Un pipeline bioinformatique pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression génique à l’aide de l’ARN-seq
28 mai 2021
Le but de ce protocole est d’étudier l’évolution et l’expression des gènes candidats à l’aide de données de séquençage de l’ARN.
Ce protocole décrit les étapes bioinformatiques pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression des gènes candidats. Ici, nous fournissons des instructions détaillées afin que toute personne ayant une expérience bioinformatique minimale puisse passer par ce protocole. Ce pipeline peut être appliqué à n’importe quel organisme et à n’importe quelle famille de gènes.
Un problème courant lors de la bioinformatique est l’échec des scripts shell. Lorsque vous tentez ce protocole, assurez-vous de disposer du logiciel le plus à jour, lisez les fichiers d’erreur et consultez attentivement le manuel. Pour commencer, connectez-vous au compte de cluster d’ordinateurs sur un terminal ou une fenêtre d’application PuTTY.
Sur le terminal, téléchargez SRA Toolkit version 2.8.1 à l’aide de Wget, puis terminez l’installation du programme. Recherchez dans NCBI le numéro d’accession SRA pour les échantillons souhaités, puis obtenez les données de séquence d’ARN dans la fenêtre terminale. Obtenez deux fichiers FASTQ pour le type de fichiers d’extrémité appariée.
Trouvez le génome de référence en ligne s’il en existe un. Pour obtenir un assembly de référence, tapez wget dans la fenêtre du terminal et collez l’adresse du lien. Si disponible, copiez également le fichier GTF et le fichier FASTA des protéines pour le génome de référence.
Indexez le génome, puis cartographiez les lectures et calculez l’expression pour chaque échantillon. Renommez le fichier de résultats en quelque chose de descriptif et générez une matrice de tous les nombres. Ouvrez une fenêtre de navigateur Internet et accédez à NCBI GenBank.
Dans la barre de recherche, tapez le nom du gène d’intérêt et le nom des espèces étroitement apparentées qui ont été séquencées. À gauche de la barre de recherche, sélectionnez Protéine, puis cliquez sur Rechercher. Extrayez les séquences en cliquant sur Envoyer à, puis sélectionnez Fichier.
Sous Format, sélectionnez FASTA, puis cliquez sur Créer un fichier. Déplacez le fichier FASTA d’homologues vers le cluster d’ordinateurs à l’aide d’une fenêtre de terminal local ou de FileZilla. Ensuite, recherchez des gènes candidats à l’aide de BLAST+Sur le cluster informatique, faites une base de données BLAST à partir du génome ou de la protéine traduite par transcriptome, FASTA.
BLAST les séquences de gènes homologues de NCBI à la base de données de l’espèce d’intérêt, puis afficher le fichier de sortie à l’aide de la commande plus. Copiez les ID de gènes uniques de l’espèce d’intérêt dans un nouveau fichier texte. Extraire les séquences des gènes candidats.
Pour confirmer l’annotation des gènes à l’aide de BLAST réciproque, accédez à l’outil de recherche d’alignement local BLAST, sélectionnez BLASTP, puis collez les séquences candidates, sélectionnez la base de données des séquences de protéines non redondantes, puis cliquez sur BLAST. Ouvrez MEGA, cliquez sur Aligner, puis modifier l’alignement de la build, sélectionnez Créer un nouvel alignement, puis cliquez sur OK. Sélectionnez Protéine. Lorsque la fenêtre Alignement s’ouvre, cliquez sur Modifier.
Cliquez sur Insérer des séquences à partir du fichier et sélectionnez le FASTA avec des séquences protéiques de gènes candidats et d’homologues probables. Sélectionnez Toutes les séquences. Trouvez le symbole du bras et survolez-le.
Il devrait dire aligner les séquences en utilisant l’algorithme musculaire. Cliquez sur le symbole de bras, puis cliquez sur Aligner la protéine pour aligner les séquences Modifier les paramètres ou cliquez sur OK pour utiliser les paramètres par défaut. Ce protocole a été appliqué aux tissus d’Hydra vulgaris qui est un invertébré d’eau douce qui appartient à l’embranchement Cnidaria.
Les gènes de l’opsine ont été étudiés pour mieux comprendre l’évolution de la détection des yeux et de la lumière chez les animaux. Des séquences pour des gènes liés à l’opsine de H.vulgaris et d’autres espèces ont été extraites dans un fichier FASTA de la GenBank NCBI. Les gènes de l’opsine ont été alignés dans MEGA, ce qui a permis d’identifier les opsines Hydra qui manquaient un acide aminé conservé de lysine nécessaire pour lier une molécule sensible à la lumière.
Un arbre à maximum de vraisemblance a été généré à l’aide de séquences d’opsine d’Hydra vulgaris et d’autres espèces. La phylogénie suggère que les gènes de l’opsine évoluent par duplications spécifiques à la lignée chez les cnidaires, et potentiellement par duplication en tandem chez H.vulgaris. Ensuite, une analyse d’expression différentielle a été réalisée dans edgeR pour étudier l’expression absolue des gènes de l’opsine.
Pour déterminer si un ou plusieurs opsines sont up-réglés dans l’hypostome, ou la tête, des comparaisons paire-sages de hypostome contre la colonne de corps, la zone bourgeonnante, le pied, et les tentacules ont été exécutées. On l’a constaté que 1, 774 transcriptions ont été différentiellement exprimées entre le hypostome et la colonne de corps. Les gènes qui ont été régulés à la hausse à travers de multiples comparaisons ont été déterminés, et un enrichissement fonctionnel dans Blast2GO a été effectué.
Enfin, l’expression absolue des gènes de l’opsine a été étudiée dans différents tissus au cours de différentes étapes du bourgeonnement et de différents points de régénération. L’inspection visuelle de l’alignement et de l’arbre confirmera si les gènes candidats appartiennent à la famille d’intérêt. Les gènes qui sont trop différents dans l’ordre ou un groupe en dehors de tout le reste, font probablement partie d’une famille de gènes différente.
Les résultats de ce protocole peuvent être considérés comme générateurs d’hypothèses. Ce pipeline peut mettre en évidence des gènes candidats à étudier fonctionnellement dans de futures études. Après avoir exploré l’expression de l’opsine Hydra, nous utilisons maintenant des techniques similaires pour étudier les gènes apparentés entre les espèces afin d’identifier les similitudes et les différences de fonction.
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Aperçu
Ce protocole étudie l'évolution moléculaire et l'expression de gènes candidats en utilisant des données de séquençage ARN, en se concentrant spécifiquement sur les gènes d'opsine chez Hydra vulgaris. L'étude présente un pipeline bioinformatique applicable à divers organismes.
Composants clés de l'étude
Domaine de recherche
- Analyse de l'expression génique
- Évolution moléculaire
- Bioinformatique
Contexte
- Étudie les gènes candidats liés à la détection de la lumière et à l'évolution des yeux
- Utilise l'invertébré d'eau douce Hydra vulgaris
- Recourt aux ressources du NCBI pour la récupération de données de séquences
Méthodes utilisées
- Pipeline bioinformatique pour le séquençage ARN
- Hydra vulgaris comme système biologique
- Outils tels que BLAST, MEGA et edgeR pour l'analyse
Résultats principaux
- Identification de gènes d'opsines évoluant par duplications spécifiques aux lignées chez les Cnidaires
- Découverte d'une expression différentielle de 1 774 transcrits dans différentes parties du corps
- Construction d'un arbre phylogénétique par maximum de vraisemblance des séquences d'opsines
Conclusions
- Le protocole met en évidence le potentiel des gènes candidats pour des études fonctionnelles futures
- Permet de progresser dans la compréhension de l'évolution et de l'expression des gènes en lien avec la biologie sensorielle
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce pipeline de bioinformatique permet une étude systématique de l'évolution et de l'expression des familles de gènes, en appuyant la validation des cibles grâce à une dé-risquisation mécanistique lors de la phase initiale de découverte. En intégrant l'analyse phylogénétique à la quantification par RNA-séq, il offre une confiance prédictive pour hiérarchiser les gènes candidats possédant des fonctions conservées ou divergentes entre les espèces. Cette approche facilite le tri du portefeuille en identifiant des hypothèses fondées sur des mécanismes avant d'allouer des ressources à des études fonctionnelles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Interroge les hypothèses thérapeutiques en clarifiant l'orthologie des gènes et les relations évolutives au sein des familles cibles.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle des cibles grâce à un profilage comparatif de l'expression dans les tissus et les stades de développement.
- Valeur prédictive : Facilite l'identification des candidats thérapeutiques en mettant en évidence les gènes présentant des expansions spécifiques à une lignée et des profils d'expression enrichis dans certains tissus.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des jeux de gènes validés pour des criblages ultérieurs en confirmant l'appartenance à la famille par alignement de séquences et topologie de l'arbre phylogénétique.
- Valeur opérationnelle : Génère des matrices de comptage standardisées à partir de données RNA-seq, permettant des sorties quantitatives reproductibles prêtes à être utilisées dans des tests.
- Extensibilité : Facilite la réutilisation de la plateforme chez différents organismes en appliquant des protocoles cohérents de BLAST, d'alignement et d'analyse phylogénétique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie les données d'expression de la phase de découverte aux modèles précliniques en identifiant des profils d'expression conservés dans les tissus pertinents.
- Alignement des biomarqueurs : Facilite la découverte de biomarqueurs translationnels par l'analyse différentielle d'expression selon différentes conditions, comme l'hypostome par rapport à la colonne corporelle chez Hydra.
- Avancement ajusté au risque : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon en révélant la dynamique d'expression durant les phases de régénération et de bourgeonnement, indiquant ainsi la pertinence fonctionnelle.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de l'identification de la cible jusqu'à l'optimisation du composé précurseur, permettant une progression fondée sur des hypothèses, allant de l'analyse de séquence à la priorisation fonctionnelle.
- Découverte biologique : Soutient la vérification d'hypothèses en générant des phylogénies qui révèlent les événements de duplication et les pressions de sélection sur les familles de gènes d'intérêt.
- Écrantage : Fournit des systèmes biologiques prêts à être utilisés dans des tests grâce à des matrices d'expression normalisées permettant la comparaison croisée de l'activité génique entre échantillons.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes via l'expression différentielle fondée sur edgeR, permettant la comparaison statistique de différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en identifiant les gènes ayant des rôles conservés dans les systèmes sensoriels chez les métazoaires.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité bioinformatique réutilisable pour analyser n'importe quelle famille de gènes, réduisant ainsi le développement redondant de pipelines entre projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la sélection des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique grâce au contexte évolutif et d'expression.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et la standardisation par le biais de procédures bioinformatiques documentées et étape par étape, applicables à différentes équipes.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en permettant l'atténuation précoce des risques associés aux cibles avant tout investissement dans la validation en laboratoire.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en mettant en évidence les gènes présentant une forte conservation évolutive et une induction spécifique aux tissus.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en bio-informatique, incluant l'utilisation d'outils en ligne de commande, de bases de données de séquences et de logiciels phylogénétiques.
- Dépend de l'accès à une infrastructure informatique permettant de gérer de grands jeux de données RNA-seq et d'exécuter des analyses BLAST, MEGA et edgeR.
- Implique une standardisation entre équipes concernant les conventions de nommage des fichiers, les versions des génomes de référence et les paramètres utilisés pour l'alignement et la construction des arbres phylogénétiques.
- Implique des adaptations nécessaires lors de l'application du pipeline à des organismes non modèles possédant des génomes ou des annotations incomplets.
- Est limité par la qualité et l'exhaustivité des données d'entrée, notamment la profondeur du séquençage RNA-seq et la précision de l'annotation du génome de référence.
