Name: Approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite Corona acquis par les nanomatériaux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Découvrez la caractérisation de la couronne biomoléculaire des nanomatériaux par CESI-MS. Cette méthode sensible analyse simultanément les protéines et les métabolites pour mieux comprendre les interactions nanomatériaux-biofluides.

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A.J.C, J.A.T et I.L reconnaissent le financement de la Commission européenne via le projet Horizon 2020 ACEnano (Grant no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z reconnaît le financement du doctorat du China Scholarship Council (CSC, n° 201507060011). R.R reconnaît le soutien financier du programme de subventions Vidi de l’Organisation néerlandaise de la recherche scientifique (NWO Vidi 723.0160330).

L’utilisation de biofluide humain a été approuvée conformément aux directives du protocole IRB de l’Université de Leiden et de l’Université de médecine d’Innsbruck. Lorsque des biofluides humains ou animaux sont étudiés, l’approbation éthique de l’établissement de recherche est requise et a été obtenue dans le cas des résultats présentés dans le présent protocole. En outre, des rapports adéquats devraient également être effectués pour assurer la transparence et la réutilisation des données dans les travauxfuturs9,29,30.
1. Préparation des électrolytes de fond (BGE)
REMARQUE: Tous les solvants doivent être préparés dans une hotte appropriée et un équipement de protection individuelle adéquat doit être utilisé pour toutes les étapes (blous de laboratoire, gants et lunettes). À chaque étape, des flacons en plastique à faible liant sont nécessaires pour minimiser la perte d’analyte et la contamination de l’échantillon par les sels lessivés de la verrerie.
<ol><li>Préparer 10% d’acide acétique BGE (v / v), pH 2,2 sur la base quotidienne pour la métabolomique.<ol>
<li>Dans une fiole jaugée de 10 mL, ajouter 1 mL d’acide acétique, suivi de l’ajout d’eau désionisée (DI) à la ligne marquée et d’un mélange approfondi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 100 mM d’acide acétique, pH 2,9 par jour pour la protéomique.<ol>
<li>Dans une fiole jaugée de 10 mL, ajouter 57 μL d’acide acétique, suivi de l’ajout d’eau DI à la ligne marquée et d’un mélange minutieux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Préparation du NM
<ol><li>Disperser vigoureusement les NM dans l’eau en utilisant les lignes directrices publiées31,32,33. REMARQUE: Dans le développement de ce protocole, 7 NM ont été utilisés comme suit: 100 et 1 000 nm de polystyrène carboxylé ont été utilisés pour la couronne de protéines et de métabolites, respectivement. Des NM de polystyrène non modifiés de 100 nm, des NM d’anatase TiO2 de 13 nm qui n’ont pas été modifiés ou recouverts de polymères polyacrylate ou PVP et 22 nm de NM SiO2 non modifiés ont été utilisés pour les couronnes de protéines et de métabolites. Bien que la méthode ait été développée et démontrée à l’aide de ces NM, il convient de noter que cette approche serait applicable à un large éventail de compositions, de tailles, de formes et de morphologies de NM.</li>
	<li>Caractériser la taille des particules en utilisant soit la diffusion dynamique de la lumière34,35, la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif à particule unique36, l’analyse de suivi des nanoparticules37, soit la microscopie électronique à transmission et la charge de surface comme potentiel zêta à l’aide d’une taille zeta34.</li>
</ol>3. Formation de couronnes biomoléculaires
<ol><li>Diviser 2 mL de plasma humain (ou biofluide de choix) en aliquotes de 1 mL, l’une pour le métabolite et la couronne protéique et la seconde pour la caractérisation du métabolome plasmatique.</li>
	<li>Incuber 1 mg/mL de NM dans le plasma humain pendant 1 h à 37 °C tout en mélangeant doucement à 500 tr/min dans un thermomixeur. Après l’incubation, centrifugez l’échantillon à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN.</li>
	<li>Recueillir le surnageant plasmatique pour l’analyse de la couronne des métabolites. Conserver le complexe corona de la protéine NM pour la caractérisation de la couronne protéique.</li>
</ol>4. Isolement de la couronne protéique
<ol><li>Resuspendez le complexe NM-protéine (la pastille) dans 1 mL de tampon PBS 10x et vortexez vigoureusement pendant 2 min pour éliminer les protéines non liées. Centrifuger la solution PBS à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN, et retirer soigneusement le surnageant sans perturber la pastille.</li>
	<li>Resuspendez la pastille dans 1 mL de tampon de bicarbonate d’ammonium (ABC) (100 mM, pH 8,0) et vortexez vigoureusement pendant 2 min pour éliminer les protéines non liées et les sels indésirables. Centrifuger à 4 000 x g pendant 15 min à 4 °C pour granuler les MN; retirer et jeter le surnageant. Répétez cette étape.</li>
	<li>Réduire les liaisons disulfure protéique en dissolvant la pastille de protéine NM dans 20 μL de tampon ABC (100 mM pH 8) contenant 10 mM de dithiothérapeute. Incuber la solution de réduction pendant 30 min à 56 °C.</li>
	<li>Pour digérer les protéines, ajouter 2 μg de trypsine de qualité séquençage à 20 μL d’ABC contenant 0,1% de tensioactif. Incuber la solution de digestion pendant 16 h à 37 °C.</li>
	<li>Alkyler l’échantillon par addition de 20 μL d’iodoacétamide à 55 mM dans 100 mM d’ABC et incuber à température ambiante pendant 20 min.</li>
	<li>Ajouter 20 μL de 0,1 M HCl pour cliver le tensioactif et laisser agir pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Enrichir et dessaler les peptides à l’aide d’une pointe de pipette de dessalement emballée en C18.<ol>
<li>Mouiller la pointe avec 80 μL 0,1% d’acide formique 50% acétonitrile 5 fois, nettoyer avec 80 μL 0,1% d’acide formique 5 fois, prélever et éluer l’échantillon 10 fois, dessaler l’échantillon en rinçant 80 μL 0,1% d’acide formique 5 fois et éluer l’échantillon 2 fois avec 80 μL 0,1% d’acide formique 70% acétonitrile dans un tube PCR propre à faible liaison.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lyophiliser les échantillons et les conserver à -20 °C jusqu’à analyse.</li>
</ol>5. Isolement de la couronne métabolite
<ol><li>Prenez le plasma témoin et le surnageant de l’incubation du plasma NM de l’étape 3.3 et conservez-le sur la glace pendant la préparation de l’échantillon.</li>
	<li>Prendre 50 μL de chacun dans des flacons séparés et diluer 1 sur 10 avec de l’eau DI. Prendre 50 μL de chaque échantillon dilué et passer à de nouveaux flacons pour l’étape 5.3.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de chloroforme, 250 μL de méthanol et 350 μL d’eau DI et mélanger vigoureusement le vortex pendant 2 min. Centrifuger pendant 10 min à 20 800 x g à 4 °C.</li>
	<li>Prélever 500 μL de surnageant et filtrer à travers un filtre centrifuge de 3 kDa pendant 2 h à 10 000 x g à 4 °C. Prendre 430 μL d’ultrafiltrat et sécher dans un aspirateur rapide. Les échantillons peuvent maintenant être congelés avant l’analyse.</li>
</ol>6. Préparation du système CESI-MS38
REMARQUE: Avant l’installation des capillaires, vérifiez que l’extrémité d’entrée et de sortie des capillaires est intacte et qu’il n’y a pas de bris visibles dans le capillaire.
<ol><li>Installation d’un capillaire à revêtement neutre pour l’analyse de la couronneprotéique 39.<ol>
<li>Placez un nouveau capillaire à revêtement neutre (90 cm de longueur avec un diamètre intérieur de 30 μm) dans l’instrument CESI en suivant les directives du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des capillaires CESI pour l’analyse protéomique.<ol>
<li>Rincer le capillaire de séparation dans la direction avant en utilisant 100 mM de HCl pendant 5 min à 100 psi et vérifier la formation de gouttelettes à la sortie du capillaire. Rincer les capillaires de séparation avec BGE à 100 psi pendant 10 min, puis DI de l’eau à 100 psi pendant 30 min (cela n’est nécessaire que pour les nouveaux capillaires).</li>
		<li>Rincer à la fois le capillaire de séparation et le capillaire conducteur avec du BGE à 90 psi pendant 5 min et assurer la formation de gouttelettes à l’extrémité de sortie des deux capillaires.</li>
		<li>Rincer le capillaire de séparation avec de l’eau DI à 90 psi pendant 10 min, puis 50 psi pendant 10 min avec 0,1 M HCl, suivi à nouveau de 90 psi pendant 10 min avec de l’eau DI et enfin BGE à 90 psi pendant 10 min. Couplez CESI à la SEP à l’aide d’une source de nanopulvérisation et d’un adaptateur comme décrit précédemment38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Installation d’un capillaire de silice fondue nue pour la caractérisation de la couronne de métabolites38.<ol>
<li>Placez un nouveau capillaire de silice fondue nue (90 cm de longueur avec un diamètre interne de 30 μm) dans l’instrument CESI conformément aux directives du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation des capillaires CESI pour l’analyse métabolomique.<ol>
<li>Rincer le capillaire de séparation dans la direction avant en utilisant 100% MeOH à 50 psi pendant 15 min et vérifier la formation de gouttelettes à la sortie du capillaire. Rincer à la fois le capillaire de séparation et le capillaire conducteur avec BGE à 90 psi pendant 5 min et assurer la formation de gouttelettes à la sortie des deux capillaires.</li>
		<li>Rincer le capillaire de séparation avec de l’eau DI à 90 psi pendant 10 min, puis 50 psi pendant 10 min avec 0,1 M NaOH, suivi à nouveau de 90 psi pendant 10 min avec de l’eau DI et enfin BGE à 90 psi pendant 10 min. Couplez CESI à l’ESI-MS à l’aide d’une source de nanopulvérisation et d’un adaptateur comme décrit précédemment. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. CE-MS pour l’analyse de la couronne protéique
<ol><li>Resuspendez les échantillons de l’étape 4.8 dans 20 μL d’acétate d’ammonium de 50 mM pH 4.0.</li>
	<li>Effectuer une injection hydrodynamique de 5 psi 10 s de l’échantillon. Séparer à l’aide d’une tension de séparation de 30 kV avec le gradient de pression suivant: 0-10 min à 1 psi, 10-35 min à 1,5 psi et 35-45 min à 5 psi en utilisant 100 mM, pH 2,9 acide acétique comme BGE.</li>
	<li>Collectez des spectres de masse compris entre 250 et 2000 m/z avec l’acquisition de fragmentation dépendante des données du top 10.</li>
	<li>Entre les échantillons, rincer capillaire avec 0,1 M HCl pendant 3 min à 100 psi et 10 min 100 psi de BGE pour la séparation capillaire et pendant 3 min à 100 psi pour le capillaire liquide conducteur.</li>
</ol>8. CESI-MS pour l’analyse de la couronne des métabolites
REMARQUE: Tous les échantillons doivent être analysés deux fois, une fois en mode positif pour la détection des cations et une fois en mode négatif pour la détection des anions. Les échantillons de plasma témoin doivent être analysés au moins 5 fois.
<ol><li>Resuspendez les échantillons de plasma exposés et non exposés au NM de l’étape 5.4 dans 430 μL d’eau DI et vortexez vigoureusement pendant 2 min. Filtrer à travers un filtre à membrane de 0,1 μm.</li>
	<li>Prendre 95 μL de filtrat et ajouter 5 μL d’étalons internes à 200 μM pour les cations (L-méthionine sulfone) et 400 μM pour les anions (acide 2,2,4,4-D4-citrique) et vortex vigoureusement. Centrifuger à 4 000 x g à 4 °C pendant 10 min avant l’analyse CESI-MS.</li>
	<li>Injecter l’échantillon hydrodynamiquement pendant 30 s (cations) et 40 s (anions) à 2 psi.</li>
	<li>Séparer les métabolites dans de l’acide acétique à 10% avec une tension de séparation de 30 kV en mode avant (cations) et inverse (anions). Le mode de séparation inverse est assisté par une pression avant de 0,5 psi sur le capillaire de séparation.</li>
	<li>Réglez le spectromètre de masse pour collecter des données en mode positif (cations) ou négatif (anions) sur la plage de masse 65-1000 m/z. Entre les échantillons, rincer les capillaires avec 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI eau et BGE à 50 psi pendant 2 min.</li>
</ol>

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</ol>

J.A.T est un employé d’AB Sciex UK Ltd qui participe en tant que partenaire industriel au projet ACEnano, J.A.T et tous les autres auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts dans ce travail.

Il s’agit de la première méthode proposée pour caractériser la couronne biomoléculaire complète incorporant des protéines et des métabolites, à partir du même échantillon, en utilisant CESI-MS. La capacité de caractériser à la fois les protéines et les métabolites à partir du même échantillon augmentera considérablement la quantité de données recueillies à partir d’une seule exposition expérimentale permettant de mieux comprendre le processus de formation de la couronne et ses impacts sur la toxicité et l’efficacité des NM en tant que nanomédicaments. De plus, CESI-MS est une plate-forme idéale pour caractériser les deux classes de biomolécules avec juste un changement de capillaire requis. À l’avenir, de nouvelles méthodes développées pour l’EC non aqueux permettront d’effectuer la lipidomique à l’aide de CE-MS40, il est donc maintenant possible d’analyser les protéines, les métabolites et les lipides à l’aide d’une seule plate-forme. Les approches conventionnelles actuelles nécessiteraient deux plates-formes LC-MS dédiées, l’une pour la couronne protéique et l’autre pour la couronne métabolite. Ainsi, cette approche peut collecter deux fois plus de données à l’aide d’une seule plateforme analytique.
Il y a quelques mises en garde à cette approche en particulier avec le métabolite corona car ce protocole propose une mesure indirecte de la couronne. En tant que tel, le problème peut survenir lorsque les niveaux de métabolites sont présents à des concentrations élevées par rapport aux NM et que la baisse subséquente de la concentration de métabolites dans la matrice est faible. Cependant, contrairement à la couronne protéique, il est peu probable qu’une approche « taille unique » pour isoler la couronne métabolite soit développée en raison de chaque NM ayant des chimies de surface uniques. À l’avenir, il est plus probable que des approches spécifiques à la NM pour isoler la couronne métabolite seront développées et validées; cela ne s’appliquera qu’à ce NM spécifique. Malgré cela, le CESI-MS restera une plate-forme très appropriée pour la caractérisation des métabolites chargés polaires, quelle que soit la façon dont ils sont isolés. Il convient également de noter que si une pastille ne se forme pas pendant les étapes de centrifugation conçues pour granuler les NT, une force centrifuge plus élevée peut être nécessaire; cela est plus susceptible de se produire avec des NM moins denses. Il est également essentiel que toutes les étapes de filtrage soient respectées dans le protocole en raison de l’alésage étroit des capillaires, ceux-ci peuvent facilement être bloqués si des particules n’ont pas été éliminées de manière adéquate de l’échantillon.
Alors que la couronne protéique est un domaine de recherche intense depuis un certain nombre d’années, la capacité de combiner cela avec la couronne métabolite est un nouveau domaine d’intérêt pour les scientifiques qui étudient l’interface bio-nano6,14. À ce jour, la majorité de ces études se sont concentrées sur la fraction lipidique non polaire du métabolite corona9,28. Cette méthode actuelle permet la caractérisation des métabolites hautement polaires et chargés dans la couronne, qui comprend des métabolites importants impliqués dans le métabolisme énergétique, la glycolyse et la synthèse de l’ADN. En conséquence, lorsqu’il est combiné avec le flux de travail protéomique, une caractérisation plus holistique de la couronne biomoléculaire est possible. Cela permet une analyse plus approfondie des interactions bio-nano à l’avenir. Cette méthode permet d’améliorer les connaissances mécanistes sur l’endocytose médiée par les récepteurs via les interactions des protéines et des métabolites avec les récepteurs membranaires. En outre, les interactions inter et intra corona entre les protéines et les petites molécules peuvent être explorées; par exemple, il a été récemment démontré que les protéines de la couronne jouent un rôle clé dans le recrutement des métabolites15. Il convient de noter que les résultats représentatifs de la figure 3 et de la figure 4 sont la quantification absolue des métabolites, mais une approche non ciblée utilisant une analyse de données multivariées pour comparer toutes les caractéristiques de la CE-MS chez les témoins par rapport au plasma exposé permettrait également d’élucider la liaison aux métabolites. Ainsi, il existe une marge de manœuvre importante pour étudier comment, et lesquels, les métabolites et les protéines influencent leur recrutement respectif dans les couronnes NM. Ces études supplémentaires peuvent aider à concevoir des couronnes pour optimiser l’administration de nanomédicaments ou découvrir d’autres obstacles à leur développement, tels que la suppression de l’action pharmaceutique en raison du blocage biomoléculaire de la couronne ou des fonctionnalités de ciblage du masquage.
CESI-MS avec ses débits à l’échelle nanométrique d’environ 20 nL / min et l’utilisation minimale de solvants organiques offre une amélioration des références vertes et économiques par rapport aux normes LC-MS et nanoLC-MS en termes d’utilisation de solvants, les principaux défis pour les études métabolomiques et protéomiques, respectivement. CESI-MS offre des résultats hautement reproductibles pour le temps de migration et la zone de pointe qui se comparent favorablement aux méthodes basées sur LC-MS11,15. De plus, par rapport à nanoLC-MS, le report n’est pas un problème dans CESI-MS. Par conséquent, un nettoyage approfondi du système entre les analyses d’échantillons n’est pas nécessaire, ce qui améliore considérablement le débit d’échantillon11.
En résumé, le flux de travail proposé est le premier à détailler une approche pour caractériser à la fois les composants protéiques et métabolites de la couronne biomoléculaire complète des NM. Cela déverrouille un nouvel aspect des interactions bio-nano, la couronne métabolite, permettant ainsi la collecte de deux fois plus de données à partir du même échantillon, permettant une compréhension plus complète des interactions à l’interface bio-nano.

Les interactions bio-nano, à l’interface entre les surfaces des nanomatériaux (NM) et les matrices biologiques à partir desquelles les biomolécules s’adsorbent sur la NM, constituent un domaine de recherche intense qui sous-tend la nanosécurité et la nanomédecine1. Cette couche de biomolécules adsorbées confère une identité biologique aux NM, de sorte que les cellules les identifient comme « soi », influençant par la suite l’absorption, la distribution et les paramètres biologiques2,3,4. La grande majorité des études bio-nano se sont concentrées sur les protéines au sein de la couronne, et ont démontré que les protéines varient quantitativement et qualitativement entre les MT de compositions différentes5. Cette variation dépend à la fois des propriétés du NM telles que la taille, la fonctionnalisation et le matériau, en plus des propriétés de la matrice biologique, y compris la composition et la teneur en sel5. Un domaine d’intérêt croissant dans l’interface bio-nano sont les métabolites qui s’adsorbent en NMs6. Plusieurs études ont démontré que, comme pour les protéines, les propriétés NM sont un facteur clé dans la détermination de la composition des métabolites dans la couronne et qu’elles peuvent influencer les résultats biologiques de l’exposition nm6,7,8.
Dans les études de la couronne biomoléculaire, il existe quatre phases distinctes à sa caractérisation, la formation de la couronne, l’isolement des biomolécules au sein de la couronne, leur détection par spectrométrie de masse qualitative ou quantitative et l’identification9. À ce jour, une gamme de techniques ont été adoptées pour isoler la couronne protéique, y compris l’ébullition dans le tampon de fonctionnement SDS-PAGE, les extractions de solvants et de sel ou la digestion directe des protéines in situ à la surface des NM. En ce qui concerne les métabolites dans la couronne, l’isolement est plus complexe avec diverses méthodes utilisant des solvants ou même la dissolution des NM proposés comme solutions8,10,11. Cependant, contrairement à la couronne protéique, il est peu probable qu’une approche « taille unique » s’applique à l’isolement des métabolites des NM, en raison du large espace chimique occupé par le métabolome et de la diversité des NM possibles. Une autre approche consiste à caractériser la matrice biologique avant et après l’exposition aux NM avec la différence dans les concentrations de métabolites attribuée à l’adsorption des métabolites sur les NM.12
Cette approche alternative serait applicable à tous les biofluides et NM et bien qu’elle nécessite deux fois plus d’analyses, elle offre par conséquent une mesure beaucoup plus précise de la couronne métabolite et ne risque pas que de faibles récupérations de métabolites de la surface NM soient confondues avec une faible liaison du métabolite spécifique.
La deuxième étape de l’analyse de la couronne biomoléculaire est la détection des biomolécules. Traditionnellement pour les protéines de la couronne, cela a été la mission de nano-LC-MS, le cheval de bataille de la protéomique; d’autres approches telles queRMN 13,1D et 2D SDS-PAGE ont également été appliquées. En ce qui concerne le métabolite corona LC-MS7,GC-MS8 et la spectrométrie de masse par perfusion directe ont été utilisés14. Cependant, une nouvelle approche a récemment commencé à gagner du terrain, à savoir l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse (CE-MS)11,15 et a été présente dans les laboratoires NM en tant que technique autonome pour caractériser diverses propriétés physiques et chimiques des NM16. CE-MS est une technique de séparation orthogonale de nanoLC-MS et GC-MS et est capable de permettre la détection de métabolites hautement polaires et chargés17,18. De plus, le CE-MS est bien adapté à l’analyse des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation et la glycosylation19,20,21,22. La dernière étape, l’identification et l’analyse des données peuvent être effectuées de plusieurs manières selon qu’une approche quantitative / qualitative ou ciblée / non ciblée est utilisée, ce qui ne relève toutefois pas du champ d’application de ce protocole.
CESI-MS, une combinaison de CE et d’une interface nanoESI, est une avancée récente dans la technologie CE utilisant une interface sans gaine. Cela permet la connexion directe de CE à très faible débit (<20 nL / min) à un spectromètre de masse à haute résolution sans dilution, ce qui améliore considérablement la sensibilité de détection23,24,25. CESI-MS permet d’analyser des échantillons à volume limité (< 10 μL) tout en maintenant une analyse très sensible26. CESI-MS se compare également favorablement aux approches nanoLC-MS traditionnelles à faible débit utilisées en protéomique et en métabolomique en termes de reproductibilité27,28, débit et de report, ce qui en fait une perspective passionnante pour la caractérisation complète de la couronne biomoléculaire.
Pour mettre en évidence le potentiel de CESI-MS pour l’analyse des interactions bio-nano, ce travail décrit la préparation de l’échantillon nécessaire pour isoler la couronne biomoléculaire NM d’un seul échantillon de plasma humain de manière à maximiser les données des aspects protéiques et métabolites de la couronne NM biomoléculaire complète. Bien que nous rendions compte de l’utilisation du plasma humain, ce protocole serait tout aussi approprié pour d’autres biofluides tels que le sérum sanguin, le milieu de culture cellulaire complet, le lysate cellulaire, le liquide céphalorachidien ou l’urine. Les analyses de ces deux composants (protéines et métabolites) seront ensuite décrites à l’aide de capillaires CESI à revêtement neutre pour la couronne protéique et de capillaires de silice fondue nue pour les métabolites cationiques et anioniques.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citrique</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Anion étalon interne</td></tr><tr><td>Acétate d’ammonium >98 %</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate d’ammonium >99,5 %</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Liquide de refroidissement à cartouche capillaire</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Flacons</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxique, utilisation dans une hotte</td></tr><tr><td>Glacial Acide acétique</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacétamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-méthionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Étalon interne</td></tr><tr><td>cation méthonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Utilisation dans une hotte</td></tr><tr><td>Microflaques</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Cartouche à surface neutre 30 &micro ; M ID x 90 cm longueur totale</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur OptiMS pour source Sciex Nanospray III</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 et B83386 pour spectromètres de masse thermiques, B85397 pour spectromètres de masse Waters, B86099 pour spectromètres de masse Bruker</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &micro ; m ID x 90 cm longueur totale</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte solution saline tamponnée 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Pointes, 100 &micro ; Lit</td><td>L Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrène 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrène carboxylé 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrène carboxylé 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (tensioactif)</td><td>Eaux</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Séquençage Grade modifié Trypsine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hydroxyde de sodium</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex Particules</td><td></td><td></td>de <td>Promethion</td> revêtues</tr> de <tr><td>TiO2 Particules de Promethion revêtues de PVP</td><td>Particules de</td><td>Promethion</td> Particules <td></td>de</tr><tr><td>TiO2 non enrobées</td><td></td><td>Particules</td><td></td> sur mesure</tr></tbody></table>

approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite corona acquis par les nanomatériaux

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

L’adsorption de biomolécules des matrices biologiques environnantes à la surface des nanomatériaux (NM) pour former la couronne présente un intérêt depuis une dizaine d’années. L’intérêt pour l’interface bio-nano provient du fait que la couronne biomoléculaire confère une identité biologique aux ND et amène ainsi le corps à les identifier comme « soi ». Par exemple, des études antérieures ont démontré que les protéines de la couronne sont capables d’interagir avec les récepteurs membranaires pour influencer l’absorption cellulaire et ont établi que la couronne est responsable du trafic cellulaire des NM et de leur toxicité éventuelle. À ce jour, la plupart des recherches se sont concentrées sur la couronne protéique et ont négligé les impacts possibles des métabolites inclus dans la couronne ou les effets synergiques entre les composants de la couronne biomoléculaire complète. En tant que tel, ce travail démontre des méthodologies pour caractériser à la fois les composants protéiques et métabolites de la couronne biomoléculaire en utilisant des approches protéomiques et métabolomiques ascendantes en parallèle. Cela comprend une digestion sur particule de la couronne protéique avec un tensioactif utilisé pour augmenter la récupération des protéines, et une caractérisation passive de la couronne métabolite en analysant les matrices des métabolites avant et après les expositions NM. Ce travail introduit l’électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse (CESI-MS) comme nouvelle technique pour la caractérisation des couronnes NM. Les protocoles décrits ici démontrent comment cesI-MS peut être utilisé pour la caractérisation fiable de la couronne protéique et métabolite acquise par les NM. Le passage au CESI-MS réduit considérablement le volume d’échantillon requis (par rapport aux approches traditionnelles de chromatographie liquide – spectrométrie de masse (LC-MS)) avec des injections multiples possibles à partir d’aussi peu que 5 μL d’échantillon, ce qui le rend idéal pour les échantillons à volume limité. En outre, les conséquences environnementales de l’analyse sont réduites en ce qui concerne la LC-MS en raison des faibles débits (<20 nL/min) dans cesi-MS et de l’utilisation d’électrolytes aqueux qui éliminent le besoin de solvants organiques.

La méthode décrite est la première à caractériser à la fois les protéines et les métabolites de la couronne biomoléculaire NM en utilisant le même échantillon de plasma humain. Cette méthode est capable de détecter &gt;200 protéines et &gt;150 métabolites, permettant ainsi de déterminer la vue d’ensemble la plus complète de la couronne biomoléculaire complète, ce qui permet une meilleure compréhension de l’attachement, de l’absorption et des impacts cellulaires des NT.
L’utilisation de CESI-MS pour la séparation et la détection de la protéomique (Figure 1) et de la métabolomique (Figure 2) montre de bonnes fenêtres de séparation sur les deux capillaires pour chaque approche.
Cette méthode est capable de distinguer les protéines de la couronne à travers un large éventail de compositions de NMs, démontrant ainsi l’applicabilité des méthodes aux NM à travers un large éventail de caractéristiques physiques et chimiques (Tableau 1).
Les empreintes digitales uniques de la couronne métabolite peuvent également être distinguées à l’aide de la branche métabolomique de cette méthodologie (Figure 3). Bien que cette approche utilise une approche passive pour caractériser la couronne du métabolite NM, elle est toujours capable de découvrir des informations intéressantes sur le rôle des métabolites dans la couronne biomoléculaire, telles que l’adsorption différentielle des isomères(Figure 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Figure 1 : Exemple d’électrophérogramme d’une séparation corona de la protéineSiO2 à l’aide de CESI-MS après une digestion sur particules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple d’électrophérogrammes ioniques extraits obtenus à partir de composés endogènes dans le plasma par CE-MS. Les composés numérotés sont les suivants: 1. Ornithine; 2. Lysine; 3. Arginine; 4. Histidine; 5. Créatine; 6. Glycine; 7. Alanine; 8. Valine; 9. Isoleucine; 10. Leucine; 11. Sérine; 12. Thréonine; 13. Asparagine; 14. Méthionine; 15. Glutamine; 16. Acide glutamique; 17. Phényl-D5-alanine; 18. Phénylalanine; 19. Tyrosine; 20. Proline; 21. Méthionine sulfone (étalon interne). Publié sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès et reproduit à partir de Zhang et al17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Tableau 1 : Analyse de la couronne protéique sur un réseau de 6 NM. Carte thermique des classes de protéines identifiées sur la silice(SiO2),le titane (TiO2), le titane coiffé de PVP (TiO2-PVP), le titane coiffé de dispex (TiO2-Dispex), le polystyrène et le polystyrène carbylé NM. Les pourcentages se réfèrent à l’abondance des protéines par rapport à la teneur totale en protéines en fonction de l’abondance des 3 principaux peptides pour chaque protéine. Compte tenu des différences observées dans les abondances relatives de protéines dans les différentes couronnes NM, il est clair que ce protocole proposé est suffisamment sensible pour différencier la couronne protéique de différents NM. Figure reproduite à partir d’une analyse CESI-MS de la couronne protéique, publiée sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Figure 3 : Analyse ciblée des métabolites cationiques dans la couronne NM. Adsorption des cations enSiO2 etTiO2 NMs. Le rouge fait référence à la concentration initiale de métabolites tandis que le bleu fait référence à la concentration de métabolites après une incubation de 1 h avec les NM à 37 °C. La réduction de la concentration de métabolites dans la solution est le résultat de l’adsorption de métabolites à la surface du NM. Aucune adsorption significative des métabolites n’a été observée pour les NM de polystyrène. Les diagrammes de boîte représentent les valeurs minimales et maximales, les plages médiane et interquartile. Figure reproduite à partir d’une analyse ciblée CESI-MS du métabolite corona publiée sous une licence Creative Commons CC BY en libre accès15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Figure 4 : Analyse ciblée des métabolites anioniques dans la couronne NM en mettant l’accent sur l’adsorption des isomères. L’adsorption des anions sur une gamme de NM de titane montre des différences claires entre divers isomères tels que les phosphates de sucre. Le rouge fait référence à la concentration initiale de métabolites tandis que le bleu fait référence à la concentration de métabolites après une incubation de 1 h avec le NM à 37 °C. La réduction de la concentration de métabolites en solution est le résultat de l’adsorption des métabolites à la surface du NM. Aucune adsorption significative des métabolites n’a été observée pour leSiO2 et le polystyrène NMs. Les diagrammes de boîte représentent les valeurs minimales et maximales, les plages médiane et interquartile. Figure reproduite à partir d’une analyse ciblée CESI-MS du métabolite corona publiée sous une licence Creative Common CC BY en libre accès15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analyte</td>
			<td>Zone de crête RSD moyenne</td>
			<td>Temps moyen de migration RSD</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptides intraday (n= 3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cations intra-journaliers (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 cations inter-jours (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Reproductibilité des répliques techniques cesi-MS pour les peptides et les métabolites cationiques. DSR : écart-type relatif, comme mesure de la reproductibilité. La reproductibilité du CESI-MS en termes de zones de pointe et de temps de migration est très bonne, tous les analytes ayant une DSR moyenne &lt;15% et des temps de migration &lt;2,2%. Ces résultats démontrent le haut degré de confiance qui peut être attribué aux données recueillies à l’aide de cette technique et confirment que les variations détectées sont dues à de réelles différences dans la composition de l’échantillon (enrichissement en NT) plutôt qu’à des variations analytiques. Le tableau 2 est généré à partir des résultats présentés précédemment11,15.

Nous présentons ici un protocole pour caractériser la couronne biomoléculaire complète, les protéines et les métabolites, acquis par les nanomatériaux à partir de biofluides en utilisant une approche d’électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse.

Approches de spectrométrie de masse par électrophorèse capillaire pour la caractérisation de la protéine et du métabolite Corona acquis par les nanomatériaux

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

Ce protocole est le premier à mettre en œuvre CESI-MS pour la caractérisation non seulement de la couronne protéique, mais aussi de la couronne métabolite des nanomatériaux. CESI offre une séparation orthogonale aux méthodes LCMS traditionnelles, qui est à la fois hautement reproductible et sensible tout en utilisant seulement quelques nanolitres d’échantillon. Pour commencer, divisez deux millilitres de plasma humain en une aliquote d’un millilitre, l’une pour le métabolite et la couronne protéique, et l’autre pour la caractérisation du métabolome plasmatique.Incuber un milligramme par millilitre de nanomatériaux dans le plasma humain pendant une heure à 37 degrés Celsius tout en mélangeant doucement à 500 rotations par minute dans un mélangeur thermique. Ensuite, granulez les nanomatériaux en les centrifugeant à 4 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Prélever le surnageant plasmatique pour l’analyse de la couronne de métabolites et conserver le complexe de couronne protéique du nanomatériau pour la caractérisation de la couronne protéique.Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon 10X PBS et agitez vigoureusement pendant deux minutes pour éliminer les protéines non liées. Centrifugez la solution à 4 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler les nanomatériaux, puis retirez soigneusement le surnageant sans perturber la cuillette. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon ABC et faites un tourbillon vigoureux pendant deux minutes pour éliminer les protéines et les sels non liés.Répétez l’étape de centrifugation et jetez le surnageant. Dissoudre la pastille dans 20 microlitres de tampon ABC contenant 10 millimolaires de dithiothréitol pour réduire les liaisons disulfure de protéines. Incuber la solution pendant 30 minutes à 56 degrés Celsius.Ajoutez deux microgrammes de trypsine de qualité séquençage aux 20 microlitres de tampon ABC contenant 0,1 % de tensioactif, et incubez la solution de digestion à 37 degrés Celsius pendant 16 heures. Alkylez l’échantillon en ajoutant 20 microlitres d’iodoacétamide de 55 millimolaires dans 100 millimolaires d’ABC et incubez à température ambiante pendant 20 minutes. Ajoutez 20 microlitres d’acide chlorhydrique 0,1 molaire pour fendre le tensioactif et laissez l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante.Enrichissez et dessalez les peptides à l’aide d’une pointe de pipette de dessalage garnie de C18, comme décrit dans le manuscrit du texte. Ensuite, lyophilisez l’échantillon et conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse. Prenez le plasma témoin et le surnageant de l’incubation du plasma de nanomatériaux et mettez-les sur de la glace.Aliquote 50 microlitres de chaque échantillon dans des flacons séparés, et diluer dix fois avec de l’eau distillée. Après le vortex, déplacez 50 microlitres de cet échantillon dilué dans de nouveaux flacons. Ajoutez 200 microlitres de chloroforme, 250 microlitres de méthanol et 350 microlitres d’eau distillée et remuez vigoureusement pendant deux minutes.Centrifugeuse à 20, 800 fois G à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Prenez 500 microlitres de surnageant et filtrez-les à travers un filtre centrifuge de trois kilodaltons pendant deux heures à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Séchez 430 microlitres de l’ultra filtrat dans un aspirateur rapide et congelez l’échantillon.Avant d’installer les capillaires dans l’instrument CESI, vérifiez que les extrémités d’entrée et de sortie des capillaires sont intactes et qu’il n’y a pas de ruptures visibles dans le capillaire. Placez ensuite un nouveau capillaire à codage neutre dans l’instrument, en suivant les instructions du fabricant. Rincer le capillaire de séparation vers l’avant avec de l’acide chlorhydrique 100 millimolaires, puis avec du BGE, et enfin avec de l’eau distillée, en utilisant les conditions décrites dans le manuscrit du texte.Ensuite, rincez à la fois la séparation et le capillaire conducteur avec du BGE suivi d’eau distillée, de 100 millimolaires d’acide chlorhydrique, de de l’eau distillée à nouveau et enfin de BGE. Couplez CESI au MS à l’aide de la source de nanopulvérisation et de l’adaptateur. Pour l’analyse de la couronne protéique, remettre en suspension les échantillons lyophilisés dans 20 microlitres d’acétate d’ammonium de 50 millimolaires à pH quatre.Effectuer l’analyse CESI-MS des échantillons comme décrit dans le manuscrit textuel. Collectez des données de spectres de masse entre 250 et 2 000 m/z, avec l’acquisition de la fragmentation dépendante des 10 premières données, et rincez le capillaire entre les échantillons. Placez un nouveau capillaire en silice fondue nue dans l’instrument CESI.Rincez le capillaire de séparation dans le sens de l’avant avec du méthanol à 100 %, puis rincez le capillaire de séparation et le capillaire conducteur avec du BGE pour assurer la formation de gouttelettes aux extrémités de sortie. Ensuite, rincez le capillaire avec de l’eau distillée, puis avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 molaire, de l’eau distillée à nouveau, et enfin avec du BGE. Couplez CESI au SEMS à l’aide de la source de pulvérisation nano et de l’adaptateur.Pour effectuer l’analyse des métabolites corona, remettez en suspension les échantillons de plasma exposés et non exposés de nanomatériaux dans 430 microlitres d’eau distillée et agitez vigoureusement le vortex pendant deux minutes. Filtrez les échantillons à travers un filtre à membrane de 0,1 micromètre. Ajoutez cinq microlitres des étalons internes, comme mentionné dans le manuscrit du texte, à 95 microlitres de filtrat et vortex vigoureusement.Centrifugeuse à 16, 100 fois G et quatre degrés Celsius. Effectuer l’analyse CESI-MS des échantillons comme décrit dans le manuscrit textuel. L’utilisation de CESI-MS pour la séparation et la détection protéomique et métabolomique démontre de bonnes fenêtres de séparation sur les deux capillaires pour chaque approche, permettant une caractérisation complète de la couronne biomoléculaire.La méthode protéomique CESI-MS est capable de distinguer entre un ensemble de protéines et les concentrations de protéines dans la couronne à travers une large gamme de compositions de nanomatériaux, et peut distinguer une couronne protéique unique pour chaque nanomatériau. Cette approche métabolomique CESI-MS permet une analyse quantitative du métabolite corona et peut être utilisée pour découvrir ses empreintes digitales uniques. Bien que cette approche caractérise passivement la couronne de métabolites des nanomatériaux, elle est tout de même capable de révéler des informations intéressantes sur le rôle des métabolites dans la couronne biomoléculaire, comme l’absorption différentielle des isomères.Cette technique permet de caractériser à la fois la protéine et la couronne de métabolites, ce qui permet de mieux comprendre comment la couronne biomoléculaire complète affecte l’absorption des nanomatériaux par les cellules.

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