Génération de neurones humains et d’oligodendrocytes à partir de cellules souches pluripotentes pour la modélisation des interactions neurone-oligodendrocytes

Les protocoles décrits ici devraient faciliter les études futures sur les défauts oligodendroglials, dans la pathogenèse de la neurodégénérescence. Il s’agit d’une méthode améliorée qui peut être utilisée pour générer des cellules fonctionnelles de la lignée des oligodendrocytes humains en seulement trois à quatre semaines, et établir un système de co-culture pour modéliser les connexions des oligodendrocytes neuronaux. Le protocole peut être utilisé pour étudier non seulement la maladie d’Alzheimer, mais aussi tout autre aspect associé à la maladie des interactions entre les oligodendrocytes des neurones.

Pour commencer, plaquez environ un million de cellules HEK293T dans chaque fiole T75 pour atteindre une confluence de 40 %, puis transfectez-les avec des plasmides exprimant le gène NGN2 inductible à la tétracycline et le gène transactivateur de la tétracycline résistant à la puromycine, ainsi que les trois plasmides auxiliaires. Utilisez l’Île-du-Prince-Édouard pour la transfection. Changez de support après 16 heures.

Récoltez les particules virales libérées en prélevant des milieux de culture tous les jours et en les remplaçant par des milieux frais pendant trois jours. Mettez en commun le milieu collecté pour la purification, puis filtrez le virus à travers un filtre de 0,22 micromètre et centrifugez-le à 49 000 fois G pendant 90 minutes. Après la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans le volume approprié de glucose PBS.

Utiliser des cellules ES humaines H1 disponibles dans le commerce pour effectuer l’induction neuronale. Cultivez les cellules sur des plaques à 6 puits enrobées d’une solution de matrice extracellulaire avec un milieu de maintenance ESL et incubez les plaques à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Deux jours avant l’induction de la différenciation, détachez les cellules ES en ajoutant un millilitre de solution de décollement cellulaire et en l’incubant à température ambiante pendant 10 minutes.

Transférez les cellules dans un tube, puis lavez le puits avec deux millilitres de média et ajoutez-le dans le même tube. Centrifugez les cellules à 300 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, mettez à nouveau la pastille en suspension dans le milieu et plaquez les cellules sur des plaques de 6 puits recouvertes de matrice à la densité de 1 fois 10 à la cinquième cellule par puits.

Le lendemain, ajoutez des lentivirus, exprimant NGN2 plus puro. R, et transactivateur de tétracycline associé au polybrène dans un milieu de maintenance cellulaire ES frais. Au jour zéro, ajoutez deux microgrammes par millilitre de doxycycline dans un milieu DMEM/F-12 complété par du N2 et sans morphogènes.

Le premier jour, ajoutez de la puromycine dans du DMEM/F-12 frais, ainsi que de la N2 et de la doxycycline jusqu’à la concentration finale d’un microgramme par millilitre. Sélectionnez les cellules transduites dans la puromycine pendant au moins 24 heures. Le deuxième jour, détachez les neurones différenciateurs avec une solution de détachement cellulaire et replaquez-les sur des plaques à 24 puits recouvertes d’une solution matricielle.

Maintenez-les en milieu MBA B27 sans doxycycline. Cultivez des neurones induits purs sur les plaques, enrobés de solutions à base de matrice extracellulaire. Pour effectuer la génération de cellules progénitrices neurales, cultivez des cellules ES humaines H1 et transdifférenciez-les en cellules progénitrices neurales, comme décrit dans le manuscrit du texte.

Le jour négatif un, ensemencer 0,5 à un million de cellules dans un milieu de maintien cellulaire ES dans chaque puits d’une plaque à 6 puits recouverte d’une solution matricielle à facteur de croissance. Le jour zéro, traitez les cellules pendant 24 heures avec un milieu d’entretien cellulaire ES complété par 2 % de DMSO. Du premier au sixième jour, remplacez le milieu complet par un milieu d’induction neurale chaud contenant des inhibiteurs d’ajout d’un kit commercial.

Le septième jour, faites passer les PNJ à l’aide d’une solution de détachement de cellules et plaquez-les à une densité d’assise de un à deux fois 10 à la cinquième cellule par puits d’une plaque de 24 puits. Testez l’efficacité de la différenciation par coloration immunohistochimique pour l’absence de marqueur de pluripotenticité et la présence de marqueurs NPC. Pour générer les cellules précurseurs d’oligodendrocytes, plaquez les NPC dans un milieu d’induction neurale chaud avec des inhibiteurs d’ajout provenant d’un kit commercial.

Le huitième jour, préparez une solution de 1 % de DMSO dans le milieu de différenciation des OPC et traitez les NPC plaqués pendant 24 heures. Le neuvième jour, remplacez le milieu par un nouveau milieu de différenciation OPC sans DMSO, puis nourrissez les cellules tous les deux jours jusqu’au 15e jour. Si les cellules atteignent la confluence avant le 15e jour, passez-les à la densité d’assise de un à deux fois 10 à la cinquième cellule par puits.

Au jour 14, les OPC sur plaque dans un milieu de différenciation des OPC à une densité de un à deux fois 10 à la cinquième cellule par puits, dans une plaque à 24 puits. Cellules d’essai pour la présence de marqueurs spécifiques OPC par coloration IHC ou qPCR, et pour l’absence de marqueurs NPC. Le 15e jour, remplacer le milieu par du milieu de maturation OL.

Changez de support tous les deux jours ou tous les jours. Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, divisez-les dans un rapport de un à trois pour un maximum de deux passages ou jusqu’à ce que la division cellulaire ralentisse considérablement. Si les OPC se divisent trop rapidement et atteignent la confluence en moins de trois jours, ajoutez Ara-C à une concentration de deux à cinq micromolaires pendant un à trois jours.

Le 14e jour, plaquez les IOPC à une densité de un fois 10 à la cinquième cellules par puits dans une plaque de 24 puits dans un milieu de différenciation OPC. Le lendemain, détachez les neurones humains induits avec une solution de détachement cellulaire. Ajoutez des neurones sur les OPC cultivés, en plaquant à la densité d’assise de deux fois 10 à la cinquième cellule par puits.

Utilisez un milieu de co-culture contenant du milieu neurobasal A, un supplément de 2 % de B27 et 100 nanogrammes par millilitre de triiodothyronine T3. Changez de support le lendemain, puis tous les deux jours. Si les OPC prolifèrent trop rapidement et atteignent leur confluence en moins de trois jours, ajoutez deux à cinq micromolaires d’Ara-C.

Il est important que les cellules souches pluripotentes humaines de départ présentent un haut degré de pluripotentité pour la génération réussie de neurones induits, ou OPC et d’oligodendrocytes. Par conséquent, les cellules doivent être colorées pour des marqueurs spécifiques, tels que OCT-4 et SOX2, avant de commencer l’un ou l’autre des protocoles d’induction. Des cellules H1 humaines ont été utilisées pour obtenir des neurones excitateurs induits du cerveau antérieur.

Les neurones purs en culture ont commencé à exprimer des synapses dans l’un d’eux entre le 14e et le 16e jour. Les IOPC ont été générés en deux semaines et les oligodendrocytes matures en quatre à cinq semaines. Le traitement au DMSO a enrichi le nombre de cellules dans la phase précoce G1 pour une meilleure intégration de la signalisation.

Des marqueurs OPC spécifiques ont été détectés dès deux semaines après le placage des cellules ES H1. La population IOPC à deux semaines était assez homogène, avec plus de 95 % de cellules positives pour la coloration 04 et un niveau élevé d’immunoréactivité pour les autres marqueurs. Après le début de la maturation des oligodendrocytes, des marqueurs spécifiques d’oligodendrocytes ont été détectés à partir du jour 28.

Les densités de placage idéales pour les neurones induits, et les IOPC, doivent être déterminées à l’aide d’une série de titrages du nombre de cellules pour obtenir une différenciation correcte. Après quatre semaines, dans les co-cultures, les IOPC doivent être différenciés de manière adéquate en oligodendrocytes positifs pour des marqueurs spécifiques tels que la MBP. Ce système de co-culture peut augmenter considérablement le nombre de synapses, indiquant que les IOPC fournissent un soutien neuronal par contact physique ou libération de facteurs trophiques.

Cette procédure décrite peut être encore plus sophistiquée en ajoutant différents types de cellules cérébrales. Par exemple, les cellules souches ont dérivé des astrocytes humains pour modéliser de nouveaux aspects des interactions neurogliales dans la santé et la maladie.