Cristallisation des protéines sur puce par microdialyse pour les études in situ sur la diffraction des rayons X

Cet article décrit le protocole de fabrication des puces microfluidiques développées pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de dialyse et les expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. L’un des principaux avantages de ces puces est le choix des matériaux de fabrication, rendant les puces compatibles pour la collecte in situ de données de diffraction des rayons X à température ambiante. Les expériences de cristallisation sur puce nécessitent de petits volumes de l’échantillon de protéines, ce qui réduit le coût global de travail avec ces macromolécules de grande valeur.

La cristallisation sur puce élimine également la récolte manuelle des cristaux de protéines fragiles, fréquemment appliqués en combinaison avec le refroidissement cryo lors d’expériences de cristallographie conventionnelles. En outre, nos micropuces utilisent la microdialyse pour la cristallisation des protéines, qui est une méthode basée sur la diffusion visant à équilibrer la concentration de précipitation à travers une membrane semi-perméable, afin d’approcher la concentration cromulente pour la cristallisation des protéines, et permet un contrôle précis et réversible sur les conditions de cristallisation. La microdialyse combinée au contrôle de la température peut être utilisée pour dissocier la nucléation de la croissance du cristal pour étudier les diagrammes de phase, en modifiant la concentration de précipitation tout en utilisant le même échantillon de protéines.

Préparez d’abord 50 grammes de base en silicone PDMS et c’est un agent curatif dans un rapport de masse de 10 pour un. Mélanger les deux ingrédients dans un bécher à l’aide d’une spatule. Après le mélange, placer le mélange dans une chambre à vide afin d’enlever toutes les bulles d’air.

Mettez 25 grammes de PDMS préméxé dans le premier SU8 à maîtriser contenant les modèles du canal microfluidique et des piliers, jusqu’à une hauteur d’environ cinq millimètres. Verser ensuite les 25 grammes restants du PDMS dans le deuxième maître SU8, ne contenant que les motifs des piliers. Guérir les deux couches PDMS dans un four à 338 kelvin pendant une heure.

Coupez les couches PDMS durcies autour des motifs des maîtres SU8 avec un scalpel, et décollez doucement les moules PDMS des maîtres en silicone. Placez le moule PDMS, avec les canaux et les piliers sur une lame de verre microscope rigide avec les motifs orientés vers le haut. Couper un petit morceau de membrane de dialyse à la cellulose régénérée afin de couvrir le pilier central du moule PDMS, qui est conçu pour être la chambre protéique.

Le seuil de poids moléculaire de la membrane de dialyse est choisi en conséquence en fonction du poids moléculaire de l’échantillon de protéine, et des précipités de la solution de cristallisation. Ensuite, séparez soigneusement le morceau sec de la membrane de dialyse à cellulose régénérée. Couper un petit morceau de la membrane de dialyse séparée.

La taille de ce morceau de membrane dépend de la conception de la puce. Et plus précisément, cela dépend des dimensions du pilier central. Déposez le morceau de la membrane de dialyse sur le pilier central du moule PDMS, qui est soutenu sur la glissière de verre, avec son pilier et les canaux orientés vers le haut.

Ensuite, placez le deuxième moule PDMS avec seulement les piliers orientés vers le bas, sur le dessus du moule PDMS qui est déjà pris en charge sur la glissière en verre. Alignez tous les piliers des deux moules PDMS. Le morceau de la membrane régénérée de dialyse de cellulose est pris en sandwich entre les deux piliers centraux des moules de PDMS.

Cette étape de la procédure de fabrication peut être effectuée au microscope optique ou simplement en inspectant visuellement soigneusement l’alignement de tous les piliers. Placez l’assemblage dans une chambre à vide et dessiccate pendant 30 minutes afin d’enlever les bulles d’air emprisonnées dans les moules PDMS, et d’améliorer l’insertion de la résine photocurable NOA, qui sera décrite dans la prochaine étape de ce protocole. Retirez l’assemblage de la chambre à vide et remplissez l’espace vide entre les deux moules PDMS avec la résine photocurable à base de thiolin, NOA 81, par imbibition capillaire.

Appliquer la résine sur trois des quatre côtés de l’assemblage. Placez l’assemblage dans un lien croisé et guérissent la résine NOA en l’exposant à la lumière UV pendant huit secondes, à l’aide d’une lampe UV collimée de 35 milliwatt par centimètre carré. Coupez une pièce PMMA de 175 micromètres d’épaisseur dans les dimensions standard d’une lame de verre au microscope et détachez la protection en plastique de chaque côté de la pièce PMMA.

Une fois la première exposition aux UV terminée, retirez le moule PDMS supérieur avec une résine NOA partiellement croisée collée dessus à partir du moule PDMS inférieur et de la glissière en verre. Appuyez doucement sur l’assemblage du moule PDMS supérieur et de la résine NOA partiellement durcie sur la pièce PMMA. Placez le nouvel assemblage dans le lien croisé et guérissez à nouveau la résine NOA par exposition à la lumière UV pendant 60 secondes.

Retirez soigneusement le moule PDMS supérieur. La puce de dialyse faite de la résine noa entièrement croisée intégrant une membrane régénérée de dialyse de cellulose et étant soutenue sur une pièce de PMMA est prête. Collage de connecteurs disponibles dans le commerce sur l’entrée et les points de sortie du canal microfluidique avec de la colle époxy rapide.

Pour la manipulation des fluides, choisissez le diamètre des tubes PTFE en fonction de la taille des connecteurs. Les tubes sont utilisés pour l’introduction de la solution de cristallisation dans le canal fluidique de la puce de dialyse. Pipette manuellement une gouttelette de l’échantillon de protéines à l’intérieur du réservoir de protéines situé juste sur la membrane de dialyse.

Le volume de la gouttelette protéique dépend de la conception de la puce qui est utilisée. Et plus précisément, cela dépend du volume du pilier central, et il peut être de 0,1 ou 0,3 microlitres. Appliquez soigneusement une fine couche de graisse de silicone sous vide tout autour du réservoir de protéines.

Couper un petit morceau de PMMA et le placer délicatement au-dessus de la fine couche de graisse de silicone. Coupez un morceau de ruban Kapton, assez grand pour couvrir la pièce PMMA placée au-dessus du réservoir de protéines et pour coller sur la puce NDA sur tous les bords. L’échantillon de protéines est encapsulé dans le réservoir et la puce peut être utilisée pour des expériences de cristallisation.

Préparez d’abord environ 500 microlitres de la solution de cristallisation en mélangeant les volumes appropriés du tampon et les solutions précipitées. Injectez la solution de cristallisation au point de la puce de dialyse à travers les connecteurs fluidiques, soit manuellement avec la seringue ou avec un système automatisé à pression. Une fois que le canal fluidique est rempli de la solution de cristallisation et qu’aucun air n’est emprisonné à l’intérieur, scellez les ports d’entrée et de sortie de la puce avec du ruban Parafilm.

Pipette le volume approprié de la solution protéique dans le réservoir de protéines et encapsuler l’échantillon de protéines comme cela a déjà été décrit. La croissance du cristal protéique peut être visualisée et enregistrée à l’aide d’un appareil photo numérique. Pour la fabrication des puces de dialyse, nous avons choisi des matériaux optiquement transparents et biologiquement inertes, démontrant une compatibilité élevée pour les expériences in situ de diffraction des rayons X.

Le bruit de fond généré par les matériaux composant le compartiment protéique de la puce, qui est dans la trajectoire directe du faisceau de rayons X, a été évalué. Le compartiment protéique se compose de la membrane régénérée de dialyse de cellulose, du ruban de Kapton, et de deux couches de PMMA, une employée comme substrat des puces, et une employée pour l’encapsulation de l’échantillon de protéine. Dans cette image, est illustré le bruit de fond généré par la bande Kapton, la membrane de dialyse de cellulose régénérée, la couche PMMA, et leur assemblage.

Même si la résine photocurable NOA comprend le corps principal des micropuces, n’est pas inclus dans ces mesures car il ne fait pas partie de la chambre protéique. Des anneaux diffus attribués aux interactions des rayons X avec les matériaux peuvent être vus pour la bande de Kapton à la résolution inférieure à quatre angstroms, le PMMA entre quatre à huit angstroms, et la membrane de dialyse entre quatre à cinq angstroms. Le bruit de fond total généré par la puce est principalement observé à la résolution inférieure à six angstrom, ce qui indique que le traitement des données de diffraction à haute résolution lysozyme n’est pas affecté.

Les puces ont été montées devant le faisceau de rayons X avec un support imprimé 3D que nous avons conçu pour les expériences in situ de diffraction des rayons X, et il peut contenir jusqu’à trois puces simultanément. Des expériences ont été menées afin d’évaluer l’efficacité des micropuces pour la cristallisation sur puce des protéines solubles dans le modèle avec la méthode de microdialyse. les cristaux de lysozyme ont été cultivés à 293 kelvin dans deux conditions différentes.

La première condition de cristallisation contenait 1,5 chlorure de sodium molaire et 0,1 acétate de sodium molaire. La deuxième condition de cristallisation contenait un chlorure de sodium molaire, 0,1 acétate de sodium molaire et 30 % de polyéthylène glycol 400, et a été choisie pour montrer la compatibilité des puces et de la méthode de microdialyse, avec des précipités de poids moléculaire élevé et des solutions visqueuses. Les expériences de cristallisation ont été menées dans des conditions statiques.

Une fois que les cristaux de lysozyme ont été cultivés sur la puce, ils ont été utilisés pour des expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. Les puces ont été montées à la ligne de faisceau à l’aide du support imprimé 3D et des ensembles complets de données de diffraction des rayons X ont été recueillis à partir de deux cristaux de lysozyme. Après traitement des données de diffraction des rayons X, la carte de densité électronique d’un seul cristal de lysozyme a été obtenue à une résolution d’angstrom de 1,95, comme le montre la figure A.Figure B montre la carte de densité électronique obtenue à 1,85 résolution d’angstroms.

Après la fusion de deux ensembles de données obtenus à partir de deux cristaux de lysozyme différents, les deux cartes de densité électro montrent des informations structurelles détaillées qui peuvent être obtenues par des expériences in situ de diffraction des rayons X menées directement sur les puces de dialyse à température ambiante, à partir de cristaux de protéines simples ou multiples. Nous avons démontré la procédure de fabrication pour les dispositifs microfluidiques conçus pour la cristallisation des protéines sur puce avec la méthode de microdialyse, et les expériences in situ de diffraction des rayons X à température ambiante. Nous avons utilisé des matériaux de fabrication avec une grande transparence des rayons X, compatibles pour la cristallographie des protéines in situ.

La collecte de données de diffraction est automatisée à l’aide d’un support imprimé 3D pour les puces, qui peut être monté directement dans les lignes de faisceau de cristallographie macromoléculaire. La polyvalence de cette puce provient de l’utilisation de la microdialyse pour contrôler de façon réversible les conditions de cristallisation et cartographier les diagrammes de phase à l’aide d’un petit volume de protéines. Le prototypage de l’appareil est simple, permettant la fabrication de jusqu’à 30 micropuces en une seule journée dans une pièce propre, avec des matériaux relativement peu coûteux.

Nous nous attendons à ce que ces caractéristiques des puces puissent être utilisées pour des études en série de cristallographie aux rayons X sur des cibles protéiques plus difficiles.