Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

Ce protocole facilite la préparation de coupes horizontales de cerveau d’hippocampe pour leur utilisation dans diverses applications scientifiques. Cette technique préserve l’intégrité de toutes les voies des fibres de l’hippocampe au sein d’une seule tranche d’hémisphère. Ce protocole de coupe est parfaitement adapté pour évaluer les changements neurologiques qui se produisent sur les pathologies cérébrales qui se développent et se manifestent dans le gyrus denté.

L’aspect le plus important de ce protocole est de trouver l’équilibre entre une exécution aussi rapide que possible et la manipulation douce du tissu cérébral. Pour préparer un litre d’ACSF, mélangez lentement tous les produits chimiques solides comme indiqué dans 800 millilitres d’eau en agitation constante avec une barre d’agitation magnétique avant de verser lentement les volumes appropriés de sulfate de magnésium et de chlorure de calcium. Ensuite, utilisez un osmomètre à pression de vapeur pour valider l’osmolarité entre 305 et 315 milliosmole et faites bouillir en continu la solution ACSF à température ambiante avec du carbogène pour régler le pH entre 7,3 et 7,4.

Pour préparer 250 millilitres de solution de tranche à haute teneur en saccharose, ajoutez les composés à 25 millilitres de solution pré-tranchée comme indiqué dans le tableau et vérifiez que l’osmolarité est comprise entre 320 et 325 milliosmole. Ensuite, faites bouillir la solution de tranche à haute teneur en saccharose pendant 10 à 15 minutes avec du carbogène pour fixer le pH entre 7,3 et 7,4 et conservez la solution en tranches à haute teneur en saccharose pendant 20 à 30 minutes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit partiellement congelée. Pour préparer un espace de travail pour la dissection, remplissez une chambre de récupération avec une solution d’ACSF carbogéné et placez la chambre dans un bain-marie à 32 degrés Celsius.

Réglez le vibratome sur le programme de coupe approprié et remplissez le support de glace, montez-le sur le vibratome et fixez une lame au bras du vibratome. À l’aide d’une spatule, écraser et mélanger la solution de tranches de saccharose partiellement congelée jusqu’à l’obtention d’une gadoue hétérogène. Ensuite, faites buller la solution avec du carbogène et utilisez la solution pour hydrater un morceau de papier filtre sur un plat de culture réfrigéré de 90 millimètres et remplissez un plat de culture de 35 millimètres sur de la glace.

Pour prélever le cerveau, utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir le cuir chevelu d’une souris mâle âgée de deux à six semaines et pour ouvrir la calvaria le long de la suture sagittale. Utilisez une pince incurvée pour retirer le crâne jusqu’à ce que tout le cerveau, y compris les bulbes olfactifs, soit visible et utilisez une spatule pour retirer soigneusement le tissu cérébral intact. Placez le cerveau dans la boîte de culture de 35 millimètres et utilisez une pipette Pasteur remplie d’une solution de tranche à haute teneur en saccharose pour retirer délicatement les cheveux ou les particules de sang du tissu.

Utilisez la spatule pour transférer la cervelle nettoyée sur le morceau de papier filtre trempé et utilisez une lame pour couper la cervelle longitudinalement en deux. Placez les deux hémisphères sur le côté médial fraîchement coupé et utilisez la lame pour faire une coupe parallèle sur le haut dorsal de chaque hémisphère pour retirer la région dorsale de chaque morceau de cerveau. Placez les deux hémisphères sur la face dorsale fraîchement coupée avec la partie ventrale du cerveau vers le haut et placez une goutte de super colle sur une plaque d’échantillon.

Utilisez une pointe de pipette pour étaler la colle dans une grande zone afin d’accueillir les deux morceaux de tissu et touchez un morceau de sangle de papier filtre sur la face ventrale d’un hémisphère. À l’aide d’une autre sangle en papier filtre, faites demi-sécher soigneusement la face dorsale du cerveau et placez la face dorsale de l’hémisphère vers le bas sur la colle sur la plaque d’échantillon. Utilisez deux sangles de papier filtre supplémentaires pour positionner le deuxième hémisphère sur la colle comme nous venons de le démontrer et placez la plaque d’échantillon dans la chambre de tranchage.

Ensuite, recouvrez rapidement mais soigneusement l’assiette de gadoue glacée à haute teneur en tranches de saccharose. Pour acquérir des sections du tissu cérébral, positionnez la lame du vibratome devant la face médiale des hémisphères et soulevez la table du vibratome de manière à ce que la lame soit à la même hauteur que les côtés ventraux des hémisphères, qui sont maintenant orientés vers le haut. Utilisez la commande du vibratome pour abaisser la lame de 600 microns plus loin dans la direction dorsale et coupez le tissu jusqu’à ce que les deux premières tranches soient complètement séparées des deux hémisphères.

Lorsque les deux premières tranches de tissu ont été obtenues, inversez le sens de coupe et abaissez la lame de 300 microns supplémentaires avant de trancher à nouveau. Lorsque l’hippocampe devient visible, utilisez une pipette Pasteur en plastique élargie pour recueillir et transférer les tranches dans la chambre de récupération du bain-marie. Laissez les tranches dans la chambre de récupération remplie d’ACSF pendant une heure, puis placez la chambre de récupération à température ambiante pendant 30 minutes avant d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques des échantillons de tissus.

Ici, des enregistrements représentatifs de potentiel post-synaptique excitateur de champ négatif et positif à partir de coupes de faible et de haute qualité respectivement peuvent être observés. La trace d’exemple négative présente une grande amplitude de volée de fibres lors de la dépolarisation des fibres neuronales stimulées qui est encore plus élevée que l’amplitude réelle de fEPSP, tandis que la trace de haute qualité présente un faible rapport volée de fibres/fEPSP et une amplitude fEPSP élevée. La viabilité d’une tranche de cerveau peut également être analysée en traçant les pentes du potentiel post-synaptique excitateur du champ en fonction des amplitudes de la volée de fibres.

Les courbes d’entrée/sortie qui sont généralement utilisées pour déterminer la qualité de la tranche peuvent être obtenues en appliquant des stimuli de courant croissants à la tranche de cerveau et en surveillant les réponses fEPSP ultérieures. En raison des propriétés de conduction sous-optimales du tissu cérébral mal conservé, les coupes de cerveau de mauvaise qualité présentent des courbes d’entrée/sortie réduites. Les tranches de cerveau viables ont des lignes de base de transmission synaptique stables, tandis que les tranches de cerveau avec une base instable ne peuvent pas être utilisées pour d’autres protocoles de conditionnement afin d’étudier la plasticité synaptique des circuits cérébraux.

Les enregistrements de base de la fEPSP peuvent également être utiles pour surveiller les effets des médicaments sur la transmission synaptique elle-même. De plus, les tranches de cerveau peuvent être utilisées en combinaison avec un indicateur de calcium pour acquérir des enregistrements d’imagerie par fluorescence et pour étudier les influx de calcium dans différentes conditions de coupe ou de traitements. Assurez-vous que la dissection cérébrale est effectuée dans un délai maximum de 1,5 minute après le sacrifice, ce qui garantit que le tissu cérébral n’est que brièvement sans refroidissement et sans apport d’oxygène.

Les coupes de cerveau de l’hippocampe ont de nombreuses applications différentes, des techniques de biologie moléculaire à l’électrophysiologie. Cette procédure facilite l’investigation intensive de l’anatomie de l’hippocampe et des processus neurologiques.