Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Ce protocole est important car il fournit des instructions détaillées sur la façon de préparer et d’injecter des embryons de moustiques pour l’édition du génome CRISPR-Cas9. Les principaux avantages de cette technique de micro-injection sont qu’elle a un taux élevé de survie des moustiques et permet aux chercheurs de déterminer la fonction d’un gène. Ce protocole a été spécialement conçu pour injecter des moustiques appartenant au genre Culex.

Ces moustiques transmettent plusieurs agents pathogènes, y compris les virus qui causent la fièvre du Nil occidental et l’encéphalite de Saint-Louis, ainsi que les nématodes filaires, qui causent le ver du cœur canin et l’éléphantiasis. Par conséquent, le fait de disposer d’outils tels que l’édition du génome CRISPR-Cas9 nous permettra de mieux comprendre et de contrôler ces facteurs importants de la maladie. L’injection d’embryons d’insectes fraîchement pondus et l’obtention d’un taux de survie plus élevé demandent beaucoup de temps, de pratique et de patience.

Par conséquent, nous recommandons d’injecter à plusieurs embryons une solution saline colorée avant d’injecter des matériaux coûteux pour générer une mutation. Commencez par remplir les aiguilles d’injection avec le mélange d’injection. Choisissez un embout de remplissage d’aiguille ou de gel qui s’insérera facilement dans l’extrémité arrière de l’aiguille d’injection sélectionnée.

Assurez-vous qu’il y a un peu d’espace entre l’extrémité de l’aiguille de remplissage et l’aiguille d’injection. Aspirez soigneusement une seule petite goutte du mélange d’injection dans l’aiguille d’injection près de l’endroit où elle commence à s’effiler. Fixez ensuite l’aiguille d’injection sur le micro-injecteur.

Placez la lame contenant les embryons sur la platine du microscope. Pour ouvrir l’aiguille, utilisez une pression d’injection de départ d’environ 30 Psi et ajustez-la si nécessaire pour délivrer un volume approprié de mélange d’injection. À l’aide d’un microscope de dissection, placez l’aiguille au-dessus de l’embryon de moustique et utilisez soigneusement le micromanipulateur pour abaisser l’aiguille sur l’embryon.

Une fois que l’aiguille touche à peine l’embryon, déplacez rapidement l’embryon perpendiculairement à l’axe long de l’aiguille. Pour déterminer si l’aiguille a été ouverte avec succès, appuyez sur la gâchette d’injection et voyez si des bulles ou un mélange d’injection s’échappent de l’aiguille. Sinon, répétez l’opération en déplaçant l’embryon de moustique contre l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit ouverte et que le mélange d’injection s’échappe lorsque la gâchette est enfoncée.

Placez le premier embryon de moustique au centre de la vue, assurez-vous qu’il est net et placez l’aiguille sur le premier œuf. Augmentez progressivement le grossissement sur le microscope, en abaissant soigneusement l’aiguille pour la maintenir juste au-dessus du premier embryon. Continuez jusqu’à ce que le microscope ait atteint son grossissement le plus élevé, et que l’embryon et l’aiguille soient au point.

Déplacez légèrement l’embryon vers la gauche et abaissez l’aiguille de manière à ce qu’il soit dans le même plan de vision que l’embryon. Utilisez la platine du microscope pour toucher doucement l’embryon jusqu’à la pointe de l’aiguille. L’extrémité postérieure étroite de l’embryon de moustique doit légèrement dévier

À l’aide de la platine du microscope, déplacez l’extrémité postérieure de l’embryon sur l’aiguille et observez l’aiguille pénétrer dans le chorion de l’œuf de moustique. L’aiguille doit juste pénétrer la membrane et l’emplacement approximatif des cellules polaires dans l’embryon. Placer le mélange d’injection dans cette région augmente la probabilité que des mutations se produisent et soient héritées dans la lignée germinale.

Appuyez sur la gâchette d’injection une à trois fois pour injecter le mélange d’injection dans l’embryon. Administrez une petite quantité de mélange d’injection, juste assez pour qu’une petite éclaircie dans le plasma embryonnaire puisse être détectée. Utilisez la platine pour déplacer l’embryon vers la droite, loin et hors de la pointe de l’aiguille.

Si l’injection s’est bien déroulée, peu ou pas de liquide devrait s’écouler de l’embryon. Déplacez l’étage vers le bas de sorte que l’embryon suivant soit positionné devant l’aiguille. Et répétez l’injection.

Si le mélange d’injection ne semble pas sortir, ou si une grande quantité de liquide s’échappe de l’embryon après le retrait de l’aiguille, remplacez l’aiguille d’injection et recommencez. Détruisez tous les ovules non injectés ou endommagés. Une fois que tous les embryons sur la lame ont été injectés, lavez l’huile d’halocarbure en appliquant de l’eau d’osmose inverse avec une bouteille à eau diluée.

Dirigez le jet d’eau sur le dessus de la lamelle en verre au-dessus des embryons injectés et laissez l’eau s’écouler le long de la lamelle, en veillant à ne pas diriger le jet sur les embryons. Couvrez la lame avec 150 microlitres d’eau et placez-la sur du papier filtre humide à l’intérieur d’une boîte de Pétri carrée. Incuber la boîte de Pétri dans une chambre environnementale, réglée à 25 à 27 degrés Celsius et à 70 à 80 % d’humidité relative avec une photopériode de jour long.

Ce protocole a été utilisé pour injecter avec succès des embryons du moustique domestique du Nord, Culex pipiens, en veillant à ce que l’extrémité antérieure de l’embryon de moustique s’étende au-delà de la bande de pansement médical, a considérablement augmenté la survie des larves et a permis d’obtenir une progéniture de haute qualité capable de se développer jusqu’à l’âge adulte et de se reproduire. Le séquençage a révélé qu’environ 10 % des moustiques dépistés présentaient une petite insertion ou délétion près du site de coupe de Cas9 du premier ARN guide, ce qui suggère que les cellules polaires ont été ciblées avec succès lors des micro-injections. Les individus F1 se sont accouplés avec succès et ont produit une progéniture viable, dont certains contenaient également la mutation.

Lors de la micro-injection d’embryons d’insectes, la plupart des gens ont du mal à ouvrir l’aiguille et à déplacer l’embryon sur l’aiguille. N’oubliez pas que le développement de ces compétences demande du temps et de la pratique. Ce protocole peut être modifié ou adapté pour injecter les embryons d’autres moustiques ou même d’autres espèces d’insectes.

Au-delà de l’utilisation de ce protocole pour inactiver des gènes avec une édition ciblée du génome CRISPR-Cas9, les mêmes techniques peuvent être utilisées pour injecter des plasmides ou des transposons pour inhiber des gènes ou générer des mutations aléatoires. Mon laboratoire utilise actuellement cette technique pour mieux comprendre comment les moustiques mesurent quotidiennement et régulent leurs réponses saisonnières. Cependant, comment nous, les chercheurs, utilisons l’édition du génome CRISPR-Cas9 pour mieux comprendre la biologie de plusieurs organismes.