Ingénierie génomique des cellules B humaines primaires à l’aide de CRISPR/Cas9

Ce protocole permet aux chercheurs d’éliminer avec précision un gène dans les lymphocytes B pour étudier les effets de perte de fonction de ce gène ou d’insérer un gène trans pour une expression stable du gène trans qui peut être utilisé à des fins de recherche ou thérapeutiques. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle fournit une plate-forme universelle qui permet de concevoir facilement et précisément des cellules B à haut rendement. Cette méthode peut être utilisée pour modifier les lymphocytes B afin qu’ils expriment des anticorps ou des enzymes recombinants, puis transfèrent ces lymphocytes B pour traiter des infections ou dans des enzymopathies.

Pour commencer, décongelez les lymphocytes B dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, transférez deux millilitres de FBS préchauffé dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Une fois que les lymphocytes B sont complètement décongelés, ajoutez immédiatement un millilitre de FBS préchauffé, goutte à goutte, dans l’échantillon.

Incuber à température ambiante pendant une minute. Pipetez doucement pour remettre l’échantillon en suspension et transférez tout le volume, goutte à goutte, dans un tube conique contenant deux millilitres de FBS préchauffé. Portez le volume à 15 millilitres avec du PBS stérile, puis bouchez le tube et retournez-le doucement deux à trois fois.

Centrifugez l’échantillon à 400 fois G pendant cinq minutes, puis jetez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Remettez la pastille en suspension avec un millilitre de milieu d’expansion de cellules B pré-équilibré et comptez les cellules. Le nombre total de cellules doit être d’environ 10 à la septième cellule.

Transférez les cellules dans un ballon contenant 20 millilitres du milieu d’expansion des cellules B pré-équilibré. La concentration finale des cellules doit être d’environ cinq fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Incuber le ballon verticalement dans un incubateur de culture tissulaire.

Préparez le substrat de transfection CRISPR/Cas9 en mélangeant un microgramme d’ARNg chimiquement modifié avec 1,5 microgramme d’ARNm du noyau Cas9 de Streptococcus pyogenes chimiquement modifié par réaction de transfection. Pour le contrôle, ajoutez un microlitre de tampon TE, au lieu de sgRNA, dans un tube de 0,2 millilitre d’une bandelette de huit tubes. Allumez un électroporateur et préparez les réactifs d’infection nucléaire.

Comptez et transférez 1 million de lymphocytes B par réaction de transfection, dans un tube conique stérile. Porter le volume à 15 millilitres avec du PBS stérile et centrifuger à 400 fois G pendant cinq minutes. Après la centrifugation, jeter le surnageant.

Remettez les cellules en suspension avec 10 millilitres de PBS stérile et centrifugez-les à 400 fois G pendant cinq minutes, puis jetez complètement le surnageant sans déranger la pastille cellulaire. Ajoutez 0,5 microgramme d’ARNm GFP chimiquement modifié pour 1 million de cellules B dans la pastille cellulaire. Remettez la pastille en suspension avec 20 microlitres de réactif de transfection de cellules primaires pour 1 million de cellules B et mélangez doucement en pipetant cinq à six fois.

Transférez 20,5 microlitres par réaction de transfection dans les tubes de 0,2 millilitre contenant le réactif CRISPR/Cas9. Pipetez une fois de haut en bas pour mélanger et transférer tout le volume dans une cuvette de transfection. Boucher et tapoter doucement la cuvette sur le banc pour s’assurer que le liquide recouvre le fond de la cuvette.

Utilisez le protocole des cellules B primaires humaines sur l’électroporateur pour la transfection. Laisser reposer les cellules électroporées dans la cuvette à température ambiante pendant 15 minutes. Transférez ensuite 80 microlitres du milieu d’expansion pré-équilibré des cellules B dans la réaction de transfection dans la cuvette.

Placez la cuvette dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 30 minutes. Pipez-le doucement la tête plusieurs fois pour mélanger et transférer tout le volume de l’échantillon de la cuvette vers un puits approprié d’une plaque de culture tissulaire de 48 puits contenant un millilitre de milieu d’expansion des cellules B. La concentration finale des cellules doit être de 1 million de cellules par millilitre.

En réalisant une expérience d’inactivation génique, transférez un vecteur viral adéno-associé recombinant de type six à 500 000 multiplicité d’infection dans le puits approprié contenant des cellules électroporées. Placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec humidité. Dans l’expérience d’inactivation, le nombre de cellules B a montré plus de 80 % de cellules viables avec une légère réduction de la récupération cellulaire dans les échantillons de contrôle et de CD19 à 24 heures après l’électroporation.

Les lymphocytes B ont été prélevés le cinquième jour après la transfection pour la cytométrie en flux et l’analyse des marées. Les diagrammes de dispersion représentatifs des échantillons de contrôle et d’inactivation ont montré respectivement 14 et 95 % de cellules CD19 négatives, démontrant une réduction significative de l’expression de CD19 dans les échantillons d’inactivation. Les chromatogrammes de séquençage génomique ont montré des doubles pics dans les lymphocytes B knock-out CD19, indiquant des insertions ou des délétions de nucléotides post-cassures double brin médiées par CRISPR/Cas9.

L’analyse Indel des chromatographes des échantillons knock-out a montré un pourcentage élevé de formation d’indel au locus CD19, ce qui est cohérent avec le pourcentage de perte de protéine CD19 détecté par cytométrie en flux. Les lymphocytes B de l’expérience d’entraînement ont été collectés le 12e jour, après l’ingénierie. Les nuages de points ont montré que 64 % des cellules EGFP positives dans l’échantillon qui a reçu le vecteur viral de type six associé à l’adéno recombinant, ainsi que la RNP, alors qu’une positivité nulle ou minimale de l’EGFP a été observée dans les échantillons de contrôle et de vecteur uniquement, respectivement.

Une amplification PCR de jonction a montré des amplicons de 1,5 paire de kilobases dans l’échantillon d’injection et aucun produit de PCR n’a été observé dans l’échantillon de contrôle ou de vecteur seul. Le comptage des cellules a montré que le processus d’ingénierie affecte davantage la récupération cellulaire dans l’échantillon knock-in que dans les échantillons de contrôle ou de vecteur seul. Cependant, tous les échantillons ont rapidement rebondi dans les trois jours suivant l’ingénierie.

Cette procédure peut également être utilisée pour introduire des agents d’édition de bases pour modifier des paires de bases simples afin d’induire ou de corriger des mutations ponctuelles dans le génome des cellules B. Il pourrait également être utilisé pour introduire des codons d’arrêt prématurés ou pour modifier les sites d’épissage, permettant ainsi l’inactivation de plusieurs gènes sans risque de translocations chromosomiques. Avant que cette technique ne soit développée, l’ingénierie des lymphocytes B humains demandait l’utilisation d’autres approches de génie génétique plus difficiles.

Cette technique est une alternative plus facile, moins coûteuse et plus rapide. Il pourrait également être utilisé pour synthétiser des produits de thérapie cellulaire à des fins cliniques.