Name: Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez la préparation de tranches hippocampiques horizontales chez la souris pour préserver l'intégrité des voies neuronales. Cette technique permet d'étudier la transmission synaptique et la plasticité par électrophysiologie.

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Nous remercions l’unité d’électrophysiologie du VIB-KU Leuven Center for Brain and Disease Research sous la supervision du Dr Keimpe Wierda et du Professeur Joris De Wit pour l’utilisation de leurs installations de recherche. En outre, nous remercions tous les membres du Laboratoire de recherche Ion Channel et du Laboratoire d’Endomètre, d’Endométriose et de médecine de la reproduction à la KU Leuven pour leurs discussions et commentaires utiles.
Ce projet a reçu des fonds de la Fondation de recherche-Flandre (G.084515N et G.0B1819N à J.V.) et du Conseil de recherche de la KU Leuven (C14/18/106 à J.V.). K.P. est boursier FWO [PEGASUS]2 Marie Skłodowska-Curie et a reçu des fonds du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie (665501) avec la Fondation flanders (FWO) (12T0317N). K.H. est boursier postdoctoral de la Research Foundation Flanders, Belgique (12U7918N).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que couramment utilisés dans la communauté des neurosciences, les préparations de tranches de cerveau sont également confrontées à plusieurs inconvénients. Par exemple, les connexions d’entrée et de sortie aux zones cérébrales d’intérêt ne sont plus reliées dans une tranche de cerveau. En outre, une fois isolé, le tissu commence à se dégrader lentement au fil du temps et ce processus pourrait modifier les conditions physiologiques de la tranche du cerveau. Ce sujet en particulier est très préoccupant parce que la plupart des enregistrements de tranches de cerveau prennent plusieurs minutes à heures, ce qui se traduit par de longues journées expérimentales avec des enregistrements effectués sur des tissus qui ont été isolés jusqu’à 6-8 h avant le début de l’expérience. En outre, le liquide céphalo-rachidien et la circulation sanguine sont interrompus pendant les préparations de tranches, ce qui peut conduire à l’absence de composés endogènes importants dans une tranche de cerveau. Et le plus évidemment, la procédure de tranchage elle-même peut causer des dommages aux tissus mécaniques qui pourraient compromettre les résultats obtenus. Cependant, les avantages réels des préparations de tranches cérébrales l’emportent encore sur leurs inconvénients, c’est pourquoi ils présentent une technique très appréciée et utilisée dans la recherche en neurosciences.
Les tranches cérébrales hippocampiques aiguës présentent une technique puissante et donc largement utilisée pour étudier les processus neuronaux d’un niveau moléculaire jusqu’à des études complexes de circuits cérébraux. Ceci est basé sur la neuroanatomie idéale de l’hippocampe qui peut être facilement préservée dans une préparation de tranche18. Par conséquent, les tranches de cerveau hippocampal sont utilisées dans une grande variété de projets de recherche scientifique, y compris les dépistagesde médicaments 17, les études des propriétés neuronales et synaptiques impliquées dans les fonctions cognitives40,41, et les enquêtes sur les conditions pathologiques du cerveau14,42,43. Toutefois, un large éventail d’applications différentes provoque également un large éventail de protocoles disponibles de préparation des tranches qui peuvent différer dans divers paramètres, tels que les conditions de dissection et la coupe de l’orientation du plan, entre autres. Par conséquent, la question exacte de la recherche d’un projet scientifique doit être déterminée afin de choisir un protocole approprié de préparation des tranches.
L’hélico tissulaire présente l’une des plus anciennes techniques utilisées afin de préparer des tranches de cerveau hippocampal44,45. Les principaux avantages de cette méthode de préparation incluent le faible coût de l’hélicoptère et l’utilisation rapide et facile46. Cependant, les hachoirs de tissu causent le stress mécanique qui a comme résultat des changements morphologiques et la mortcellulaire 47. En comparaison, le vibratome est une machine assez chère et le temps de préparation des tranches est considérablement augmenté ce qui pourrait avoir un impact sur la qualité de la tranche. Cependant, le vibratome offre habituellement une manière plus douce de séparer les tranches du tissu et permet de maintenir le cerveau bien refroidi et oxygéné au-dessus de la procédure entière d’isolement, améliorant de ce fait des propriétés detranche 46. Par conséquent, plusieurs groupes emploient standardment cette technique et ont proposé des protocoles pour la préparation des tranches hippocampiques aiguës de cerveau utilisant le vibratome16,30,48. Alors que certains protocoles ne fournissent que quelques détails pour le tranchage lui-même, mais plutôt se concentrer sur une application spécifique de cette préparation tranche48, d’autres fournissent des protocoles de tranche détaillée qui diffèrent dans le plan de coupe ou d’autres détails du protocole (par exemple, l’intégration agarose ou tranche / solutions de récupération) donnée dans cet article27,30.
Le protocole décrit ici présente une méthode simple afin de préparer des tranches horizontales aiguës de haute qualité de cerveau de souris hippocampal de jeunes animaux. Le protocole est particulièrement utile pour préserver le chemin perforant (médial et latéral) qui présente la voie d’entrée hippocampale, qui projette du cortex entorhinal à l’hippocampe8,49,50. Les préparations transversales sagittales, coronal, ainsi que les préparations isolées de tranches transversales d’hippocampe ne préservent pas correctement le chemin perforant, qui provient principalement des couches II et V du cortex entorhinal et se projette dans plusieurs secteurs dans l’hippocampe18. En raison du positionnement anatomique du cortex entorhinal par rapport à l’hippocampe, les tranches horizontales de cerveau sont une nécessité afin de maintenir les fibres perforantes entièrement intactes de chemin dans la préparation de tranche31. En outre, le tranchage horizontal préserve idéalement les fibres moussus qui se projettent du gyrus bosselé aux neurones CA3 dans l’hippocampe9,30,50. Par conséquent, cette méthode de préparation est de grande valeur pour les études qui étudient les voies d’entrée hippocampal et les processus liés à la DG. En outre, ce protocole permet l’étude de la voie collatérale Schaffer50. Cependant, les préparations sagittales et coronaires de tranche de cerveau sont plus couramment employées en étudiant des projections de fibre de CA3 à CA1, vraisemblablement en raison de leur temps légèrement plus rapide de préparation qui peut augmenter le risque d’obtenir des tranches de haute qualité. Néanmoins, les préparations horizontales de tranche hippocampale présentent un outil de recherche puissant puisqu’elle permet la conservation et l’investigation de toutes les voies hippocampal de fibre dans un hémisphère de tranche. Cela peut être particulièrement utile lorsque les réponses du circuit sont étudiées, par exemple, dans des enregistrements d’analyse d’électrodes multiples.
Une préoccupation majeure lors de la préparation des tranches de cerveau est la bonne préservation du tissu cérébral. Ceci est accompli par plusieurs étapes critiques dans notre protocole, y compris une dissection rapide, l’oxygénation et le refroidissement continus et suffisants du tissu, et la protection du tissu cérébral par l’utilisation de la méthode protectrice de coupe avec une solution de découpage à faible teneur en sodium et à haut saccharose39,51. Malgré le fait que le protocole décrit ici donne un taux de réussite d’environ 90%, des mesures de protection potentiellement supplémentaires pourraient être nécessaires lorsque vous travaillez avec des tissus dérivés d’animaux plus âgés ou génétiquement diversifiés ou lorsque vous essayez de préserver une population cellulaire spécifique. Plusieurs méthodes ont déjà été rapportées pour protéger les préparations sensibles de tissu cérébral. Ces méthodes comprennent l’utilisation de solutions de tranchage à base de NMDG pour réduire la perméation du sodium52,l’utilisation de niveaux élevés de magnésium dans la solution de tranchage afin de bloquer l’activité des récepteurs NMDA53, et l’utilisation prolongée de solutions protectrices également pendant la périodede récupération 23. Toutes ces mesures se traduira par une réduction de l’excitotoxicité. En outre, une perfusion trans-cardiale avec des solutions de protection contre la glace ACSF est souvent utilisée et nécessaire lorsque vous travaillez avec des animaux plus âgés27.
Les tranches aiguës du cerveau hippocampal sont parfaitement adaptées et largement utilisées pour des études électrophysiologiques pour des raisons telles que les signaux d’amplitude élevée qui peuvent être obtenus à partir d’une tranche cérébrale aiguë relativement épaisse (300-500 μm), ce qui garantit un rapport signal/bruitélevé 11. Les applications électrophysiologiques couramment utilisées comprennent des enregistrements extracellulaires sur le terrain et des enregistrements intracellulaires à cellules entières en mode tension ou courant. Afin d’acquérir des données électrophysiologiques de haute qualité, la santé des tranches est une préoccupation primordiale et peut être garantie en suivant strictement le protocole présenté. Toutefois, comme les préparations de tranches présentent une technique très sensible, un contrôle de qualité doit être régulièrement inclus avant le début de chaque expérience. Plusieurs paramètres peuvent être utilisés comme vérification de la qualité de la tranche et sont évalués de façon standard au moyen de courbes input-output et d’enregistrements fEPSP ou EPSCde base 19. Néanmoins, il convient de noter que les propriétés électrophysiologiques sous-optimales peuvent résulter d’erreurs expérimentales telles que le positionnement des électrodes, l’orientation ou même des dommages et ne représentent pas seulement la santé de la tranche préparée. Par conséquent, il est conseillé d’effectuer des contrôles de qualité supplémentaires tels que la visualisation simple et l’évaluation des cellules sous un objectif de 40x ou une coloration du noyau DAPI. Ces contrôles de qualité peuvent être utilisés pour confirmer la santé constante des tranches au cours de plusieurs séances de préparation de tranches.
La microfluorimétrie calcique présente une technique moins couramment utilisée pour étudier les tranches de cerveau hippocampal. Cependant, cette technique est d’une valeur supplémentaire pour les enregistrements d’électrodes extracellulaires et intracellulaires standard, car elle permet de visualiser et de quantifier les flux intracellulaires de calcium, qui sont d’une grande importance dans la signalisation neuronale et synaptique. Les changements dans les concentrations intracellulaires de calcium sont impliqués dans la libération de vésicule de neurotransmetteur, la génération potentielle postsynaptique, la régulation de la plasticité synaptique et la conduction axonalede nerf 54,55,56. À titre d’illustration de cette technique (figure 4), nous avons utilisé un colorant de calcium disponible dans le commerce. Incontestablement, le traitement des tranches de tissu avec des dyes de calcium peut produire des difficultés telles qu’un délai expérimental accru ainsi qu’une charge inefficace des cellules neuronales situées inférieures. Toutefois, des variations sur cette technique pourraient être utilisées pour contourner ces défis techniques. Par exemple, il est possible de combiner des mesures de calcium et des enregistrements de pince de correction dans les tranches hippocampal. De cette façon, un colorant fluorescent de calcium pourrait être chargé dans une cellule spécifique par la pipette de correction, permettant les mesures de la dynamique de calcium dans une cellule spécifique d’intérêt57. Alternativement, les animaux génétiquement modifiés exprimant l’indicateur de calcium, GCaMP58, soit dans le cerveau entier, ou entraînés par un promoteur spécifique à la cellule, pourraient être utilisés. Fait intéressant, les tissus cérébraux provenant d’animaux GCaMP ayant un lien direct avec une protéine d’intérêt pourraient fournir des occasions de déterminer le modèle d’expression neuronale ou d’étudier la participation aux étincelles et aux ondes calciques.
Au total, nous fournissons les lignes directrices pour la préparation réussie de tranches de cerveau hippocampal horizontales saines et viables provenant de souris pour des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie. Cette méthodologie est très utile pour accéder aux changements neurologiques qui se produisent dans les pathologies cérébrales qui sont décrites dans le gyrus bosselé.

L’exploration étendue de l’hippocampe a commencé quand Scoville et Milner ont rapporté l’incapacité d’un patient (H.M.) de former la nouvelle mémoire déclarative après déplacement chirurgical de l’hippocampe et des structures voisines de lobe temporel comme traitement pour l’épilepsie grave1. À partir de ce moment, l’hippocampe a été étudié en profondeur à partir des propriétés neuronales générales et des fonctions jusqu’au développement de troubles cérébraux graves, tels que l’épilepsie et la maladie d’Alzheimer2,3,4,5. L’hippocampe fait partie du système limbique, composé d’un groupe de structures cérébrales connexes impliquées dans la formation de l’émotion et dela mémoire 6,7. Un réseau dense de plusieurs voies de fibre accomplit une connectivité hippocampal serrée aux structures internes et externes de cerveau. Ces voies incluent le chemin perforant médial et latéral (cortex entorhinal pour bosseter le gyrus, CA3 – CA1 et subiculum)8,le chemin de fibre moussue (gyrus dentate au CA3)9 et la voie collatérale/associationnelle de Schaffer (CA3 à CA1)10 (figure 1). L’hippocampe présente l’une des zones cérébrales les plus largement explorées jusqu’à présent en raison de son organisation laminaire fortement conservée de la formation de couches neuronales, et de la possibilité d’obtenir des cultures neuronales vitales et des tranches de cerveau avec une relative facilité5.
<img alt="Diagramme des neurones de l’hippocampe, montrant les voies : CA1, CA2, CA3, DG, subiculum, LPP, MPP, EC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Dessin animé illustrant les différentes régions hippocampiques et les voies principales de fibre. Les différentes régions hippocampales sont indiquées par des lignes de couleur solide : cortex entorhinal (EC; noir), gyrus dentate (DG; orange), Cornu Ammonis (CA) 3 (cyan), 2 (jaune), et 1 (magenta), et le subiculum (vert). Les voies de fibre sont montrées avec une ligne pointillée colorée : le chemin perforant médial (MPP, rouge) et latéral (LPP, bleu) (du cortex entorhinal au gyrus dentate, CA3, CA1 et subiculum), la voie de fibre moussée (MF, violet) (du gyrus bosselé au CA3) et la garantie Schaffer (SC, brun) (ipsilateral de CA3 à CA1)/voies commissaires associationnelles (AC, vert clair) (contralatéral de CA3 à CA1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Les protocoles de tranche de cerveau ont souvent comme conséquence la perte des connexions des secteurs plus éloignés de cerveau à la zoned’intérêt 5. En outre, les capillaires ne sont plusfonctionnels 5 et la circulation sanguine est privée11. En dépit de ces limitations, les tranches de cerveau sont toujours principalement employées pour l’étude des fonctions neurophysiologiques de l’hippocampe dues à un certain nombre d’avantages. Tout d’abord, l’extraction de l’hippocampe estrapide 12 et ne nécessite pas beaucoup de matériaux. Les seuls instruments essentiels comprennent un kit de dissection, un bain d’eau de laboratoire, l’accès au carbogen et un microtome vibrant (vibratome)13. D’autres atouts de la technique de tranche de cerveau sont le contournement de la barrière céphalo-cérébrale (BBB) et le lavage des molécules endogènement libérées avant le début del’expérience 5, qui permet d’étudier l’effet des drogues avec le contrôle relativement précis de dosage14. En outre, les tranches de cerveau préservent la cyto-architecture et les circuits synaptiques dans l’hippocampe15,16, où la neuroanatomie et l’environnement local avec la connectivité neuronale et les interactions neuronales-glia complexes sontpréservés 4,11,17. En outre, les connexions hippocampiques de fibre sont principalement unidirectionnelles et les neurones hippocampal ont une plasticité synaptique élevée, qui simplifie énormément la collection et l’interprétation des enregistrements électrophysiologiques de haute qualité afin de comprendre des processus neurologiques18,19. Fait important, les tranches de cerveau présentent un atout précieux applicable dans un large éventail de techniques scientifiques différentes, allant des techniques biologiques moléculaires aux enregistrements d’imagerie jusqu’aux mesures électrophysiologiques12,20,21,22,23,24,25,26.
Comme indiqué ci-dessus, les tranches de cerveau hippocampal présentent un outil expérimental puissant pour étudier les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de la connectivité synaptique. Cela offre la possibilité d’évaluer les effets des produits chimiques ou des mutations sur l’excitabilité neuronale et la plasticité16.
Les préparations aiguës en tranches cérébrales présentent une technique relativement sensible et la qualité optimale des tranches dépend fortement de conditions expérimentales idéales, y compris l’âge de l’animal, la méthode d’euthanasie, la vitesse de dissection et de tranchage, les solutions et paramètres de tranchage (p. ex., la vitesse de tranchage) ainsi que les conditions de récupérationdes tranches 4. Par conséquent, un protocole bien conçu est d’une importance absolue et assure la reproductibilité entre les différentes unités de recherche13.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour les préparations horizontales aiguës de tranche d’hippocampe, dans le but de préserver l’intégrité du chemin latéral et médial hippocampal de perforant et de la voie mossy de fibre, permettant l’investigation des processus liés au gyrus debosselé 9. Nous décrirons en détail les étapes clés pour disséquer, extraire et trancher horizontalement le cerveau murin, suivis des résultats représentatifs des enregistrements calcium-microfluorimétriques et des enregistrements potentiels postsynaptiques excitatifs sur le terrain (FEPSP) dans des conditions de base et pendant les protocoles d’induction du LTP dans des tranches cérébrales de souris sauvages de type C57BL/6J.

<table><tbody><tr><td>Chambre d’anesthésie</td><td>faite maison - Générique</td><td>N/A</td><td>Plexiglas</td></tr><tr><td>Vaporisateur d’anesthésie</td><td>Dr&auml ; ger & MSS International Ltd</td><td>Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane</td><td>pour vaporiser de l’isoflurane pour l’anesthésie des rongeurs</td></tr><tr><td>Barils pour le système de perfusion</td><td>TERUMO</td><td>Seringues hypodermiques sans aiguille</td><td>https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html</td></tr><tr><td>Méthiodide biculline</td><td>hellobio</td><td>HB0893</td><td>https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html</td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilcate</td><td>Science Products</td><td>GB150F-8P</td><td>https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Merck</td><td>102382</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Logiciel d’imagerie calcique</td><td>Till Photonics</td><td>LiveAcquisition v2.3.0.18</td><td></td></tr><tr><td>Réservoir de carbogen</td><td>Air Liquide</td><td>Alphagaz mix B50</td><td>Mélange de gaz CO2/O2 : 5/95, pureté 5</td></tr><tr><td>Microélectrode en grappe</td><td>FHC</td><td>CE2C55</td><td>https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/</td></tr> <tr><td>Boîte de culture (35 mm)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353001</td><td>https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon&reg;-Cell-Culture-Dishes/p/353001</td></tr><tr><td>Plat de culture (90 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20</td></tr><tr><td>Pince courbe</td><td>Outils pour les sciences fines</td><td>11270-20</td><td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20</td></tr><tr><td>D-AP5</td><td>hellobio</td><td>HB0225</td><td>https://www.hellobio.com/dap5.html</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose monohydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16301</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Caméra numérique CMOS</td><td>HAMAMATSU</td><td>ORCA-SPARK C11440-36U</td><td>https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection</td><td>Outils Fine Science</td><td>14058-09</td><td>https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut&reg;/14058-09</td></tr><tr><td>DNQX</td><td>hellobio</td><td>HB0262</td><td>https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html</td></tr><tr><td>Caméra EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon TM + DU-897E-CSO-#BV</td><td>https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE</td></tr><tr><td>EPC10 Amplificateur USB Double Patch Clamp HEKA</td><td>Elektronik</td><td>895278</td><td>https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf</td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>VWR</td><td>516-0818</td><td>grade 413</td></tr><tr><td>Pinceau fin</td><td>Raphaël Kaerell</td><td>8204</td><td>Taille #1</td></tr><tr><td>18G aiguille</td><td>Henke Sass Wolf Fine-Ject</td><td>18G X 1 1/2" 4710012040</td><td>https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/</td></tr> <tr><td>Isoflurane</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>Iso-Vet 1000mg/g</td><td>Flacon de 250 ml</td></tr><tr><td>Loctite 406</td><td>Henkel Adhesive technologies</td><td>Loctite 406</td><td>Super colle</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Merck</td><td>105886</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-10 avec système de télécommande SM-7</td><td>https://www.luigs-neumann.org</td></tr><tr><td>Microscope (pour l’imagerie calcique)</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/</td></tr> <tr><td>Microscope (pour les enregistrements d’ephys)</td><td>Zeiss</td><td>Axio Examiner.A1</td><td>https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/</td></tr><tr><td>Source lumineuse de microscope</td><td>CAIRN Research</td><td>double alimentation OptoLed</td><td>https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/</td></tr> <tr><td>Monochromateur</td><td>Till Photonics</td><td>Polychrome V</td><td></td></tr><tr><td>Acide N-méthyl-D-aspartique (NMDA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3262</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Oregon Green&reg ; 488 BAPTA-1</td><td>Sondes moléculaires Invitrogen</td> <td>#06807</td><td>Osmomètre 10x50ug</td></tr><tr><td>Osmomètre</td> à pression de vapeur <td>Wescor</td><td>5500</td><td>pour vérifier l’osmolarité des solutions salines</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>Masterflex C/L 77120-62</td><td>https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229</td></tr><tr><td>pH-mètre</td><td>WTW</td><td>inoLab series pH 720</td><td>https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf</td></tr><tr><td>Extracteur de pipette</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Chem-lab</td><td>CL00.1133</td><td>https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528</td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>Merck</td><td>104873</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Lame de rasoir pour préparer les hémisphères</td><td>SPI fournit</td><td>Distributeur de cartouche de sécurité - Pqt/10</td><td>GEM Scientific Lames de rasoir à bord unique</td></tr><tr><td>Lame de rasoir pour vibratome</td><td>Ted Pella Inc</td><td>121-6</td> lames de <td>rasoir à double tranchant de style cassable (acier inoxydable revêtu de PTFE)</td></tr><tr><td>Chambre de récupération</td><td>faite maison - Générique</td><td>N/A</td><td>pour collecter et stocker les tranches de cerveau (voir détails dans le manuscrit)</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Toute entreprise</td><td>N/A</td><td>La lame doit être bien affûtée et d’au moins 15 cm de long pour une décapitation facile</td></tr><tr><td>Fil d’électrode en argent</td><td>Toute entreprise</td><td></td><td>pour l’enregistrement et les électrodes de référence</td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de sodium dihydraté</td><td>Merck</td><td>106342</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium</td><td>Alfa Aesar</td><td>14707</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/014707/</td></tr> <tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3160/60</td><td>https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420</td></tr><tr><td>Logiciel pour les enregistrements sur le terrain</td><td>HEKA Elektronik</td><td>PatchMaster</td><td>https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf</td></tr><tr><td>Spatule</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9147-12EA</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr> http://www.ampi.co.il/isoflex.html <tr><td>Sucrose</td><td>VWR International Ltd.</td><td>102745C</td><td>https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf</td></tr><tr><td>Tubes pour conduites de carbofen, de perfusion et d’aspiration 1</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0167</td><td>Tubes Tygon (TY-50) pour systèmes de vannes standard</td></tr><tr><td>Tubes pour conduites de carbogène, de perfusion et d’aspiration 2</td><td>Fisher Scientific</td><td>800/100/200 & 800/100/280</td><td>Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE</td></tr><tr><td>Tubing Pompe</td> <td>à videfait maison - Générique</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Système de perfusion multi-barils à 8 soupapes</td><td>fait maison</td><td>N/A</td><td>se compose de barils, de tubes et d’un contrôle automatisé des vannes fait maison (les spécifications de toutes les pièces achetées peuvent être trouvées dans ce tableau)</td></tr><tr><td>Vannes magnétiques (pour contrôler les lignes de perfusion)</td><td>NResearch Inc.</td><td>réf. 161P011</td><td>https://nresearch.com/</td></tr> <tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>14912000001</td><td>Lame vibrante semi-automatique microomei VT1200 Bain-marie</td></tr><tr><td></td><td>Memmert</td><td>WNB 7</td><td>https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf</td></tr><tr><td>Système de purification d’eau</td><td>Merck</td><td>Synergy millipore</td><td>pour obtenir une eau hautement purifiée</td></tr><tr><td>12 puits plaques</td><td>Greiner Bio-One</td><td>CELLSTAR, 665180</td><td>http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf</td></tr></tbody></table>

tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

L’hippocampe est une structure très organisée dans le cerveau qui fait partie du système limbique et est impliqué dans la formation et la consolidation de la mémoire ainsi que la manifestation de troubles cérébraux graves, y compris la maladie d’Alzheimer et l’épilepsie. L’hippocampe reçoit un haut degré d’intra- et d’interconnectivité, assurant une bonne communication avec les structures cérébrales internes et externes. Cette connectivité se fait par différents flux d’information sous forme de voies fibre. Les tranches de cerveau sont une méthodologie fréquemment utilisée lors de l’exploration des fonctions neurophysiologiques de l’hippocampe. Des tranches hippocampal de cerveau peuvent être employées pour plusieurs applications différentes, y compris des enregistrements électrophysiologiques, des mesures microscopiques légères aussi bien que plusieurs techniques biologiques et histochimiques moléculaires. Par conséquent, les tranches de cerveau représentent un système modèle idéal pour évaluer les fonctions protéiques, pour étudier les processus pathophysiologiques impliqués dans les troubles neurologiques ainsi qu’à des fins de découverte de médicaments.
Il existe plusieurs façons différentes de préparer les tranches. Les préparations de tranches cérébrales avec un vibratome permettent une meilleure préservation de la structure tissulaire et garantissent un approvisionnement suffisant en oxygène lors du tranchage, qui présentent des avantages par rapport à l’utilisation traditionnelle d’un hachoir à tissus. En outre, différents plans de coupe peuvent être appliqués pour les préparations vibratomes de tranche de cerveau. Ici, un protocole détaillé pour une préparation réussie des tranches hippocampales horizontales vibratome-coupées des cerveaux de souris est fourni. Contrairement à d’autres préparations de tranches, le tranchage horizontal permet de maintenir les fibres du chemin d’entrée hippocampal (chemin perforant) dans un état entièrement intact dans une tranche, ce qui facilite l’étude des interactions entorhinal-hippocampal. Ici, nous fournissons un protocole complet pour la dissection, l’extraction, et le tranchage horizontal aigu du cerveau murin, et discutons des défis et des pièges potentiels de cette technique. Enfin, nous allons montrer quelques exemples pour l’utilisation de tranches de cerveau dans d’autres applications.

Vue d’ensemble générale des outils et des étapes critiques nécessaires au protocole La figure 2 présente tous les outils et les étapes critiques nécessaires à la préparation des tranches horizontales aiguës du cerveau hippocampal décrites dans ce protocole. En général, un nombre limité d’instruments clés sont nécessaires, y compris quelques outils de dissection et une chambre de récupération des tranches (figure 2A), un bain d’eau de laboratoire et un vibratome (figure 2B). La figure 2C-E visualise les étapes et les orientations importantes du cerveau et des hémisphères pendant le protocole de préparation des tranches. La figure 2F est une illustration d’un résultat attendu de tranches horizontales du cerveau.
enregistrements fEPSP dans le chemin perforant médial Après la période de récupération, les tranches de cerveau peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques de fEPSP. Ici, nous avons utilisé un microscope droit équipé d’un système de perfusion multicanal contrôlé par gravité(figure 3A et figure 3B). Une micropipette en verre (~ 2 MΩ) a été remplie de solution ACSF et fixée au-dessus d’une électrode argentée recouverte de chlorure qui est montée sur un amplificateur opérationnel en circuit avec une électrode de bain chlorée. les fEPSP ont été enregistrés et visualisés à l’aide d’un amplificateur et d’un logiciel d’enregistrement approprié en insérant la micropipette de verre dans le MPP de l’hippocampe dans la couche supérieure de la tranche cérébrale. les fEPSP ont été induits par la stimulation avec une microélectrode de faisceau à 2 contacts, appliquant différentes intensités actuelles au MPP en amont de l’électrode d’enregistrement. Notez que ce protocole n’a pas pour but d’expliquer comment obtenir les enregistrements des députés, mais utilise simplement des enregistrements dans le député comme exemple pour démontrer le succès du protocole de préparation des tranches décrit ici. Si quelqu’un tente d’effectuer des enregistrements de MPP, certains contrôles (p. ex., enregistrements d’impulsions appariés) pourraient être nécessaires pour assurer le site d’enregistrement approprié et distinguer le député provincial du PL8,36,37.
La figure 3C illustre un exemple négatif (panneau gauche, tranche de mauvaise qualité) et positif (panneau droit, tranche de haute qualité) d’un enregistrement fEPSP. La trace d’exemple négatif montre une grande amplitude de volée de fibre (FV) qui est encore plus élevée que l’amplitude réelle de fEPSP (≈0.5 mV). En revanche, l’exemple de tranche de haute qualité (panneau droit) montre un petit rapport FV/fEPSP et une amplitude fEPSP élevée (&gt;0.5 mV). La fibre de volée est le signal qui se produit lors de la dépolarisation des fibres neuronales stimulées et précède donc la potentialisation postsynaptique (fEPSP). La relation entre fv et propriétés fEPSP fournit des informations importantes sur la préservation des propriétés axonales et synaptiques. Les tranches de haute qualité avec les fibres nerveuses intactes devraient montrer un rapport élevé d’amplitude de fEPSP à FV. Au contraire, les tranches de mauvaise qualité ayant des propriétés de conduction altérées auront un rapport fEPSP/FV diminué. De même, la viabilité d’une tranche de cerveau peut être analysée en traçant les pentes fEPSP par rapport aux amplitudes de volée de fibre (Figure 3D).
De plus, les courbes input-output (pente fEPSP et amplitude FV par rapport à l’intensité du stimulus) sont utilisées de façon standard afin de déterminer la qualité des tranches. Ces courbes sont obtenues en appliquant des stimuli actuels croissants à la tranche du cerveau et en surveillant les réponses suivantes fEPSP. Les tranches de cerveau de mauvaise qualité montrent une courbe d’entrée-sortie réduite due aux propriétés de conduction sous-optimales du tissu cérébral mal préservé(figure 3E,F). En outre, des courbes input-output sont nécessaires pour définir la plage d’intensité de stimulation idéale pour l’étude des processus synaptiques. Idéalement, l’intensité de stimulus devrait être réglée autour de 50% de l’intensité pour des réponses maximales. À cette intensité de stimulus choisie, les réponses fEPSP sont très sensibles à tout changement dans la plasticité synaptique, qui offre la possibilité d’étudier à la fois la potentialisation à long terme (LTP) et la dépression à long terme (LTD).
Afin d’étudier la plasticité synaptique, la transmission synaptique de la tranche du cerveau (pente fEPSP) à l’intensité de stimulus choisie de 50% est surveillée pendant une plus longue période de temps (généralement entre 20-40 min) avant la phase de conditionnement. Les tranches de cerveau viables auront des lignes de base stables, tandis que les tranches de cerveau avec une ligne de base instable ne peuvent pas être utilisées pour d’autres protocoles de conditionnement afin d’étudier la plasticité synaptique des circuits cérébraux (figure 3G, panneau supérieur). les enregistrements de base fEPSP peuvent également être utiles afin de surveiller les effets des médicaments sur la transmission synaptique elle-même(figure 3G, panneau inférieur). La moyenne des signaux de base fEPSP enregistrés est généralement utilisée pour normaliser un cours du temps fEPSP et est fixée de façon standard à 100 %.
La plasticité synaptique peut être étudiée en appliquant des protocoles de conditionnement spécifiques aux tranches du cerveau. Ces protocoles dépendent du circuit cérébral étudié et du mécanisme d’intérêt (p. ex., LTP ou LTD). Afin d’induire le LTP dans le MPP du gyrus de bosselé, un protocole de conditionnement fort est nécessaire en raison de l’inhibition gabaergique forte qui est présente aux synapses de MPP38. Il est rapporté que l’inhibition GABAergic est encore plus prononcée dans les tranches de cerveau préparées avec des solutions de tranchage à hautsaccharose 39. Ici, nous utilisons un protocole composé de quatre stimulations de 1 s de long 100 impulsions Hz appliquées dans un intervalle de 5 min tout en étant traité avec le GABAA antagoniste des récepteurs Bicuculline (Figure 3H). La co-addition de NMDA et bicuculline pendant la période de conditionnement se traduit par une augmentation du LTP(figure 3H). La mauvaise qualité de la tranche et la transmission synaptique instable (base fEPSP) pourraient entraîner une modification ou l’induction infructueuse du LTP et de l’LTD. Par conséquent, il est d’une grande importance de travailler avec des préparations de tranches de haute qualité et d’utiliser des critères d’exclusion rigoureux (faible amplitude fEPSP par rapport à la fibre de volée (&lt;3), petite pente fEPSP (&lt;0.5 mV/ms) ou amplitude (&lt;0.5 mV) et instable fEPSP de base (changement de plus de 5%) pour les tranches non viables lors de l’étude des processus synaptiques.
Mesures microfluorimétriques du calcium dans la couche de cellules granulés du gyrus dentate Après rétablissement, une tranche de cerveau a été incubée à température ambiante avec 2 μM d’un colorant calcium-sensible pendant 1 h dans ASCF carbogenated, protégé de la lumière. La tranche a été transférée dans une chambred’enregistrement (figure 3A)sur un microscope à fluorescence verticale équipé d’un système de perfusion multicanal contrôlé par gravité. Des images d’émission de fluorescence ont été acquises toutes les 500 millisecondes après illumination à 488 nm(figure 4A,B). Excitation a été fait avec une lampe xénon et un scanner monté diffraction râpant monochromator et l’acquisition d’image a été effectuée avec une caméra CCD contrôlée par ordinateur. Pendant les mesures, la tranche a été traitée avec l’antagoniste de récepteur de NMDA APV, qui a eu comme conséquence une diminution de la concentration intracellulaire de calcium. La stimulation de la tranche avec une solution extracellulaire contenant une forte concentration de potassium (50 mM) a entraîné un afflux massif de calcium extracellulaire en raison de la dépolarisation des neurones et de l’ouverture de canaux irionaux à portail de tension (figure 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>composé</td>
			<td>Concentration (mM)</td>
			<td>Poids moléculaire (g/mol)</td>
			<td>Montant (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>25</td>
			<td>74.55</td>
			<td>1.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>20</td>
			<td>147.01</td>
			<td>2.94</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>246.48</td>
			<td>2.46</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>12.5</td>
			<td>136.08</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Pré-solution de tranche de 10 x (1 L).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>composé</td>
			<td>Concentration (mM)</td>
			<td>Poids moléculaire (g/mol)</td>
			<td>Montant (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl (NaCl)</td>
			<td>125</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>74.55</td>
			<td>0.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2 * 2H2O</td>
			<td>2</td>
			<td>à partir de 1 M CaCl2 solution</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4 * 7H2O</td>
			<td>1</td>
			<td>à partir de 1 M MgSO4 solution</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4 * 2H2O</td>
			<td>1.25</td>
			<td>156.02</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>2.18</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose * H2O</td>
			<td>25</td>
			<td>198.17</td>
			<td>4.95</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : 1x ACSF (1 L) (osmolarité entre 305 et 315 mOsm).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>composé</td>
			<td>Concentration (mM)</td>
			<td>Poids moléculaire (g/mol)</td>
			<td>Montant (g)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Présolution de 10 x tranches</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>25 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>saccharose</td>
			<td>252</td>
			<td>342.3</td>
			<td>21.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>26</td>
			<td>84.01</td>
			<td>0.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucose * H2O</td>
			<td>10</td>
			<td>198.17</td>
			<td>0.49</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 3 : 1x solution de tranche de saccharose haute (250 mL) (osmolarité entre 320 et 325 mOsm).
<img alt="Configuration expérimentale et orientation de la coupe pour la section du cerveau ; Comprend des outils de dissection, un microtome, des diagrammes." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig02v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Renseignements détaillés sur la préparation des tranches horizontales du cerveau hippocampal. (A) Image des outils nécessaires à la dissection et au tranchage du cerveau des rongeurs : a) ±2 cm de long et ±0,5 cm de large sangles de papier filtre (p. ex., grade 413); b) lame; c) super colle; d) pointe pipette; e) plaque de spécimen (est livré avec vibratome); f) plat de culture de 35 mm; g) brosse fine; h) spatule; (i) forceps incurvés; j) ciseaux de dissection; k) ciseaux solides (longueur de lame supérieure à 10 cm); l) pipette Pasteur en plastique à ouverture large (entre 0,6 et 0,8 cm de diamètre); m) chambre de récupération (self-made avec bécher de 250 mL, anneau en plastique, maille de nylon, morceau d’une pipette sérologique de 10 mL); n) plat de culture de 90 mm rempli de glace et (o) carré de papier filtre sur le plat de culture réfrigéré. (B) Image d’un vibratome avec (a) support de chambre de tranche remplie de glace ; b) chambre de tranche; c) ligne de carbogen et (d) lame de rasoir de coupe. (C) Dessin animé illustrant l’orientation de la coupe du côté dorsal d’un hémisphère afin de préparer le cerveau pour le tranchage horizontal (voir étape 3.9). (D) Projection isométrique de l’orientation cérébrale sur la plaque de spécimen du vibratome. (E) Dessin animé illustrant une vue supérieure de la position des deux hémisphères sur la plaque du spécimen. (F) Dessin animé montrant la position de l’hippocampe dans une tranche horizontale du cerveau. Les régions de gyrus dentate (DG) et Cornu Ammonis (CA)-Subiculum (SB) de l’hippocampe sont indiquées. (G) Image d’une chambre de récupération avec ACSF carbogenated contenant dix tranches horizontales fraîchement tranchées de cerveau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Diagrammes d’expériences en neurosciences montrant le placement des électrodes, graphiques de volée de fibres et analyse des effets des médicaments." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig3v5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Enregistrements électrophysiologiques de tranches de cerveau hippocampal. (A) Image d’une chambre d’enregistrement avec perfusion et aspiration, utilisée sous un microscope droit. Une tranche de cerveau sera placée dans la chambre et immobilisée avec un morceau d’un trombone avant le début des enregistrements. (B) Image lumineuse de champ d’une tranche hippocampal de cerveau sous un microscope droit (objectif de 10x). Les électrodes dentate gyrus (DG) et CA3 sont indiquées ainsi que la stimulation (en bas à gauche) et l’enregistrement (en bas à droite) des électrodes, ciblant le chemin perforant médial lors des enregistrements fEPSP. (C) Gauche : représentation d’une tranche de mauvaise qualité exemple d’enregistrement fEPSP avec une volée de fibre robuste et une petite amplitude. Droite : exemple de tranche de haute qualité d’un enregistrement fEPSP. La ligne grise indique le niveau de base. Les lignes pointillées soulignent l’amplitude de coupure de 0,5 mV. (D) Parcelle de la pente fEPSP par rapport à l’amplitude FV pour la haute qualité (noir; n =10) et les tranches de cerveau de mauvaise qualité (gris; n =4). Données représentées comme moyenne ± SEM. (E) Parcelle input-output (pente fEPSP) pour différentes intensités de stimulation (μA) pour les tranches de haute qualité (noir; n = 10) et les tranches de faible qualité (gris; n = 4)). (F) Même que dans (E) mais pour les amplitudes FV par rapport aux intensités de stimulus. (G) Cours du temps de trois enregistrements fEPSP de base différents (pente de fEPSP en %; normalisé à la pente moyenne fEPSP des 5 premières minutes). Le panneau supérieur représente un exemple positif (noir) et négatif (rouge), où ce dernier a une ligne de base instable en raison de l’omission du carbogen pendant l’enregistrement. Le panneau inférieur montre deux enregistrements de ligne de base stables dans traité (après 20 min de ligne de base stable, les récepteurs AMPA ont été bloqués par l’application de l’antagoniste des récepteurs AMPA DNQX (10 μM)) (bleu) et de l’état non traité (noir). (H) Cours du temps des enregistrements LTP pour différentes conditions de traitement (indiqué dans le panneau inférieur). Couleur noire pour l’application de bicuculline (20 μM) pendant le conditionnement et bleu pour la co-application de Bicuculline (20 μM) et NMDA (10 μM) pendant le conditionnement. Les flèches dans le panneau supérieur indiquent les points de temps où la stimulation à haute fréquence a été appliquée (4 x 1 de 100Hz). Graphique à barres dans le panneau inférieur représente les pentes moyennes fEPSP (%) pendant 50-60 min après l’induction LTP des expériences montrées dans le panneau supérieur (enregistrement représentatif unique pour chaque condition). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig3v3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Imagerie de fluorescence CA3 de l’hippocampe, analyse du ROI, graphique d’intensité de fluorescence, activité synaptique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61753/61753fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Microfluorimétrie calcium des tranches de cerveau hippocampal. (A et B) Image de fluorescence (excité à 488 nm) (A) et carte thermique correspondante (B) d’une tranche horizontale du cerveau hippocampal du cerveau de la souris. Le gyrus dentate (DG), la région CA3, et un exemple d’une région d’intérêt (ROI) sont indiqués dans le panneau A. (C) Cours du temps des réponses de calcium (F488 nm)d’un roi dans le gyrus dentate d’une tranche hippocampal aiguë de cerveau pendant le traitement avec l’antagoniste de récepteur de NMDA APV (50 μM) et solution contenant le potassium extracellulaire élevé (K+) (50 mM). La trace est normalisée à la réponse la plus élevée de calcium pendant la perfusionélevée de K + et est la ligne de base corrigée pour le photobleaching. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61753/61753fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Cet article vise à décrire un protocole systématique pour obtenir des tranches horizontales de cerveau hippocampal chez la souris. L’objectif de cette méthodologie est de préserver l’intégrité des voies de fibre hippocampal, telles que le chemin perforant et le tractus de fibre moussée pour évaluer les processus neurologiques liés au gyrus dentate.

Tranches hippocampiques horizontales du cerveau de souris

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Ce protocole facilite la préparation de coupes horizontales de cerveau d’hippocampe pour leur utilisation dans diverses applications scientifiques. Cette technique préserve l’intégrité de toutes les voies des fibres de l’hippocampe au sein d’une seule tranche d’hémisphère. Ce protocole de coupe est parfaitement adapté pour évaluer les changements neurologiques qui se produisent sur les pathologies cérébrales qui se développent et se manifestent dans le gyrus denté.L’aspect le plus important de ce protocole est de trouver l’équilibre entre une exécution aussi rapide que possible et la manipulation douce du tissu cérébral. Pour préparer un litre d’ACSF, mélangez lentement tous les produits chimiques solides comme indiqué dans 800 millilitres d’eau en agitation constante avec une barre d’agitation magnétique avant de verser lentement les volumes appropriés de sulfate de magnésium et de chlorure de calcium. Ensuite, utilisez un osmomètre à pression de vapeur pour valider l’osmolarité entre 305 et 315 milliosmole et faites bouillir en continu la solution ACSF à température ambiante avec du carbogène pour régler le pH entre 7,3 et 7,4.Pour préparer 250 millilitres de solution de tranche à haute teneur en saccharose, ajoutez les composés à 25 millilitres de solution pré-tranchée comme indiqué dans le tableau et vérifiez que l’osmolarité est comprise entre 320 et 325 milliosmole. Ensuite, faites bouillir la solution de tranche à haute teneur en saccharose pendant 10 à 15 minutes avec du carbogène pour fixer le pH entre 7,3 et 7,4 et conservez la solution en tranches à haute teneur en saccharose pendant 20 à 30 minutes à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit partiellement congelée. Pour préparer un espace de travail pour la dissection, remplissez une chambre de récupération avec une solution d’ACSF carbogéné et placez la chambre dans un bain-marie à 32 degrés Celsius.Réglez le vibratome sur le programme de coupe approprié et remplissez le support de glace, montez-le sur le vibratome et fixez une lame au bras du vibratome. À l’aide d’une spatule, écraser et mélanger la solution de tranches de saccharose partiellement congelée jusqu’à l’obtention d’une gadoue hétérogène. Ensuite, faites buller la solution avec du carbogène et utilisez la solution pour hydrater un morceau de papier filtre sur un plat de culture réfrigéré de 90 millimètres et remplissez un plat de culture de 35 millimètres sur de la glace.Pour prélever le cerveau, utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir le cuir chevelu d’une souris mâle âgée de deux à six semaines et pour ouvrir la calvaria le long de la suture sagittale. Utilisez une pince incurvée pour retirer le crâne jusqu’à ce que tout le cerveau, y compris les bulbes olfactifs, soit visible et utilisez une spatule pour retirer soigneusement le tissu cérébral intact. Placez le cerveau dans la boîte de culture de 35 millimètres et utilisez une pipette Pasteur remplie d’une solution de tranche à haute teneur en saccharose pour retirer délicatement les cheveux ou les particules de sang du tissu.Utilisez la spatule pour transférer la cervelle nettoyée sur le morceau de papier filtre trempé et utilisez une lame pour couper la cervelle longitudinalement en deux. Placez les deux hémisphères sur le côté médial fraîchement coupé et utilisez la lame pour faire une coupe parallèle sur le haut dorsal de chaque hémisphère pour retirer la région dorsale de chaque morceau de cerveau. Placez les deux hémisphères sur la face dorsale fraîchement coupée avec la partie ventrale du cerveau vers le haut et placez une goutte de super colle sur une plaque d’échantillon.Utilisez une pointe de pipette pour étaler la colle dans une grande zone afin d’accueillir les deux morceaux de tissu et touchez un morceau de sangle de papier filtre sur la face ventrale d’un hémisphère. À l’aide d’une autre sangle en papier filtre, faites demi-sécher soigneusement la face dorsale du cerveau et placez la face dorsale de l’hémisphère vers le bas sur la colle sur la plaque d’échantillon. Utilisez deux sangles de papier filtre supplémentaires pour positionner le deuxième hémisphère sur la colle comme nous venons de le démontrer et placez la plaque d’échantillon dans la chambre de tranchage.Ensuite, recouvrez rapidement mais soigneusement l’assiette de gadoue glacée à haute teneur en tranches de saccharose. Pour acquérir des sections du tissu cérébral, positionnez la lame du vibratome devant la face médiale des hémisphères et soulevez la table du vibratome de manière à ce que la lame soit à la même hauteur que les côtés ventraux des hémisphères, qui sont maintenant orientés vers le haut. Utilisez la commande du vibratome pour abaisser la lame de 600 microns plus loin dans la direction dorsale et coupez le tissu jusqu’à ce que les deux premières tranches soient complètement séparées des deux hémisphères.Lorsque les deux premières tranches de tissu ont été obtenues, inversez le sens de coupe et abaissez la lame de 300 microns supplémentaires avant de trancher à nouveau. Lorsque l’hippocampe devient visible, utilisez une pipette Pasteur en plastique élargie pour recueillir et transférer les tranches dans la chambre de récupération du bain-marie. Laissez les tranches dans la chambre de récupération remplie d’ACSF pendant une heure, puis placez la chambre de récupération à température ambiante pendant 30 minutes avant d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques des échantillons de tissus.Ici, des enregistrements représentatifs de potentiel post-synaptique excitateur de champ négatif et positif à partir de coupes de faible et de haute qualité respectivement peuvent être observés. La trace d’exemple négative présente une grande amplitude de volée de fibres lors de la dépolarisation des fibres neuronales stimulées qui est encore plus élevée que l’amplitude réelle de fEPSP, tandis que la trace de haute qualité présente un faible rapport volée de fibres/fEPSP et une amplitude fEPSP élevée. La viabilité d’une tranche de cerveau peut également être analysée en traçant les pentes du potentiel post-synaptique excitateur du champ en fonction des amplitudes de la volée de fibres.Les courbes d’entrée/sortie qui sont généralement utilisées pour déterminer la qualité de la tranche peuvent être obtenues en appliquant des stimuli de courant croissants à la tranche de cerveau et en surveillant les réponses fEPSP ultérieures. En raison des propriétés de conduction sous-optimales du tissu cérébral mal conservé, les coupes de cerveau de mauvaise qualité présentent des courbes d’entrée/sortie réduites. Les tranches de cerveau viables ont des lignes de base de transmission synaptique stables, tandis que les tranches de cerveau avec une base instable ne peuvent pas être utilisées pour d’autres protocoles de conditionnement afin d’étudier la plasticité synaptique des circuits cérébraux.Les enregistrements de base de la fEPSP peuvent également être utiles pour surveiller les effets des médicaments sur la transmission synaptique elle-même. De plus, les tranches de cerveau peuvent être utilisées en combinaison avec un indicateur de calcium pour acquérir des enregistrements d’imagerie par fluorescence et pour étudier les influx de calcium dans différentes conditions de coupe ou de traitements. Assurez-vous que la dissection cérébrale est effectuée dans un délai maximum de 1,5 minute après le sacrifice, ce qui garantit que le tissu cérébral n’est que brièvement sans refroidissement et sans apport d’oxygène.Les coupes de cerveau de l’hippocampe ont de nombreuses applications différentes, des techniques de biologie moléculaire à l’électrophysiologie. Cette procédure facilite l’investigation intensive de l’anatomie de l’hippocampe et des processus neurologiques.

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Neurosciences

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