivantes peuvent être effectuées avec des fichiers FASTA nucléotidiques ou protéiques, mais fonctionnent mieux et sont plus simples avec des séquences de protéines. BLAST recherche en utilisant des protéines à des protéines est plus susceptible de donner des résultats lors de la recherche entre différentes espèces.
<ol><li>Pour un génome de référence, utilisez le fichier FASTA de protéines de STEP 5.2.2 ou consultez Documents supplémentaires pour générer un GTF de caractéristique de gène personnalisé.</li>
	<li>Pour un transcriptome de novo, générez une protéine FASTA à l’aide de TransDecoder.<ol>
<li>Installez ou chargez TransDecoder v. 5.5.0 sur l’ordinateur cluser.</li>
		<li>Trouvez le cadre de lecture ouvert le plus long et la séquence peptidique prédite en tapant [Emplacement du transdécodeur]/TransDecoder.LongOrfs -t $TRINITY. FASTA.
</li>
	</ol></li>
	<li>Recherchez dans NCBI Genbank des homologues sur des espèces étroitement apparentées.<ol>
<li>Ouvrez une fenêtre de navigateur Internet et accédez à https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.</li>
		<li>Dans la barre de recherche, tapez le nom du gène d’intérêt et le nom des espèces étroitement apparentées qui ont été séquencées ou un genre ou un embranchement. Sur la gauche de la barre de recherche, sélectionnez protéine, puis cliquez sur Rechercher.</li>
		<li>Extrayez les séquences en cliquant sur Envoyer à, puis sélectionnez Fichier. Sous Format, sélectionnez FASTA, puis cliquez sur Créer un fichier.
</li>
		<li>Déplacez le fichier FASTA des homologues vers le cluster d’ordinateurs en tapant scp $FASTA username@clusterlocation:/$DIR dans une fenêtre de terminal local ou utilisez FileZilla pour transférer des fichiers vers et depuis l’ordinateur et le cluster.</li>
	</ol></li>
	<li>Recherchez des gènes candidats à l’aide de BLAST+26.<ol>
<li>Installez ou chargez BLAST+ v. 2.8.1 sur le cluster d’ordinateurs.</li>
		<li>Sur le cluster informatique, faites une base de données BLAST à partir du génome ou du transcriptome traduit la protéine FASTA en tapant [emplacement BLAST+]/makeblastdb -in $PEP. FASTA -dbtype prot -out $OUTPUT
</li>
		<li>BLAST les séquences de gènes homologues de NCBI à la base de données de l’espèce d’intérêt en tapant [emplacement BLAST+]/blastp -db $DATABASE -query $FASTA -evalue 1e-10 -outfmt 6 -max_target_seqs 1 -out $OUTPUT.</li>
		<li>Affichez le fichier de sortie à l’aide de la commande plus. Copiez les ID de gènes uniques de l’espèce d’intérêt dans un nouveau fichier texte.</li>
		<li>Extraire les séquences des gènes candidats en tapant perl -ne 'if(/^>(\S+)/){$c=$i{$1}}$c?print:chomp;$i{$_}=1 if @ARGV' $gene_id.txt $PEP. FASTA > $OUTPUT.
</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmez l’annotation des gènes à l’aide de BLAST réciproque.<ol>
<li>Sur le navigateur Internet, accédez à https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.</li>
		<li>Sélectionnez tblastn, puis collez les séquences candidates, sélectionnez la base de données des séquences de protéines non redondantes et cliquez sur BLAST.</li>
	</ol></li>
	<li>Identifier d’autres gènes en annotant tous les gènes du génome ou du transcriptome avec des termes d’ontologie de gènes (GO) (voir discussion).<ol>
<li>Transférez la protéine FASTA sur l’ordinateur local.</li>
		<li>Téléchargez et installez Blast2GO27,28,29 v. 5.2 sur l’ordinateur local.</li>
		<li>Ouvrez Blast2GO, cliquez sur Fichier, allez dans Charger, allez dans Charger les séquences, cliquez sur Charger le fichier Fasta (fasta). Sélectionnez le fichier FASTA et cliquez sur Charger.</li>
		<li>Cliquez sur Blast, choisissez NCBI Blast, puis cliquez sur Suivant. Modifiez les paramètres ou cliquez sur Suivant, modifiez les paramètres et cliquez sur Exécuter pour trouver la description de gène la plus similaire.</li>
		<li>Cliquez sur mappage, puis cliquez sur Exécuter pour rechercher des annotations d’ontologie génétique pour des protéines similaires.</li>
		<li>Cliquez ensuite sur interpro, sélectionnez EMBL-EBI InterPro, puis cliquez sur Suivant. Modifiez les paramètres ou cliquez sur Suivant, puis sur Exécuter pour rechercher les signatures de familles de gènes et de domaines connus.</li>
		<li>Exportez les annotations en cliquant sur Fichier, sélectionnez Exporter, cliquez sur Exporter la table. Cliquez sur Parcourir, nommez le fichier, cliquez sur Enregistrer, cliquez sur Exporter.</li>
		<li>Recherchez dans le tableau d’annotation les termes d’intérêt go pour identifier d’autres gènes candidats. Extraire les séquences du fichier FASTA (STEP 8.4.5)</li>
	</ol></li>
</ol>9. Arbres phylogénétiques
<ol><li>Téléchargez et installez MEGA30 v. 7.0.26 sur votre ordinateur local.</li>
	<li>Ouvrez MEGA, cliquez sur Aligner, cliquez sur Modifier / Construire l’alignement, sélectionnez Créer un nouvel alignement cliquez sur OK, sélectionnez Protéine.</li>
	<li>Lorsque la fenêtre d’alignement s’ouvre, cliquez sur Modifier, cliquez sur Insérer des séquences à partir du fichier et sélectionnez le FASTA avec des séquences de protéines de gènes candidats et des homologues probables.</li>
	<li>Sélectionnez toutes les séquences. Trouvez le symbole du bras et survolez-le. Il devrait dire Aligner les séquences en utilisant l’algorithme MUSCLE31. Cliquez sur le symbole du bras, puis sur Aligner la protéine pour aligner les séquences. Modifiez les paramètres ou cliquez sur OK pour les aligner à l’aide des paramètres par défaut.</li>
	<li>Inspectez visuellement et apportez les modifications manuelles, puis enregistrez et fermez la fenêtre d’alignement.</li>
	<li>Dans la fenêtre principale de MEGA, cliquez sur Modèles, cliquez sur Trouver les meilleurs modèles d’ADN / protéines (ML),sélectionnez le fichier d’alignement et sélectionnez les paramètres correspondants tels que: Analyse: Sélection du modèle (ML), Arbre à utiliser: Automatique (arbre voisin), Méthode statistique: Maximum de vraisemblance, Type de substitution: Acide aminé, Traitement des données gap / manquantes: Utiliser tous les sites, Filtre de site de succursale: Aucun.
</li>
	<li>Une fois le meilleur modèle pour les données déterminé, accédez à la fenêtre MEGA principale. Cliquez sur Phylogénie, puis sur Contruct/Test Maximum Likelihood Tree (Arbre de vraisemblance de contruct/test), puis sélectionnez l’alignement, si nécessaire. Sélectionnez les paramètres appropriés pour l’arbre: Méthode statistique: Maximum de vraisemblance, Test de phylogénie: Méthode Bootstrap avec 100 répétitions, type de substitution: acide aminé, modèle: LG avec Freqs. (+F), taux parmi les sites : gamma distribué (G) avec 5 catégories gamma discrètes, traitement des données manquantes:utiliser tous les sites, méthode heuristique ML : Échange du plus proche voisin (NNI).
</li>
</ol>10. Visualiser l’expression des gènes à l’aide de TPM
<ol><li>Pour Trinity, sur le cluster d’ordinateurs, accédez au répertoire où abundance_estimates_to_matrix.pl a été exécuté et l’une des sorties doit être matrice. TPM.not_cross_norm. Transférez ce fichier sur votre ordinateur local. Remarque : voir documents supplémentaires pour la normalisation des échantillons croisés.</li>
	<li>Pour les MTP d’une analyse génomique, suivez les étapes ci-dessous.<ol>
<li>Sur le cluster d’ordinateurs, accédez à l’emplacement d’installation RSEM. Copiez rsem-generate-data-matrix en tapant scp rsem-generate-data-matrix rsem-generate-TPM-matrix. Utilisez nano pour modifier le nouveau fichier et changer « mon $offsite = 4 » de 4 à 5 pour TPM, il devrait maintenant lire « mon $offsite = 5 ».</li>
	</ol>
</li>
	<li>Accédez au répertoire où se trouvent les fichiers de sortie RSEM .genes.results et utilisez maintenant rsem-generate-TPM-matrix *[genes/isoforms.results] > $OUTPUT pour générer une matrice TPM. Transférer les résultats vers un ordinateur local.</li>
	<li>Visualisez les résultats dans ggplot2.<ol>
<li>Téléchargez R v. 4.0.0 et RStudio v. 1.2.1335 sur un ordinateur local.</li>
		<li>Ouvrez RStudio à droite de l’écran, accédez à l’onglet Packages et cliquez sur Installer. Tapez ggplot2 et cliquez sur installer.</li>
		<li>Dans la fenêtre de script R, lisez dans la table TPM en tapant data<-read.table(« $tpm.txt »,header = T)
</li>
		<li>Pour les graphiques à barres similaires à la figure 4, tapez quelque chose de similaire à : p<- ggplot() + geom_bar(aes(y=TPM, x=Symbol, fill=Tissue), data=data, stat="identity ») fill<-c(« #d7191c »,"#fdae61 », « #ffffbf », « #abd9e9 », « #2c7bb6 ») p<-p+scale_fill_manual(values=fill) p + thème(axis.text.x = element_text(angle = 90))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le but de ce protocole est de fournir un aperçu des étapes pour caractériser une famille de gènes en utilisant des données RNA-seq. Il a été prouvé que ces méthodes fonctionnent pour une variété d’espèces et d’ensembles de données4,34,35. Le pipeline établi ici a été simplifié et devrait être assez facile à suivre par un novice en bioinformatique. L’importance du protocole est qu’il décrit toutes les étapes et les programmes néc...

Les progrès des technologies de séquençage ont facilité le séquençage des génomes et des transcriptomes d’organismes non modèles. En plus de la faisabilité accrue du séquençage de l’ADN et de l’ARN de nombreux organismes, une abondance de données est accessible au public pour étudier les gènes d’intérêt. Le but de ce protocole est de fournir des étapes bioinformatiques pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans l’organisme d’intérêt.
L’étude de l’évolution d’un gène ou d’une famille de gènes peut donner un aperçu de l’évolution des systèmes biologiques. Les membres d’une famille de gènes sont généralement déterminés en identifiant des motifs conservés ou des séquences de gènes homologues. L’évolution de la famille de gènes a été précédemment étudiée à l’aide de génomes provenant d’organismes modèles lointainement apparentés1. Une limite à cette approche est qu’il n’est pas clair comment ces familles de gènes évoluent chez des espèces étroitement apparentées et le rôle des différentes pressions sélectives environnementales. Dans ce protocole, nous incluons une recherche d’homologues chez des espèces étroitement apparentées. En générant une phylogénie au niveau de l’embranchement, nous pouvons noter des tendances dans l’évolution de la famille de gènes tels que celle des gènes conservés ou des duplications spécifiques à la lignée. À ce niveau, nous pouvons également étudier si les gènes sont des orthologues ou des paralogues. Bien que de nombreux homologues fonctionnent probablement de manière similaire les uns aux autres, ce n’est pas nécessairement le cas2. L’incorporation d’arbres phylogénétiques dans ces études est importante pour déterminer si ces gènes homologues sont des orthologues ou non. Chez les eucaryotes, de nombreux orthologues conservent des fonctions similaires au sein de la cellule, comme en témoigne la capacité des protéines de mammifères à restaurer la fonction des orthologues de levure3. Cependant, il existe des cas où un gène non orthologue effectue une fonction caractérisée4.
Les arbres phylogénétiques commencent à délimiter les relations entre les gènes et les espèces, mais la fonction ne peut pas être attribuée uniquement en fonction des relations génétiques. Les études d’expression génique combinées aux annotations fonctionnelles et à l’analyse de l’enrichissement fournissent un solide soutien à la fonction des gènes. Les cas où l’expression des gènes peut être quantifiée et comparée entre les individus ou les types de tissus peuvent être plus révélateurs de la fonction potentielle. Le protocole suivant suit les méthodes utilisées dans l’étude des gènes de l’opsine dans Hydra vulgaris7, mais ils peuvent être appliqués à n’importe quelle espèce et n’importe quelle famille de gènes. Les résultats de ces études fournissent une base pour une étude plus approfondie de la fonction des gènes et des réseaux de gènes dans les organismes non modèles. A titre d’exemple, l’étude de la phylogénie des opsines, qui sont des protéines qui initient la cascade de phototransduction, donne un contexte à l’évolution de la détection des yeux et de la lumière8,9,10,11. Dans ce cas, des organismes non modèles en particulier des espèces animales basales telles que les cnidaires ou les cténophores peuvent élucider la conservation ou les changements dans la cascade de phototransduction et la vision à travers les clades12,13,14. De même, la détermination de la phylogénie, de l’expression et des réseaux d’autres familles de gènes nous renseignera sur les mécanismes moléculaires sous-jacents aux adaptations.

<table><tbody><tr><td>Kit Bioanalyseur-ADN</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td>Matériel de laboratoire humide</td></tr><tr><td>Kit Bioanalyseur-ARN</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td>Matériel de laboratoire humide</td></tr><tr><td>BLAST+ v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs* https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td></tr> <tr><td>Blast2GO (sur votre PC)</td><td></td><td></td><td>Sur l’ordinateur local https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td></tr><tr><td>boost v. 1.57.0</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs</td></tr><tr><td>Bowtie v. 1.0.0</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td></tr> <tr><td>cluster de calcul (fortement recommandé)</td><td></td><td></td><td>REMARQUE : Il est préférable d’effectuer les analyses des données génomiques sur un cluster de calcul haute performance car les fichiers sont très volumineux.</td></tr><tr><td>Boutons de manchette v. 2.2.1</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs</td></tr><tr><td>edgeR v. 3.26.8 (dans R)</td><td></td><td></td><td>Dans Rstudio https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td></tr><tr><td>gcc v. 6.4.0</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs</td></tr><tr><td>Java v. 11.0.2</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs</td></tr><tr><td>MEGA7 (sur votre PC)</td><td></td><td></td><td>Sur l’ordinateur local https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MEGAX v. 0.1</td><td></td><td></td><td>Sur l’ordinateur local https://www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.5</td><td>matériel de laboratoire humide</td></tr><tr><td>perl 5.30.3</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs</td></tr><tr><td>python</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 2.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32866</td><td>Matériaux de laboratoire humide</td></tr><tr><td>R v.4.0.0</td><td></td><td></td><td>Sur grappe d’ordinateurs https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td></tr> <tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7021</td><td>matériaux de laboratoire humide</td></tr><tr><td>RNeasy kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>matériaux de laboratoire humide</td></tr><tr><td>RSEM v. 1.3.0</td><td></td><td></td><td>Logiciel informatique https://deweylab.github.io/RSEM/</td></tr><tr><td>RStudio v. 1.2.1335</td><td></td><td></td><td>Sur l’ordinateur local https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td></tr><tr><td>Samtools v. 1.3</td><td></td><td></td><td>Logiciel</td></tr><tr><td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td></tr><tr><td>STAR v. 2.6.0c</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs https://github.com/alexdobin/STAR</td></tr><tr><td>StringTie v. 1.3.4d</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td></tr> <tr><td>Transdecoder v. 5.5.0</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td></tr><tr><td>Trimmomatic v. 0.35</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Trinity v.2.8.5</td><td></td><td></td><td>Sur le cluster d’ordinateurs https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>matériaux de laboratoire humide</td></tr><tr><td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>matériaux de laboratoire humide</td></tr><tr><td>TURBO DNA-free Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1907</td><td>matériaux</td></tr> <tr><td></td><td>de laboratoire humide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>*Les téléchargements et l’installation sur le cluster d’ordinateurs peuvent nécessiter un accès root. Contactez votre administrateur réseau.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un pipeline bioinformatique pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression génique à l’aide de l’arn-seq

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Distiller et signaler de grands ensembles de données, tels que des données sur le génome entier ou le transcriptome, est souvent une tâche ardue. Une façon de décomposer les résultats est de se concentrer sur une ou plusieurs familles de gènes qui sont importantes pour l’organisme et l’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes bioinformatiques pour générer une phylogénie et quantifier l’expression des gènes d’intérêt. Les arbres phylogénétiques peuvent donner un aperçu de l’évolution des gènes au sein des espèces et entre elles, ainsi que révéler l’orthologie. Ces résultats peuvent être améliorés en utilisant des données RNA-seq pour comparer l’expression de ces gènes dans différents individus ou tissus. Les études de l’évolution et de l’expression moléculaires peuvent révéler des modes d’évolution et de conservation de la fonction des gènes entre les espèces. La caractérisation d’une famille de gènes peut servir de tremplin pour de futures études et peut mettre en évidence une famille de gènes importante dans un nouveau génome ou un nouvel article de transcriptome.

Les méthodes ci-dessus sont résumées à la figure 1 et ont été appliquées à un ensemble de données de tissus vulgaris Hydra. H. vulgaris est un invertébré d’eau douce qui appartient à l’embranchement Cnidaria qui comprend également des coraux, des méduses et des anémones de mer. H. vulgaris peut se reproduire de manière asexuée par bourgeonnement et ils peuvent régénérer leur tête et leur pied lorsqu’ils sont coupés en deux. Dans cette étude, nous avons che...

Le but de ce protocole est d’étudier l’évolution et l’expression des gènes candidats à l’aide de données de séquençage de l’ARN.

Un pipeline bioinformatique pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression génique à l’aide de l’ARN-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Ce protocole décrit les étapes bioinformatiques pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression des gènes candidats. Ici, nous fournissons des instructions détaillées afin que toute personne ayant une expérience bioinformatique minimale puisse passer par ce protocole. Ce pipeline peut être appliqué à n’importe quel organisme et à n’importe quelle famille de gènes.Un problème courant lors de la bioinformatique est l’échec des scripts shell. Lorsque vous tentez ce protocole, assurez-vous de disposer du logiciel le plus à jour, lisez les fichiers d’erreur et consultez attentivement le manuel. Pour commencer, connectez-vous au compte de cluster d’ordinateurs sur un terminal ou une fenêtre d’application PuTTY.Sur le terminal, téléchargez SRA Toolkit version 2.8.1 à l’aide de Wget, puis terminez l’installation du programme. Recherchez dans NCBI le numéro d’accession SRA pour les échantillons souhaités, puis obtenez les données de séquence d’ARN dans la fenêtre terminale. Obtenez deux fichiers FASTQ pour le type de fichiers d’extrémité appariée.Trouvez le génome de référence en ligne s’il en existe un. Pour obtenir un assembly de référence, tapez wget dans la fenêtre du terminal et collez l’adresse du lien. Si disponible, copiez également le fichier GTF et le fichier FASTA des protéines pour le génome de référence.Indexez le génome, puis cartographiez les lectures et calculez l’expression pour chaque échantillon. Renommez le fichier de résultats en quelque chose de descriptif et générez une matrice de tous les nombres. Ouvrez une fenêtre de navigateur Internet et accédez à NCBI GenBank.Dans la barre de recherche, tapez le nom du gène d’intérêt et le nom des espèces étroitement apparentées qui ont été séquencées. À gauche de la barre de recherche, sélectionnez Protéine, puis cliquez sur Rechercher. Extrayez les séquences en cliquant sur Envoyer à, puis sélectionnez Fichier.Sous Format, sélectionnez FASTA, puis cliquez sur Créer un fichier. Déplacez le fichier FASTA d’homologues vers le cluster d’ordinateurs à l’aide d’une fenêtre de terminal local ou de FileZilla. Ensuite, recherchez des gènes candidats à l’aide de BLAST+Sur le cluster informatique, faites une base de données BLAST à partir du génome ou de la protéine traduite par transcriptome, FASTA.BLAST les séquences de gènes homologues de NCBI à la base de données de l’espèce d’intérêt, puis afficher le fichier de sortie à l’aide de la commande plus. Copiez les ID de gènes uniques de l’espèce d’intérêt dans un nouveau fichier texte. Extraire les séquences des gènes candidats.Pour confirmer l’annotation des gènes à l’aide de BLAST réciproque, accédez à l’outil de recherche d’alignement local BLAST, sélectionnez BLASTP, puis collez les séquences candidates, sélectionnez la base de données des séquences de protéines non redondantes, puis cliquez sur BLAST. Ouvrez MEGA, cliquez sur Aligner, puis modifier l’alignement de la build, sélectionnez Créer un nouvel alignement, puis cliquez sur OK. Sélectionnez Protéine. Lorsque la fenêtre Alignement s’ouvre, cliquez sur Modifier.Cliquez sur Insérer des séquences à partir du fichier et sélectionnez le FASTA avec des séquences protéiques de gènes candidats et d’homologues probables. Sélectionnez Toutes les séquences. Trouvez le symbole du bras et survolez-le.Il devrait dire aligner les séquences en utilisant l’algorithme musculaire. Cliquez sur le symbole de bras, puis cliquez sur Aligner la protéine pour aligner les séquences Modifier les paramètres ou cliquez sur OK pour utiliser les paramètres par défaut. Ce protocole a été appliqué aux tissus d’Hydra vulgaris qui est un invertébré d’eau douce qui appartient à l’embranchement Cnidaria.Les gènes de l’opsine ont été étudiés pour mieux comprendre l’évolution de la détection des yeux et de la lumière chez les animaux. Des séquences pour des gènes liés à l’opsine de H.vulgaris et d’autres espèces ont été extraites dans un fichier FASTA de la GenBank NCBI. Les gènes de l’opsine ont été alignés dans MEGA, ce qui a permis d’identifier les opsines Hydra qui manquaient un acide aminé conservé de lysine nécessaire pour lier une molécule sensible à la lumière.Un arbre à maximum de vraisemblance a été généré à l’aide de séquences d’opsine d’Hydra vulgaris et d’autres espèces. La phylogénie suggère que les gènes de l’opsine évoluent par duplications spécifiques à la lignée chez les cnidaires, et potentiellement par duplication en tandem chez H.vulgaris. Ensuite, une analyse d’expression différentielle a été réalisée dans edgeR pour étudier l’expression absolue des gènes de l’opsine.Pour déterminer si un ou plusieurs opsines sont up-réglés dans l’hypostome, ou la tête, des comparaisons paire-sages de hypostome contre la colonne de corps, la zone bourgeonnante, le pied, et les tentacules ont été exécutées. On l’a constaté que 1, 774 transcriptions ont été différentiellement exprimées entre le hypostome et la colonne de corps. Les gènes qui ont été régulés à la hausse à travers de multiples comparaisons ont été déterminés, et un enrichissement fonctionnel dans Blast2GO a été effectué.Enfin, l’expression absolue des gènes de l’opsine a été étudiée dans différents tissus au cours de différentes étapes du bourgeonnement et de différents points de régénération. L’inspection visuelle de l’alignement et de l’arbre confirmera si les gènes candidats appartiennent à la famille d’intérêt. Les gènes qui sont trop différents dans l’ordre ou un groupe en dehors de tout le reste, font probablement partie d’une famille de gènes différente.Les résultats de ce protocole peuvent être considérés comme générateurs d’hypothèses. Ce pipeline peut mettre en évidence des gènes candidats à étudier fonctionnellement dans de futures études. Après avoir exploré l’expression de l’opsine Hydra, nous utilisons maintenant des techniques similaires pour étudier les gènes apparentés entre les espèces afin d’identifier les similitudes et les différences de fonction.

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