Un bioréacteur multi-cue pour évaluer la capacité inflammatoire et régénératrice des biomatériaux sous écoulement et étirement

Jusqu’à présent, il a été très difficile d’identifier les relations de cause à effet entre l’hémodynamique et la régénération du tissu vasculaire. Et ce, parce qu’il est difficile de contrôler les charges mécaniques individuelles. Ce bioréacteur nous permet d’étudier mécaniquement les effets individuels et combinés du stress pur et de l’étirement cyclique sur le potentiel de régénération d’une grande variété de greffons vasculaires issus de l’ingénierie tissulaire.

Suzanne Koch, doctorante dans notre groupe, fera la démonstration de cette procédure. Et la Dre Tamar Wissing, chercheuse postdoctorale dans notre laboratoire. Pour monter l’échafaudage électro-filé sur le tube en silicone, enfilez une suture prolène 4-0 à une extrémité d’un morceau de tube en silicone et à l’extérieur de l’autre.

Faites un petit nœud des deux côtés du tube en laissant environ 10 centimètres de fil sur les deux nœuds et faites un troisième nœud sur les deux. Après avoir retiré une aiguille de suture, coupez les bords du tube en silicone en une forme triangulaire et faites un nœud final à l’extrémité des deux fils de 10 centimètres. Trempez l’échafaudage électrofilé dans de l’éthanol à 30 % et placez l’échafaudage sur une extrémité du fil de suture libre.

Ensuite, étirez doucement les deux côtés du tube en silicone et le nœud de suture de 10 centimètres pendant que le deuxième chercheur utilise une pince à épiler avec une pointe intérieure lisse pour faire glisser doucement l’échafaudage électro-filé sur le tube. Relâchez lentement l’étirement sur le tube en silicone tout en lissant simultanément l’échafaudage électro-filé avec la pince à épiler. Et trempez deux fois l’échafaudage et le tube en silicone dans de l’eau ultra pure.

Construisez le compartiment inférieur et assurez-vous que le joint torique est correctement placé. Placez une douille d’adaptateur dans la partie supérieure du compartiment inférieur et placez le conduit de pression avec des trous à travers le compartiment inférieur. Lacez le joint torique en silicone autour de l’extrémité inférieure du conduit de pression pour éviter les fuites.

Et vissez la partie inférieure du compartiment inférieur à la partie supérieure du compartiment inférieur pour fixer le conduit de pression. Assurez-vous que la rainure inférieure gravée du conduit de pression se trouve à environ trois à cinq millimètres au-dessus du bord de la douille de l’adaptateur du compartiment inférieur. Tirez le tube en silicone avec l’échafaudage électro-filé sur le conduit de pression et faites un hochement de tête et le fil de suture à l’extrémité inférieure de l’échafaudage électro-filé, à l’emplacement de la rainure gravée sur le conduit de pression.

Faites un deuxième hochement de tête du côté opposé pour bien fixer le tube en silicone avec la greffe électro-filée. Et en plaçant une pince à ciseaux équipée d’une règle à l’extrémité supérieure du tube en silicone, tirez la pince à ciseaux vers le haut de manière cohérente et tirez doucement sur l’échafaudage électrique pour éliminer les plis. Utilisez un fil de suture pour faire deux nœuds aux deux extrémités de l’échafaudage au niveau de la rainure supérieure gravée du conduit de pression.

Lorsque les deux nœuds ont été faits, relâchez la pince à ciseaux et utilisez un couteau pour retirer tout excès de tube en silicone. Vissez les cônes de nez sur le filetage des conduits de pression pour les échantillons qui seront chargés dynamiquement. Trempez le conduit de pression, le tube et l’échafaudage une fois dans de l’éthanol à 30 % et deux fois dans de l’eau ultra-pure pour pré-mouiller l’installation.

Placez le tube en verre sur le conduit de pression et appuyez doucement sur le compartiment inférieur pour fixer le tube en verre en place. Placez ensuite le redresseur de flux, un joint torique en silicone et la douille d’adaptation dans le compartiment supérieur. Et fixez le compartiment sur l’extrémité ouverte du tube en verre.

Retirez le bouchon du leurre mâle de la sortie d’écoulement, travaillez dans une armoire à flux laminaire stérile. Ouvrez le capuchon du leurre blanc et placez un mouchoir à l’éthanol devant la sortie du flux. Déconstruisez la chambre de culture en flux en retirant le tube en verre avec le compartiment supérieur.

Placez un tuyau de pâturage sous vide sur l’échafaudage électro-filé pour enlever autant de fluide que possible. Et ajoutez la solution de fibrinogène dans un rapport de un pour un avec la suspension cellulaire supplémentée en thrombine. Pipetez la solution de haut en bas une fois et versez immédiatement la solution sur toute la longueur de l’échafaudage.

Lorsque toutes les cellules ont été livrées, déplacez lentement l’échafaudage de gauche à droite et de haut en bas pour obtenir une répartition uniforme des cellules. Lorsque les deux côtés de l’échafaudage ont été ensemencés, reconstruisez soigneusement la chambre de culture à flux en remettant le tube en verre et le compartiment supérieur en arrière. Et placez la chambre de culture à flux dans l’incubateur pour laisser la fibre se solidifier.

Pour coupler le bioréacteur au système de pompe, placez la chambre de culture à flux sur l’un des huit filetages de la base du bioréacteur. Et placez un clip hôte sur le tube moyen. Retirez le capuchon de leurre blanc, qui recouvre l’entrée d’écoulement du compartiment supérieur de la chambre de culture d’écoulement et retirez le coupleur de leurre femelle du tube moyen.

Connectez le tube moyen avec un côté de l’entrée d’écoulement sur le compartiment supérieur. Et l’autre côté avec la sortie d’écoulement au niveau du compartiment inférieur. Transférez l’ensemble de l’installation de l’armoire à flux laminaire à l’incubateur.

Et connectez une unité fluidique et la base du bioréacteur au tube de pression d’air et au câble électrique. Démarrez le logiciel et initialisez les pompes. Démarrez le flux de fluide pour les échantillons un par un.

Modifiez ensuite les paramètres de la pompe de contrainte aux paramètres souhaités et démarrez la déformation. Surveillez l’étirement appliqué à l’échafaudage tous les deux jours. La surveillance des contraintes d’étirement et de cisaillement de la paroi sur de longues périodes de culture montre que ces valeurs peuvent être maintenues à des niveaux relativement constants sur une période allant jusqu’à 20 jours.

Après trois jours de charge hémodynamique, la coloration immunofluorescente révèle une distribution homogène de macrophages dérivés de monocytes et de myofibroblastes dans tout l’échafaudage. Après 20 jours de co-culture, l’étirement cyclique entraîne le dépôt de fibres de collagène de type 1 plus nombreuses et plus épaisses. Alors que dans le groupe de charge hémodynamique combinée, l’effet d’étirement cyclique est annulé par le stress pur, ce qui entraîne un dépôt de collagène de type 1 moins prononcé.

Après huit jours de monoculture de macrophages, l’érosion et le clivage des fibres sont observés dans tous les régimes de charge hémodynamique, la résorption la plus prononcée étant observée dans le groupe statique et la résorption la moins prononcée observée dans le groupe de stress pur. L’étirement cyclique et le stress pur et simple ont un impact sur le profil de sécrétion de cytokines de la configuration de co-culture. Il est intéressant de noter que les effets combinés des deux charges montrent soit la dominance de l’une des deux charges, soit des effets synergiques des deux charges.

Les expériences de co-culture montrent également que l’environnement mécanique et les environnements inflammatoires dépendants de la charge qui en résultent modulent le phénotype des myofibroblastes. De plus, les modèles d’expression génique du marqueur contractile alpha de l’actine musculaire lisse sont corrélés avec la synthèse des protéines. La chose la plus importante lors de l’exécution de ce protocole est que c’est ce que l’application de l’étirement, il est essentiel que votre configuration soit sans fuite.