Imagerie par fluorescence multiplexée unicellulaire pour visualiser les acides nucléiques et les protéines virales et surveiller l’infection par le VIH, le VHB, le VHB, le VHC, le virus Zika et la grippe

Notre approche de détection multiplexe de l’ADN, de l’ARN et des protéines basée sur des cellules immunofluorescentes nous permet de visualiser simultanément des protéines et des acides nucléiques de différents types et brins au sein de cellules uniques. Avant l’ensemencement, incuber les lamelles de recouvrement dans de l’éthanol pendant cinq minutes, puis deux lavages de deux minutes dans du PBS. Après le deuxième lavage, immergez complètement la lamelle dans 20 microgrammes par millilitre de poly-D-lysine pendant 30 minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, retirer l’excès de solution matricielle avec deux lavages dans du PBS et diluer les cellules d’intérêt à 1 x 10 à la sixième cellule par 50 microlitres de PBS par concentration de lamelle. Ensuite, ensemencez 50 microlitres des cellules d’intérêt sur chaque lamelle enrobée de poly-D-lysine pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les cellules trois fois dans du PBS avant de les fixer dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes.

À la fin de l’incubation, laver les cellules deux fois dans du PBS avant de perméabiliser les cellules avec 500 microlitres de 0,1 %Tween 20 dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez chaque lamelle deux fois avec 500 microlitres de PBS frais par lavage. Pour immobiliser la lamelle sur une lame de verre, placez une petite goutte de vernis à ongles transparent sur une lame de verre stérilisée et placez un bord du côté acellulaire de la lamelle sur la goutte de vernis à ongles et abaissez la lamelle sur la lame, côté cellule vers le haut.

Ajoutez quelques gouttes de PBS sur la lamelle immobilisée pour empêcher les cellules de se déshydrater et utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle autour de l’extérieur de la lamelle. Lorsque la barrière a été tirée, remplacez le PBS par 100 microlitres de protéase III et placez la lame dans un incubateur à 40 degrés Celsius pendant 15 minutes. À la fin de l’incubation, lavez les lames deux fois dans du PBS frais pendant deux minutes par lavage à bascule.

Après le deuxième lavage, diluez la sonde d’intérêt dans 200 microlitres de tampon d’hybridation à 67 degrés Celsius pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 50 microlitres de solution de sonde à chaque lamelle et placez les lames dans un four humidifié à 40 degrés Celsius pendant deux heures. À la fin de l’incubation, lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage frais et à bascule pendant deux minutes par lavage.

Après le deuxième lavage, tapotez les lames pour éliminer l’excès de tampon et traitez séquentiellement les lamelles de recouvrement avec une goutte des amplificateurs pour les canaux fluorescents 1, 2 et 3 pour une incubation de 30 minutes, 40 degrés Celsius par amplificateur avec deux lavages de deux minutes dans un tampon de lavage frais avec balancement par lavage entre les traitements. Après le dernier lavage, ajoutez une goutte de l’amplificateur fluorescent du canal 4 à la lamelle pour une incubation de 15 minutes dans le four à 40 degrés Celsius et lavez la lame deux fois avec un tampon de lavage et une fois avec du PBS, comme illustré. Pour l’immunocoloration des protéines d’intérêt, après le dernier lavage, traiter chaque lamelle avec 200 microlitres de tampon bloquant pour une incubation d’une heure à température ambiante.

À la fin de l’incubation, décantez le tampon de blocage et ajoutez 200 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dilué dans du PBS plus Tween 20 complété par 1 % d’albumine sérique bovine. Après une incubation d’une heure à température ambiante, laver les lames avec deux lavages de 10 minutes dans du PBS frais plus Tween 20 avec agitation par lavage avant d’étiqueter les échantillons avec un anticorps secondaire approprié pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, lavez les lames deux fois avec du PBS plus Tween 20 frais pendant 10 minutes en secouant par lavage.

Après le deuxième lavage, contre-colorez les noyaux avec un colorant nucléaire approprié pendant une minute à température ambiante, suivi de deux lavages dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante en agitant. Pour monter les échantillons pour l’imagerie, placez une goutte de solution anti-décoloration sur une nouvelle lame de verre stérile par échantillon et étalez la solution pour couvrir une zone d’environ la taille des lamelles. Détachez les lamelles de leurs glissières et immergez-les dans le PBS.

À l’aide d’une pince, retirez tout résidu de vernis à ongles et séchez le dos de la lamelle avec une lingette de laboratoire. Ensuite, placez délicatement chaque lamelle, côté échantillon vers le bas, sur la solution anti-décoloration et laissez les échantillons sécher pendant la nuit. Comme preuve de concept de cette procédure, l’ADN, l’ARN et les protéines du VIH-1 ont été simultanément marqués et visualisés au microscope au niveau de la cellule unique.

Dans cet exemple, deux génomes d’ADN du VIH-1 peuvent être visualisés dans une seule cellule car ils transcrivent activement l’ARN viral. L’ARN viral a été exporté à travers le complexe de pores nucléaires et la protéine virale a été synthétisée dans le cytoplasme. Comme observé, très peu ou pas de réactivité croisée est observée entre les ensembles de sondes entre les deux virus, malgré le marquage avec deux rétrovirus présentant un potentiel de réactivité croisée de la sonde.

De plus, la coloration de l’ARN viral peut être éliminée si les cellules sont traitées avec de la RNase lors de la préparation de l’échantillon. L’intensité moyenne de fluorescence intégrée du signal d’anticorps par cellule dans chaque image peut ensuite être quantifiée. Comme on l’a observé, la quantité d’ARN prégénomique du VHB et d’ARN total du VHB augmente au cours de l’infection par le VHB.

L’imagerie de l’infection par le VHC peut également être réalisée par microscopie confocale à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 60X pour détecter les fluorophores d’intérêt. Cette approche très spécifique permet également le suivi sur des processus viraux ou cellulaires avec une haute résolution temporelle spatiale. De plus, cette technique peut être utilisée pour étudier plusieurs virus et autres agents pathogènes.