Polarisation des cellules et analyses dérivées des monocytes humains M1 et M2 avec cytométrie du débit sur l’infection par mycobactérie tuberculeuse

Ce protocole offre la possibilité de suivre la polarisation immunitaire de cellules dérivées de monocytes humains sur la base de la visualisation et de la caractérisation approfondie de Mtb marquée par des protéines fluorescentes vertes dans divers sous-ensembles de macrophages à l’aide de la cytométrie en flux à 10 couleurs. Il s’agit d’une méthode efficace et reproductible pour étudier les réponses à l’infection à Mtb dans les macrophages polarisés M1 ou M2, y compris l’évaluation du phénotype et de la fonction avant et après l’infection. Pour isoler le PBMC à partir de couches leucocytaires de donneur humain, utilisez une pipette pour superposer lentement 15 millilitres de sang de couche leucocytaire sur le côté d’un tube de 50 millilitres sur 15 millilitres de milieu à gradient de densité et séparez les cellules par centrifugation.

À l’aide d’une pipette Pasteur stérile, retirez la couche supérieure de plasma et transférez soigneusement la couche de cellules mononucléées dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ajoutez un milieu RPMI sans sérum dans les cellules jusqu’à un volume final de 50 millilitres et retournez doucement le tube plusieurs fois avant de centrifuger. Ensuite, mettez les cellules en suspension dans 20 millilitres de milieu sans sérum pour le comptage.

Pour initier la différenciation des macrophages, diluez les cellules à 5 fois 10 à 6 cellules par millilitre de concentration de milieu sans sérum et ensemencez deux millilitres de cellules dans des puits individuels d’une plaque à six puits. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux à trois heures pour permettre aux cellules d’adhérer au fond du puits. À la fin de l’incubation, laver les puits trois fois avec un millilitre de milieu sans sérum par lavage, et ajouter deux millilitres de milieu RPMI complet complété par 50 nanogrammes par millilitre de GM-CSF ou 50 nanogrammes par millilitre de M-CSF pour la différenciation M1 ou M2 respectivement à chaque puits de cellules adhérentes.

Trois jours après le début de la polarisation, remplacer soigneusement un millilitre de surnageant de chaque puits par un millilitre de milieu complet frais complété par les facteurs de croissance appropriés. Au sixième jour de la culture, ajouter 50 nanogrammes par millilitre d’interféron gamma et 10 nanogrammes par millilitre de LPS dans les puits traités au GM-CSF et 20 nanogrammes par millilitre d’IL-4 dans les puits traités au M-CSF. Vérifiez régulièrement la morphologie des cultures cellulaires dérivées des monocytes par microscopie optique pour vous assurer que les petits monocytes se différencient en cellules plus grandes ressemblant à des macrophages.

Pour mettre en place une culture de Mtb, dans une installation de biosécurité de niveau III, mélangez une aliquote d’un millilitre de suspension de bactéries décongelées avec neuf millilitres de milieu complet de TB dans un tube de capuchon filtré de 50 millilitres pour une incubation de 24 heures dans le tube de l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, recueillir les bactéries par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans 15 à 20 millilitres de milieu complet de TB frais dans un nouveau tube de culture à capuchon filtré de 50 millilitres avant de remettre les bactéries dans l’incubateur de culture cellulaire. Après sept à 10 jours de culture, lavez les bactéries deux fois dans 35 à 40 millilitres de tampon de lavage stérile par lavage, en remettant les bactéries en suspension dans un millilitre de milieu RPMI sans sérum après le deuxième lavage.

Ajoutez neuf millilitres supplémentaires de milieu RPMI sans sérum aux bactéries et sonifiez les bactéries dans un sonicateur à bain d’eau dans une enceinte de biosécurité de classe II pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Mesurez ensuite la densité optique d’un millilitre de suspension bactérienne à une longueur d’onde de 600 nanomètres dans un spectrophotomètre placé à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité. Pour infecter les cellules dérivées de monocytes, diluez la bactérie à une concentration de 5 fois 10 à la 6e unité de formation de colonie par millilitre dans un milieu sans sérum et remplacez le surnageant dans chaque puits de la plaque de culture cellulaire à six puits par un millilitre de milieu frais sans sérum et un millilitre de suspension de bactéries par puits pour obtenir une multiplicité d’infection de cinq.

Après une incubation de quatre heures dans l’incubateur de culture cellulaire, lavez chaque puits trois fois avec un millilitre de tampon de lavage stérile par lavage, en inclinant la plaque avec précaution pour retirer tout le volume de tampon des coins des puits après chaque lavage. Ensuite, réintroduisez les cellules dérivées de monocytes infectées par Mtb dans deux millilitres de milieu complet sans antibiotiques. Pour colorer les cellules pour la cytométrie en flux, incubez les cellules infectées avec un millilitre de tampon FACS complété par 0,5 millimolaire d’EDTA par puits pendant au moins 30 minutes.

À la fin de l’incubation, collectez les cellules détachées à l’aide d’un pipetage doux et transférez-les dans des tubes à microcentrifuger individuels à bouchon vissé pour la centrifugation. Remettez les cellules en suspension dans environ 50 microlitres de cocktail d’anticorps anti-humains conjugués au fluorochrome et de colorant de viabilité d’intérêt et incubez les cellules pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Après le lavage, fixez les cellules avec 200 microlitres de tampon de fixation fraîchement préparé pendant 30 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière.

Après la fixation et le lavage, remettez les cellules en suspension dans 400 microlitres de tampon FACS et transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugation d’un millilitre. Pour analyser les cellules, utilisez des billes de compensation pour compenser le signal fluorescent pour chaque anticorps conjugué au fluorochrome dans le cocktail et utilisez des cellules non colorées pour définir la porte pour la population cellulaire négative. Ensuite, acquérez un minimum de 50 000 cellules par échantillon.

Les cellules dérivées des monocytes M1 et M2 présentent un décalage vertical vers une granularité plus élevée et une taille cellulaire réduite lors de l’infection à Mtb. Une mort cellulaire accrue est également observée dans les cellules M1 et M2 infectées par Mtb à une multiplicité d’infection de cinq par rapport aux cellules M0 non infectées. Il convient de noter qu’une expression nettement plus élevée de la GFP de Mtb est observée dans les cellules M2 après quatre heures d’infection par rapport aux cellules M1.

Les cellules M1 et M2 non infectées peuvent être caractérisées par leur récepteur CD64 et CD86 ou CD200 et leur co-expression CD163 respectivement. Après quatre heures d’infection à Mtb, une fréquence accrue de cellules positives au récepteur CD200 est observée dans les cellules polarisées M1 positives à la GFP Mtb, tandis que l’expression de CD163 est réduite dans les cellules M2. La bactérie Mtb GFP peut également être observée dans les cellules M1 CD64 positives et les cellules M2 CD163 positives par microscopie confocale.

L’analyse UMAP révèle que quatre heures d’infection à Mtb ne sont pas suffisantes pour affecter la polarisation des macrophages, tandis que 24 heures d’infection entraînent des grappes clairement séparées de cellules M1 et M2 non infectées et infectées qui expriment des profils d’expression de marqueurs de surface distincts. De plus, l’analyse PhenoGraph montre que 24 grappes différentes de tailles différentes sont réparties de manière unique entre les cellules non infectées M1 et M2 et les cellules infectées par Mtb. L’efficacité de la polarisation M1 ou M2 ou de l’infectiosité de Mtb peut varier considérablement entre les donneurs humains.

Par conséquent, il est recommandé d’inclure au moins deux donneurs dans chaque expérience afin de réduire les variations expérimentales. Ce modèle permet l’évaluation simultanée des macrophages humains à l’aide de la cytométrie en flux, de la microscopie confocale, de l’analyse de l’expression de l’ARNm, des dosages multiplexes des facteurs solubles et de la quantification bactérienne à l’aide de l’expression de la GFP ou des unités formant des colonies.