Évaluation in vitro de la protection myocardique après hypothermie-préconditionnement dans un modèle de myocytes cardiaques humains

L’objectif de la présente étude était de quantifier les niveaux de mort cellulaire, à la suite de différents traitements d’hypothermie dans un modèle basé sur des cardiomyocytes humains. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le mécanisme moléculaire de la cardioprotection hypothermique, ce qui pourrait avoir des implications importantes pour le développement de thérapies complémentaires pour l’hypothermie. Pour cultiver les cellules HCM, décongelez les cellules cryoconservées à partir d’azote liquide dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius et maintenez-les dans un incubateur humidificateur sous une atmosphère contenant 95 % d’air et 5 % de dioxyde de carbone.

Une fois que les cellules atteignent 60 à 70 % de confluence, aspirez le milieu de la plaque à six puits et lavez doucement les cellules trois fois avec du PBS. Ajoutez deux millilitres de milieu frais sans sucre dans chaque puits et cultivez les cellules à température constante dans un incubateur à trois gaz sous un mélange de 95 % d’azote, 5 % de dioxyde de carbone et 0,1 % d’oxygène à 37 degrés Celsius. Pour le protocole temps-température, aspirez le milieu de la plaque à six puits et ajoutez deux millilitres de milieu frais sans sucre.

Cultivez les cellules dans un incubateur trigazeux pendant 12 heures pour établir l’hypoxie. Réglez le programme de température en commençant par 10 heures de traitement à basse température, suivi d’une phase de réchauffement pendant deux heures et de 24 heures de normothermie. Retirez trois boîtes de Pétri à chaque point temporel pour l’analyse.

Après le traitement à basse température, aspirez le fluide de la plaque à six puits et lavez-le trois fois avec du PBS. Ajoutez deux millilitres de milieu frais dans chaque puits, puis maintenez les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié sous une atmosphère avec 95 % d’air et 5 % de dioxyde de carbone. Ajoutez huit microlitres de solution CCK-8 dans chaque puits de la plaque et laissez la plaque pendant une heure dans l’incubateur.

Après l’incubation, mesurez l’absorbance à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques. Pour l’analyse de l’apoptose, ajoutez cinq microlitres d’Annexine V-FITC pour teindre les cellules. Ajoutez ensuite 10 microlitres d’iodure de propidium à la suspension cellulaire.

Mélangez délicatement les cellules et incubez-les pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Dans le logiciel de cytométrie en flux, ouvrez deux fenêtres de pointage et sélectionnez la lumière diffusée vers l’avant sur l’axe des x et la lumière diffusée latérale sur l’axe des y. Sélectionnez le canal de détection PE et FITC.

Cliquez sur Enregistrer pour collecter les particules de la suspension dans le tube d’échantillon vierge, puis sur la population cellulaire pour une analyse plus approfondie dans le premier graphique à points. Ensuite, placez les échantillons monocolorés sur le bras de support du tube. Cliquez sur Enregistrer pour collecter les particules de la suspension et surveiller la population de cellules pour une analyse plus approfondie.

Pour l’évaluation mitochondriale, ajoutez 0,5 millilitre de solution de travail JC-1 dans chaque tube contenant les cellules trypsinisées et incubez-les dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après l’incubation, centrifugez les cellules à 600 fois g pendant trois minutes à quatre degrés Celsius et remettez en suspension les HCM dans un millilitre de tampon de coloration glacé dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre. Mesurez l’intensité de fluorescence de JC-1 en sélectionnant les canaux de détection PE et FITC.

Pour le dosage des espèces réactives de l’oxygène, colorez les cellules et le milieu de culture avec 10 DCFDA micromolaires et ajustez la densité cellulaire à environ 1 à 10 millions de cellules. Incuber ces cellules pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis les analyser sur un cytomètre en flux. Ajoutez 40 microlitres de solution tampon dans la plaque marquée aux enzymes, puis ajoutez 80 microlitres de l’échantillon.

Ajoutez ensuite 10 microlitres de deux millimolaires d’acétyle DEVDp-nitroanilide et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 120 minutes. Mesurez la valeur A405 sur un lecteur de microplaques en suivant les instructions du fabricant. Les conditions de température dans le protocole temps-température ont été créées et maintenues à l’aide d’un incubateur trigaz, qui permet une régulation précise de la température à trois points temporels.

L’effet de la privation d’oxygène et de glucose sur la viabilité des MCH a été déterminé à l’aide du test CCK-8. Par rapport au groupe témoin, la viabilité cellulaire a été significativement diminuée en fonction du temps. Les taux d’apoptose des CMH ont progressivement augmenté entre zéro et 16 heures après la reperfusion, puis ont atteint le taux maximal au bout de 16 heures.

Comparativement au groupe des autres élèves, le pourcentage de cellules viables était plus élevé dans les trois groupes traités par hypothermie. De plus, les cellules du groupe d’hypothermie profonde avaient la viabilité la plus élevée, soit 2,1 fois plus élevée que celle observée dans le groupe des autres élèves. Les résultats de la cytométrie en flux ont confirmé que l’hypothermie empêchait l’apoptose des HCM dans des conditions d’autres ministères.

Le traitement par hypothermie a également diminué les niveaux de ROS intracellulaires dans les HCM. Le potentiel de la membrane mitochondriale a été détecté avec la coloration JC-1. Après le traitement par d’autres régions, le rapport de fluorescence rouge-vert a diminué.

L’hypothermie a inhibé de façon significative cet effet induit par d’autres personnes. De plus, une diminution de la caspase-8 et de la caspase-3 a été observée dans les cellules traitées par hypothermie. La fiabilité de ce modèle dépend d’un contrôle strict de la température, de procédures expérimentales contrôlables et de résultats expérimentaux stables.

Cette méthode peut être utilisée pour explorer davantage le mécanisme spécifique du traitement hypothermique sur l’apoptose cellulaire et pour étudier le mécanisme moléculaire de la cardioprotection hypothermique. Il est d’une grande importance pour le développement du traitement adjuvant hypothermique.