Flux de travail de tomographie en réseau pour l’acquisition ciblée d’informations de volume à l’aide de la microscopie électronique à balayage

L’analyse par microscopie électronique est souvent complexe. Nous pensons que notre protocole facilite le traitement et l’acquisition des données EM à partir de la grande surface de l’échantillon et du volume intermédiaire. Notre protocole aide à trouver des structures cibles dans des sections série.

L’enregistrement des données est limité à ce qui est nécessaire. Par rapport à l’acquisition de données dans des blocs de tissus entiers, le temps d’enregistrement est réduit et l’analyse des données plus facile. Compte tenu de la facilité globale de l’approche, nous pensons qu’elle peut être utilisée non seulement pour répondre à des questions scientifiques, mais aussi comme outil de diagnostic.

Pour générer un réseau à analyser, serrez d’abord l’échantillon sur un support ultramicrotome et utilisez une lame de rasoir pour couper grossièrement la résine autour de l’échantillon. Utilisez un outil de coupe en diamant pour couper finement l’échantillon et utilisez des couteaux de coupe d’inclinaison de 20 ou 90 degrés pour vous assurer que les surfaces supérieure et inférieure du bloc sont parallèles au tranchant du couteau. Mélangez le xylène et la colle dans une proportion de 3:1 et utilisez un cil attaché à un cure-dent pour appliquer le mélange sur les bords supérieur et inférieur du bloc coupé.

Pendant que le mélange sèche, utilisez un outil de clivage de plaquette pour couper un morceau de plaquette à la taille appropriée pour l’analyse. Nettoyez la plaquette à l’eau distillée pour rincer les débris et nettoyez la surface avec du plasma une fois la plaquette sèche. Pour préparer un couteau de tomographie à matrice, utilisez du ruban adhésif mousseux pour attacher une aiguille au fond d’un couteau jumbo histo et placez le couteau dans le support ultra microtome à zéro degré.

Ajustez le bord du couteau parallèlement à la surface du bloc et amenez le bloc coupé sur le bord du couteau dans une position prête pour le sectionnement. Placez la plaquette propre dans le bassin du couteau et remplissez le bassin avec de l’eau au même niveau que le bord du couteau, puis laissez le bord en diamant du couteau s’humidifier correctement, en utilisant la seringue attachée pour ajouter ou retirer de l’eau si nécessaire. Pour la section de réseau, réglez le microtome sur une plage de coupe de 50 à 100 nanomètres et une vitesse de coupe de 6 à 1 millimètre par seconde, et commencez à sectionner pour obtenir un ruban assez long pour couvrir un volume Z ciblé.

Selon la taille du bloc, l’homogénéité du tissu et le type de résine, le ruban sera approximativement droit. Utilisez une pointe de cil propre et non collante pour détacher les rubans du bord du couteau. Utilisez les cils pour déplacer doucement le ruban vers le centre du support.

Du chloroforme ou un stylo chauffant peut être utilisé pour étirer la section si nécessaire. Après l’étirement, rétractez la seringue pour commencer à drainer l’eau. Pour des rubans plus délicats ou une rétraction plus lente de l’eau, détachez la seringue du tuyau pour laisser couler l’eau.

Lorsque le niveau d’eau atteint le niveau de la plaquette, poussez doucement le ruban au centre du bassin et continuez à s’écouler jusqu’à ce que toute l’eau restante soit complètement retirée du bassin. Laissez sécher la plaquette dans un environnement propre. Le séchage prend environ 30 minutes.

Lorsque l’échantillon est complètement séché, transférez le réseau dans une boîte bien fermée pour le protéger de la contamination par la saleté. Et placez la boîte dans un four à 60 degrés Celsius pendant au moins 30 minutes. Pour acquérir une carte d’ensemble des images SEM qui révèle l’emplacement des sections sur la plaquette, utilisez la caméra optique intégrée pour acquérir une image SEM qui couvre un ruban de sections.

Pour créer une mosaïque, cliquez et faites glisser l’image de la caméra de l’échantillon et démarrez l’acquisition automatique. Acquérir des vues d’ensemble à une résolution plus élevée pour trouver des structures cibles. Si seules quelques sections doivent être imagées, utilisez une visionneuse zoomable pour afficher les images acquises à leur emplacement d’origine.

Une fois qu’une section qui doit être imagée en haute résolution a été identifiée, cliquez et faites glisser pour créer une région d’imagerie, puis sélectionnez Paramètres d’imagerie haute résolution et stockez les paramètres dans un modèle Pour rechercher des événements rares particulièrement petits ou difficiles à détecter, utilisez les paramètres d’imagerie haute résolution sur chaque 10e section ou sur une section par ruban pour créer manuellement une région d’imagerie et acquérir les images. Ensuite, passez en revue les images et marquez les sections qui contiennent la région d’intérêt. Pour acquérir plus de 10 sections consécutives, utilisez l’outil de recherche de sections pour localiser automatiquement toutes les sections.

Si les images d’aperçu ne montrent pas de régions d’intérêt claires, acquérez des images de plus haute résolution des sections et utilisez la fonction d’aperçu des sections pour créer et acquérir automatiquement les images. Pour déterminer les paramètres d’imagerie optimaux, activez l’imagerie en direct dans le logiciel de contrôle du microscope et accédez à une région d’intérêt, puis ajustez les paramètres d’imagerie jusqu’à ce que les images montrent des régions d’intérêt claires, mais sans acquisition d’image excessivement longue, conformément aux directives du fabricant. Pour optimiser le positionnement des régions d’imagerie sur des sections consécutives, effectuez un zoom sur l’image d’intérêt et cliquez sur Affiner la position de départ pour augmenter la précision des emplacements de section enregistrés.

Pour définir une région d’imagerie, cliquez et faites glisser sur n’importe quelle section tout en maintenant la touche Alt enfoncée et sélectionnez Créer un tableau de jeux de tuiles dans le menu contextuel contextuel. Le logiciel créera des régions d’imagerie au même emplacement relatif dans toutes les sections qui ont été trouvées ou précédemment marquées. Configurez ensuite le nombre de pixels, la taille des pixels, la disposition des mosaïques et le temps de séjour des pixels dans chaque série d’images, selon vos besoins.

Pour configurer la fonction automatique, créez une série d’images distincte pour les fonctions automatiques, comme illustré, et déplacez la série d’images vers une position sur la section qui contient des structures à contraste élevé. Définissez la série d’images sur 1024 x 884 pixels et sélectionnez une taille de pixel correspondant à la résolution la plus élevée utilisée dans la série d’images. Dans la liste des fonctions automatiques, cochez Mise au point automatique et Stigmate automatique.

Sélectionnez Bisection dans les contrôles de séquence d’acquisition et confirmez que l’image de la fonction automatique est le premier élément de la liste, puis cliquez sur Acquérir tout pour démarrer l’acquisition d’image. Lorsque toutes les séries d’imagerie ont été créées et configurées, les séries sont répertoriées dans une file d’attente de tâches. L’acquisition basse résolution peut être effectuée manuellement ou automatiquement directement sur des parties sélectionnées de la section ou une section entière à l’aide d’une imagerie simple ou mosaïque, suivie d’une couture.

Les images de la zone sélectionnée peuvent ensuite être acquises à l’aide de paramètres à haute résolution pour visualiser les mitochondries, les noyaux et les microvillosités, par exemple, une fois l’acquisition automatique des cartes mosaïques résolues sélectionnée, plusieurs régions d’intérêt peuvent être recadrées ou utilisées pour définir des zones d’imagerie locales supplémentaires dans les régions. Bien que différents types de cellules spécialisées dans l’intestin de la drosophile soient distribués de manière aléatoire, ils peuvent être distingués visuellement après avoir examiné les images à l’aide de paramètres à haute résolution, soit à partir de sections individuelles, soit sous la forme d’une collection d’images en série. Après l’alignement, les piles peuvent être rendues à l’aide de différentes solutions logicielles.

L’analyse par tomographie en réseau permet de générer de nombreuses sections séquentielles sur la plaquette unique et de les filtrer à l’aide de paramètres à basse résolution pour localiser les zones d’intérêt générales. Ces zones peuvent être ciblées pour une analyse plus approfondie à l’aide de paramètres d’acquisition avancés. Par exemple, les divisions mytotiques dans le notum ne sont pas faciles à localiser au niveau ultra-structurel, car les cellules sont relativement grandes par rapport à la zone d’abscission.

En utilisant cette méthode, cependant, les images de vue d’ensemble automatiques à moyenne résolution des sauts de 20 à 40 sections peuvent être utilisées pour localiser les cellules en division. La procédure de tomographie en réseau fournit une analyse plus simple des données de microscopie électronique. Nous encourageons les téléspectateurs à investir dans la maîtrise de la régénération et à se familiariser avec le flux de travail lié aux cartes D’après notre expérience, peu de sujets de recherche nécessitent l’analyse ultra-structurelle d’animaux entiers ou d’organes entiers.

Notre méthode aide à localiser rapidement les cellules et leurs partenaires d’interaction dans les tissus.