Souche contrôlée d’hydrogels 3D sous imagerie par microscopie dynamique

Les tissus biologiques se développent dans des environnements mous tridimensionnels à travers lesquels les cellules sont exposées à divers signaux mécaniques. Notre méthode permet l’étirement des hydrogels de manière tridimensionnelle pour l’étude des réponses biomécaniques. Cette technique permet d’étirer uniformément les hydrogels sur toute leur épaisseur pendant que l’imagerie en direct est effectuée.

De plus, la géométrie de l’hydrogel peut être manipulée à n’importe quelle taille ou forme. La connaissance de la façon dont les cellules et la matrice extracellulaire réagissent aux forces est importante pour révéler comment les tissus se développent et les maladies progressent. Cela peut conduire au développement potentiel de thérapies anticancéreuses et de modèles d’ingénierie tissulaire.

Commencez par utiliser un laser ou un découpeur manuel pour créer une bande de caoutchouc avec un trou au centre. Découpez un rectangle de film hydrophobe de manière à ce qu’il soit plus large que les bandes de silicone et lavez un plat en plastique avec de l’éthanol à 70 %. Après séchage avec des lingettes non pelucheuses, placez le film d’étanchéité dans le plat et placez une bande de silicone avec la pellicule plastique retirée d’un côté au centre de chaque morceau de film d’étanchéité.

Pour la formation de gel de fibrine, délivrez uniformément 2,5 microlitres de fibrinogène étiqueté à froid dans la découpe en silicone de chaque bande afin que toute la circonférence de chaque découpe soit en contact avec le fibrinogène, en prenant soin de ne pas laisser se former de poches d’air ou de bulles n’importe où dans les solutions. Ajoutez immédiatement 2,5 microlitres de thrombine refroidie directement à chaque solution de fibrinogène et mélangez rapidement les solutions avec un pipetage minutieux, en déplaçant l’embout autour de tout le mélange pour créer une solution aussi homogène que possible. Après le mélange, placez le plat couvert dans l’incubateur pendant 30 minutes pour la polymérisation du gel.

À la fin de l’incubation, ajoutez suffisamment de PBS dans le plat pour immerger les constructions en gel de silicone et soulevez soigneusement chaque échantillon du bol, en vous assurant que la couche de film d’étanchéité reste collée à la bande. En décollant lentement d’une extrémité à l’autre du silicone, détachez soigneusement le film d’étanchéité de chaque morceau de silicone, puis remettez la bande dans le plat et placez le plat sur la platine d’un microscope optique pour évaluer l’état de l’échantillon. Pour charger l’échantillon sur le dispositif d’étirement, remplissez le bain de PBS et placez la bande de silicone contenant le gel d’échantillon sur le dessus du bain de sorte que les extrémités de la bande reposent de chaque côté du bain.

Placez les pinces et les bandes de tissu, puis serrez de manière à ce que toutes les pièces soient reliées pour former une bande droite avec la découpe au centre. Placez le matériau sur le puits et fixez une lamelle au fond du puits, puis placez un puits liquide en aluminium dans le dispositif d’étirement. Remplissez le puits avec un à deux millilitres de milieu cellulaire PBS et placez la construction en gel de tissu en bande dans l’appareil.

Fixez la bande de tissu dans le support de manière à ce que la découpe du gel soit au centre avant de placer et de verrouiller soigneusement l’insert à goupille en place dans l’appareil. Placez et verrouillez l’autre côté du tissu dans l’axe et placez le dispositif d’étirement et l’échantillon attaché sur la platine d’un microscope confocal. Utilisez un câble USB pour connecter le microcontrôleur à l’ordinateur et connectez le servomoteur au microcontrôleur.

Ouvrez ensuite le module de commande du dispositif d’étirement sur l’ordinateur pour imager l’échantillon. Pour déterminer si l’échantillon est adéquat pour une expérience, utilisez l’imagerie en direct à basse résolution pour scanner l’ensemble du gel et déterminer la position Z la plus basse à laquelle l’adhérence complète aux parois internes de la découpe est apparente, sans déchirures ni bulles. Après avoir noté l’emplacement Z du microscope, balayez l’interface de l’étiquette fluorescente du gel et de la bande de silicone pour déterminer l’adhérence complète du gel au silicone sur toute sa circonférence.

Après le balayage, déplacez la platine dans la direction Z jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de continuité dans le gel et notez la limite supérieure de la position Z. Soustrayez ensuite la limite supérieure de la direction Z de la limite inférieure pour calculer l’épaisseur de l’échantillon. Pour déterminer la position de pré-étirement de l’échantillon, cliquez sur Go to Zero Servo POS dans le logiciel du module pour vous assurer que le servomoteur est à sa position zéro et fixez le servomoteur au dispositif d’étirement, en prenant soin de ne pas exercer de pression sur l’échantillon.

Pendant l’imagerie, cliquez sur le bouton plus un pour déplacer le moteur d’un degré à la fois dans le sens des aiguilles d’une montre. Lorsque le côté droit de la découpe se déplace, cliquez sur le bouton moins un pour inverser l’échantillon à l’avant-dernière position afin de maintenir l’échantillon sous une tension minimale. Cliquez sur Set Min Servo Position pour définir la position de référence et capturer une image de tuile Z à un seul coup de grossissement de 40, haute résolution, de l’ensemble de la zone de gel comme référence de référence pour l’analyse de post-traitement.

Lorsque toutes les images ont été acquises, avancez le servomoteur d’un degré par seconde jusqu’à ce que l’amplitude d’étirement souhaitée soit atteinte. Pour chaque amplitude d’étirement pour laquelle une analyse est souhaitée, vérifiez que le gel ne s’est pas détaché du silicone en aucun point de sa circonférence en balayant l’interface entre le gel et le silicone, puis capturez un ensemble d’images de la pile de tuiles Z à haute résolution de toute la surface du gel pour l’analyse post-traitement. Le zoom avant et le suivi manuel des agrégats de billes pendant l’étirement du gel permettent de calculer les déformations locales du gel dans les directions axiale et perpendiculaire.

En règle générale, les brins axiaux se propagent de manière relativement linéaire du bord découpé en silicone au centre du gel et sont plus grands que les déformations perpendiculaires compressives. Ici, des images à fort grossissement d’un hydrogel typique non étiré et relativement isotrope, et d’un hydrogène sous une déformation de coupure élevée de 80 % représentant des fibres fortement alignées dans la direction de l’étirement sont présentées. L’analyse de la réorientation de la fibre a révélé une dépendance approximativement linéaire entre l’alignement de la fibre et la déformation externe sur la découpe jusqu’à des déformations de 40 % avec une saturation modérée à des déformations supérieures à 40 %Comme illustré dans cette analyse d’alignement de fibre, à mesure que la déformation externe sur la découpe augmente, l’alignement de la fibre augmente, suivant une courbe non linéaire globale.

Notez que la réponse du gel à l’étirement est relativement uniforme sur toute l’épaisseur de son Z. Comme illustré dans cette simulation préliminaire par éléments finis réalisée sur un matériau continu 2D, le tapis de couleur varie de 38 à 42 %, ce qui indique que les souches de gel sont relativement homogènes dans toute la zone circulaire du gel. Il est important de s’assurer que l’hydrogel adhère complètement aux parois intérieures de la découpe géométrique, car l’adhérence et la continuité sont cruciales pour un étirement fiable des échantillons.

En modifiant la géométrie de la découpe en silicone, nous pouvons programmer des gradients de déformation et d’alignement des fibres, de sorte que lors de l’intégration de cellules, nous pouvons analyser la réponse à ces gradients.