Approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite Corona acquis par les nanomatériaux

Ce protocole est le premier à mettre en œuvre CESI-MS pour la caractérisation non seulement de la couronne protéique, mais aussi de la couronne métabolite des nanomatériaux. CESI offre une séparation orthogonale aux méthodes LCMS traditionnelles, qui est à la fois hautement reproductible et sensible tout en utilisant seulement quelques nanolitres d’échantillon. Pour commencer, divisez deux millilitres de plasma humain en une aliquote d’un millilitre, l’une pour le métabolite et la couronne protéique, et l’autre pour la caractérisation du métabolome plasmatique.

Incuber un milligramme par millilitre de nanomatériaux dans le plasma humain pendant une heure à 37 degrés Celsius tout en mélangeant doucement à 500 rotations par minute dans un mélangeur thermique. Ensuite, granulez les nanomatériaux en les centrifugeant à 4 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Prélever le surnageant plasmatique pour l’analyse de la couronne de métabolites et conserver le complexe de couronne protéique du nanomatériau pour la caractérisation de la couronne protéique.

Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon 10X PBS et agitez vigoureusement pendant deux minutes pour éliminer les protéines non liées. Centrifugez la solution à 4 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les nanomatériaux, puis retirez soigneusement le surnageant sans perturber la cuillette. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon ABC et faites un tourbillon vigoureux pendant deux minutes pour éliminer les protéines et les sels non liés.

Répétez l’étape de centrifugation et jetez le surnageant. Dissoudre la pastille dans 20 microlitres de tampon ABC contenant 10 millimolaires de dithiothréitol pour réduire les liaisons disulfure de protéines. Incuber la solution pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius.

Ajoutez deux microgrammes de trypsine de qualité séquençage aux 20 microlitres de tampon ABC contenant 0,1 % de tensioactif, et incubez la solution de digestion à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Alkylez l’échantillon en ajoutant 20 microlitres d’iodoacétamide de 55 millimolaires dans 100 millimolaires d’ABC et incubez à température ambiante pendant 20 minutes. Ajoutez 20 microlitres d’acide chlorhydrique 0,1 molaire pour fendre le tensioactif et laissez l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante.

Enrichissez et dessalez les peptides à l’aide d’une pointe de pipette de dessalage garnie de C18, comme décrit dans le manuscrit du texte. Ensuite, lyophilisez l’échantillon et conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Prenez le plasma témoin et le surnageant de l’incubation du plasma de nanomatériaux et mettez-les sur de la glace.

Aliquote 50 microlitres de chaque échantillon dans des flacons séparés, et diluer dix fois avec de l’eau distillée. Après le vortex, déplacez 50 microlitres de cet échantillon dilué dans de nouveaux flacons. Ajoutez 200 microlitres de chloroforme, 250 microlitres de méthanol et 350 microlitres d’eau distillée et remuez vigoureusement pendant deux minutes.

Centrifugeuse à 20, 800 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Prenez 500 microlitres de surnageant et filtrez-les à travers un filtre centrifuge de trois kilodaltons pendant deux heures à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Séchez 430 microlitres de l’ultra filtrat dans un aspirateur rapide et congelez l’échantillon.

Avant d’installer les capillaires dans l’instrument CESI, vérifiez que les extrémités d’entrée et de sortie des capillaires sont intactes et qu’il n’y a pas de ruptures visibles dans le capillaire. Placez ensuite un nouveau capillaire à codage neutre dans l’instrument, en suivant les instructions du fabricant. Rincer le capillaire de séparation vers l’avant avec de l’acide chlorhydrique 100 millimolaires, puis avec du BGE, et enfin avec de l’eau distillée, en utilisant les conditions décrites dans le manuscrit du texte.

Ensuite, rincez à la fois la séparation et le capillaire conducteur avec du BGE suivi d’eau distillée, de 100 millimolaires d’acide chlorhydrique, de de l’eau distillée à nouveau et enfin de BGE. Couplez CESI au MS à l’aide de la source de nanopulvérisation et de l’adaptateur. Pour l’analyse de la couronne protéique, remettre en suspension les échantillons lyophilisés dans 20 microlitres d’acétate d’ammonium de 50 millimolaires à pH quatre.

Effectuer l’analyse CESI-MS des échantillons comme décrit dans le manuscrit textuel. Collectez des données de spectres de masse entre 250 et 2 000 m/z, avec l’acquisition de la fragmentation dépendante des 10 premières données, et rincez le capillaire entre les échantillons. Placez un nouveau capillaire en silice fondue nue dans l’instrument CESI.

Rincez le capillaire de séparation dans le sens de l’avant avec du méthanol à 100 %, puis rincez le capillaire de séparation et le capillaire conducteur avec du BGE pour assurer la formation de gouttelettes aux extrémités de sortie. Ensuite, rincez le capillaire avec de l’eau distillée, puis avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 molaire, de l’eau distillée à nouveau, et enfin avec du BGE. Couplez CESI au SEMS à l’aide de la source de pulvérisation nano et de l’adaptateur.

Pour effectuer l’analyse des métabolites corona, remettez en suspension les échantillons de plasma exposés et non exposés de nanomatériaux dans 430 microlitres d’eau distillée et agitez vigoureusement le vortex pendant deux minutes. Filtrez les échantillons à travers un filtre à membrane de 0,1 micromètre. Ajoutez cinq microlitres des étalons internes, comme mentionné dans le manuscrit du texte, à 95 microlitres de filtrat et vortex vigoureusement.

Centrifugeuse à 16, 100 fois G et quatre degrés Celsius. Effectuer l’analyse CESI-MS des échantillons comme décrit dans le manuscrit textuel. L’utilisation de CESI-MS pour la séparation et la détection protéomique et métabolomique démontre de bonnes fenêtres de séparation sur les deux capillaires pour chaque approche, permettant une caractérisation complète de la couronne biomoléculaire.

La méthode protéomique CESI-MS est capable de distinguer entre un ensemble de protéines et les concentrations de protéines dans la couronne à travers une large gamme de compositions de nanomatériaux, et peut distinguer une couronne protéique unique pour chaque nanomatériau. Cette approche métabolomique CESI-MS permet une analyse quantitative du métabolite corona et peut être utilisée pour découvrir ses empreintes digitales uniques. Bien que cette approche caractérise passivement la couronne de métabolites des nanomatériaux, elle est tout de même capable de révéler des informations intéressantes sur le rôle des métabolites dans la couronne biomoléculaire, comme l’absorption différentielle des isomères.

Cette technique permet de caractériser à la fois la protéine et la couronne de métabolites, ce qui permet de mieux comprendre comment la couronne biomoléculaire complète affecte l’absorption des nanomatériaux par les cellules.