Profilage cellulaire à haut débit de composés de dégradation de protéines ciblés à l’aide de lignées cellulaires HiBiT CRISPR

Cette approche permet un suivi cellulaire de la dégradation des protéines et un criblage rapide des composés dégradants. La dynamique de la dégradation peut être surveillée dans un contexte cellulaire de manière très sensible et quantitative, ce qui permet de déterminer avec précision les principaux paramètres de dégradation. Ces méthodes permettent de profiler par SHD l’activité des composés dégradants, ce qui permet un triage dans la phase précoce de découverte thérapeutique.

Ils fournissent également des informations à quiconque souhaite étudier la modulation des niveaux cibles endogènes, qu’ils soient croissants ou décroissants. La démonstration de la procédure sera assurée par Celia Bisbach, chercheuse scientifique dans mon laboratoire. Commencez par préparer et placer des cellules de mammifères adhérentes ou en suspension.

Ajustez la densité cellulaire à 2,22 fois 10 puissance 5 cellules par millilitre et distribuez-les dans des plaques avec un minimum de trois puits par condition expérimentale et de contrôle. Préparez des plaques de composé d’essai PROTAC diluées en série, ou dégradeurs, à une concentration de 1000x dans 100 % DMSO. Ensuite, diluez-le à 10x la concentration finale dans le milieu de culture cellulaire.

Ajoutez un volume égal de DMSO au support pour créer une commande DMSO sans composé. Ajoutez la quantité appropriée de composé 10x ou de solution de contrôle dans les cellules de la plaque et incubez les plaques à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone. Pour mesurer le signal luminescent final, préparez 2x réactif de détection lytique en ajoutant 20 microlitres de substrat lytique et 10 microlitres de protéine LgBiT pour chaque millilitre de tampon lytique.

Préparez suffisamment de réactif pour tous les puits à analyser, y compris un volume supplémentaire pour tenir compte des erreurs de pipetage. Ajoutez le réactif de détection lytique préparé aux cellules et mélangez la plaque sur un mélangeur vortex à microplaques pendant 10 à 20 minutes à 350 tr/min. Mesurez la luminescence sur un luminomètre capable de lire une plaque de 96 ou 384 puits.

Si vous utilisez le multiplexage de viabilité cellulaire, faites-le avant d’ajouter le réactif lytique. 30 à 40 minutes avant la mesure du point final souhaité, préparez une solution de réactif de détection de viabilité cellulaire 6x en ajoutant 10 microlitres de substrat à deux millilitres de tampon de dosage. Ajouter le réactif préparé dans les puits et mélanger brièvement sur un mélangeur vortex à microplaques.

Ensuite, incubez la plaque pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius. Au point final souhaité, mesurer la fluorescence sur un instrument capable de lire la fluorescence au format 96 ou 384 puits. Préparez 2 réactifs lytiques comme décrit précédemment.

Ajoutez ensuite le réactif dans les puits et mélangez la plaque sur un mélangeur vortex à microplaques pendant 10 à 20 minutes. Après le mélange, utilisez un luminomètre pour mesurer la luminescence. Pour démontrer l’analyse de la dégradation lytique du point final à concentration unique, plusieurs protéines cibles CDK ont été marquées de manière endogène avec HiBiT et traitées avec le PROTAC TL12-186 basé sur le céreblon pan kinase.

Le niveau de protéine CDK a été mesuré à différents moments et le RLU fractionné a été déterminé. Pour comprendre comment les protéines CDK se comparent directement les unes aux autres en termes de perte de protéines, les RLUs fractionnées ont été calculées en pourcentage total de dégradation. Une analyse de dégradation cinétique a été réalisée en marquant de manière endogène les protéines membres de la famille BET avec des cellules HiBiT et HEK293 exprimant de manière stable la protéine LgBiT.

Les cellules ont ensuite été traitées avec trois concentrations différentes de PROTAC pan-BET. Le dBET6 basé sur le cereblon et l’ARV-771 basé sur VHL. Les profils cinétiques de dégradation de la relation dose-réponse des cellules Ikaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat exprimant de manière stable la protéine LgBiT traitées avec quatre composés de colle moléculaire différents sont présentés ici.

Des différences significatives dans la réponse à la dégradation entre les composés, ainsi qu’entre les séries de concentration, sont observées. Pour évaluer quantitativement la dégradation et l’ordre de classement des composés, les profils dose-réponse ont été utilisés pour calculer les principaux paramètres de dégradation, notamment le taux de dégradation, le maximum de dégradation et les valeurs Dmax50. Les essais multiplex de viabilité cellulaire n’ont montré aucune perte de viabilité cellulaire pour les concentrations testées.

Les étapes les plus importantes de ce protocole sont la détermination du RLU fractionné ou du pourcentage de dégradation par normalisation au contrôle DMSO. En suivant ce protocole, on pourrait effectuer un test phénotypique pour comprendre comment la perte d’une protéine particulière peut avoir un impact sur la santé ou la fonction cellulaire. De plus, ces lignées cellulaires HiBiT peuvent également être utilisées pour étudier les interactions protéiques ou la liaison de petites molécules à l’aide de la technologie NanoBRET.