Cultiver un épiderme humain reconstruit tridimensionnel à grande échelle

Le modèle d’épiderme humain in vitro ou construit a été développé pour la première fois dans les années quatre-vingt-dix dans le but principal de développer des méthodes d’essai alternatives à l’expérimentation animale. Ces modèles épidermiques 3D sont maintenant couramment utilisés pour tester à la fois l’innocuité et l’efficacité des ingrédients cosmétiques. Alors qu’il peut être acheté auprès de plusieurs fournisseurs de tissus, pouvoir reconstituer un modèle 3D dans un laboratoire donne plus de flexibilité au point final d’intérêt.

Il existe plusieurs articles de recherche décrivant brièvement le protocole de reconstitution d’un modèle épidermique 3D, mais il n’y avait, à ce jour, aucune vidéo disponible montrant les étapes critiques du processus de reconstitution. C’est la raison de la publication de ce document vidéo. La préparation de l’épiderme humain reconstruit en interne permet beaucoup de liberté dans le processus de culture, comme des changements dans la composition du milieu de culture, des déclencheurs de stress pro-inflammatoires ou oxydatifs, le silence des gènes d’intérêt et l’inhibition ou la stimulation de certains processus biologiques.

Pour commencer, décongelez un flacon avec 1 million de kératinocytes épidermiques humains normaux cryo-préservés, ou NHEKs, dans un bain-marie à 37 degrés Celsius en submergeant une partie du flacon dans l’eau. Incuber le flacon pendant une à deux minutes au bain-marie, jusqu’à ce que seul un petit morceau de glace soit visible. Ressuscitez les cellules très soigneusement en pipetant de haut en bas deux à trois fois.

Transférer la suspension cellulaire dans deux fioles T75 contenant un total de 15 millilitres de milieu de décongélation pré-averti, ce qui donne une densité d’ensemencement de 6,7 fois 10 à la quatrième cellule par centimètre carré. Préremfer 24 plaques de puits avec 1,5 millilitres de milieu submergé, idéalement à l’aide d’une pipette de distributeur. Après avoir cultivé les cellules à 80% de confluence, elles sont prêtes à être ensemencées dans des inserts pour la culture de l’épiderme humain reconstruit, ou RHEs.

Retirer le milieu basal des fioles T75 avec les NHEKs. Rincer les cellules en ajoutant cinq millilitres de PBS préchauffé à chaque fiole T75, puis retirer le PBS des fioles. Ajouter deux à trois millilitres de Trypsine-EDTA préchauffé à 0,05 % dans chaque fiole, en s’assurant que la solution de trypsine est également répartie sur la zone de culture cellulaire de la fiole.

Placez les flacons dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre minutes, puis vérifiez si les cellules se détachent à l’aide du microscope à un grossissement de 10 X. Rapper le ballon pour aider les cellules à se libérer de la surface du ballon. Une fois que toutes les cellules sont détachées, ajouter un volume égal d’inhibiteur de la trypsine préchauffé à chaque fiole T75 et transférer la suspension cellulaire des fioles vers un tube de centrifugation.

Rincer les fioles avec cinq millilitres de PBS préchauffé et les transférer dans le tube de centrifugation contenant la suspension cellulaire. Centrifuger les cellules récoltées à 400 fois G pendant cinq minutes. Jetez soigneusement la majeure partie du surnageant en laissant environ 100 à 200 microlitres dans le tube.

Faites glisser doucement le tube avec vos doigts pour desserrer soigneusement la pastille. Remettez doucement en suspension la pastille de cellules dans un faible volume de milieu submergé, en pipetant de haut en bas 5 à 10 fois pour assurer une suspension uniforme de la cellule. Commencez par un faible volume pour éviter la formation d’agrégats cellulaires et ajoutez jusqu’à un millilitre de milieu submergé par fiole T75 initiale.

Comptez les cellules de la suspension à l’aide de la méthode d’exclusion trypan blue. Diluer la suspension cellulaire avec un milieu submergé supplémentaire pour atteindre une concentration de 3,525 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre, en utilisant la première équation fournie dans le manuscrit de texte. Effectuez un deuxième comptage cellulaire de la solution diluée et utilisez la deuxième équation du manuscrit de texte pour calculer le volume de suspension cellulaire à ensemencer dans l’insert de culture.

Accrochez les inserts de culture de 24 puits dans la position la plus haute de la plaque porteuse et transférez la plaque porteuse sur la plaque porteuse 24 puits préremplie de milieu submergé. Ajoutez le volume déterminé de la suspension de la cellule à chaque insert, en prenant soin de ne pas toucher l’insert. Après l’ensemencement, incuber les 24 plaques de puits pendant 10 à 15 minutes à température ambiante pour surmonter un effet de bord.

Ne déplacez pas les plaques pendant ce temps. Transférer les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire et les laisser dans des conditions submergées pendant trois jours. Après une incubation de trois jours dans l’incubateur de culture cellulaire, exposer les cellules qui ont adhéré à la surface de la membrane à l’interface air-liquide, ou ALI, en retirant le milieu immergé du compartiment apical avec un système d’aspiration et une pipette Pasteur en verre.

Remplissez les nouvelles plaques de 24 puits avec 1,5 millilitres de milieu ALI frais préchauffé et transférez les plaques porteuses avec les inserts de culture vers les nouvelles plaques multi-puits. Transférer les plaques multi-puits dans l’incubateur de culture cellulaire. Rafraîchissez le support ALI tous les deux à trois jours, pendant 14 jours.

Les kératinocytes en culture 2D présentent une morphologie traditionnelle avec une forme polygonale cohérente. Après 15 jours à ALI, l’épiderme humain reconstruit forme un tissu entièrement stratifié, qui est indiqué par ses quatre principales couches épidermiques. L’analyse d’ultrastructure de l’épiderme humain reconstruit à différents points de temps dans le protocole de reconstitution indique le processus de cornification, avec un plus grand nombre de couches d’emplacement de cornée au fil du temps.

Les kératinocytes dans l’épiderme montrent différents profils d’expression des protéines en fonction de leur stade de différenciation. L’expression de l’involucrine apparaît plus principalement dans la couche SG, tandis que l’expression de la filaggrine et de la loricrine est située dans les couches supérieures. L’expression de Kératine-10 a été trouvée dans toutes les couches viables excepté la couche de SB.

L’épiderme humain reconstruit montre les jonctions desmosomal fonctionnelles, comme indiqué par l’expression de Desmoglein-1 dans l’espace intercellulaire des couches épidermiques viables. Les propriétés de barrière du modèle reconstruit d’épiderme ont été étudiées en évaluant la viabilité de tissu sur le traitement topique avec un perturbateur connu de barrière, et en évaluant l’intégrité de tissu. L’intégrité tissulaire a été déterminée après 15 jours en mesurant le TEER avec un voltmètre.

La réponse de l’épiderme au lipopolysaccharide et à l’alpha de facteur de nécrose tumorale a été étudiée. LPS et alpha traitements de TNF étaient non toxiques. par rapport au contrôle Triton X-100.

La libération d’Interleukin-1 alpha et d’Interleukin-8 dans le milieu rhe a été quantifiée utilisant la lyse d’IL. Le traitement de LPS a eu comme conséquence un vers le haut-règlement statistiquement significatif dans la libération de l’alpha Interleukin-1 et d’Interleukin-8. L’alpha traitement de TNF a eu comme conséquence un vers le haut-règlement statistiquement significatif dans seulement la libération de l’alpha Interleukin-1.

Cependant, on a également observé une tendance claire des niveaux Interleukin-8 accrus sur la stimulation avec l’alpha de TNF. Suivant ce protocole, TEER peut être mesuré comme une valeur pour l’intégrité de la barrière. La viabilité ou la cytotoxicité peut être mesurée par un test MTT ou LDH, par exemple.

Le surnageant peut être utilisé pour mesurer la sécrétion de cytokines ou d’autres protéines. De plus, le tissu peut être utilisé pour étudier l’expression de protéines ou de gènes d’intérêt.