Un test de cytométrie en flux basé sur l’ADN / Ki67 pour l’analyse du cycle cellulaire des lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène chez des souris vaccinées
5 janvier 2021
L’expansion clonale est une caractéristique clé de la réponse des lymphocytes T spécifiques à l’antigène. Cependant, le cycle cellulaire des lymphocytes T répondant à l’antigène a été mal étudié, en partie à cause de limitations techniques. Nous décrivons une méthode de cytométrie en flux pour analyser les lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène à expansion clonale dans la rate et les ganglions lymphatiques de souris vaccinées.
Notre protocole fournit une approche pratique par laquelle la rate et les ganglions lymphatiques de souris peuvent être utilisés pour refléter la dynamique de la réponse des lymphocytes T plus que de fournir un instantané phénotypique à l’état d’équilibre. Notre technique détecte avec sensibilité les lymphocytes T CD8 spécifiques de l’antigène qui sont engagés dans une réponse continue. Les lymphocytes T CD8 proliférants sont mesurés sans les effets confusionnels possibles du traitement médicamenteux in vivo ou du transfert cellulaire.
Notre technique peut fournir une fenêtre sur la dynamique immunitaire dans plusieurs contextes. Par exemple, en ce qui concerne la réponse à la vaccination et aux infections, aux maladies auto-immunes et à l’immunothérapie du cancer. Préparez un tampon de lavage de perméabilisation frais 1x en diluant 10x tampon de perméabilisation avec de l’eau distillée et filtrez-le à travers un filtre de 0,45 micromètre pour éliminer les agrégats.
Diluer l’anticorps monoclonal Ki67 FITC dans 1x tampon de lavage de perméabilisation tel que déterminé avec une expérience de titrage pour un volume final de 100 microlitres par échantillon. Ajouter 3 millilitres du tampon de lavage à perméabilisation 1x à chaque tube avec cellules et centrifuger à 400 G pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant.
Encore une fois, ajoutez le tampon de lavage de perméabilisation 1x et la centrifugeuse pour granuler les cellules. Ensuite, jetez le surnageant. Ajouter 100 microlitres d’anticorps monoclonal dilué Ki67 FITC à la pastille, puis vortex et incuber pendant 30 minutes dans l’obscurité.
Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec 4 millilitres de 1x tampon de perméabilisation, en centrifugant après chaque lavage, et jetez le surnageant. Ajouter 350 microlitres de PBS à la pastille cellulaire pour les échantillons à acquérir directement au cytomètre en flux et 250 microlitres de PBS à la pastille cellulaire pour les échantillons à incuber avec Hoechst pour la coloration de l’ADN. Préparer la solution de Hoechst et de PBS et l’ajouter à chaque échantillon de sorte que la concentration finale soit de deux microgrammes par millilitre.
Vortex et incuber les échantillons pendant 15 minutes dans l’obscurité. Ensuite, centrifugez les échantillons pendant cinq minutes et ajoutez 350 microlitres de PBS à la pastille de cellule. Ouvrez le logiciel et créez différents groupes correspondant aux différents organes à analyser en cliquant sur Créer un groupe dans la section du ruban de l’espace de travail.
Ouvrez la fenêtre du groupe modifié en double-cliquant sur le nom du groupe et synchronisez les groupes nouvellement créés en insérant une coche sur la fonction synchronisée. Faites glisser chaque fichier FCS vers son groupe correspondant, puis créez une stratégie de contrôle commençant par un groupe a-LN. Ouvrez la fenêtre du graphique en double-cliquant sur l’échantillon entièrement coloré pour afficher les événements non liés acquis pour l’échantillon dans un diagramme à points.
Notez que les axes X et Y sont étiquetés comme dans les fichiers FCS, comme indiqué dans le tableau deux du fichier de paramètres du cytomètre en flux de ce manuscrit. Vérifiez qu’un nombre suffisant d’événements est affiché pour une visualisation appropriée. Si nécessaire, ouvrez les préférences en cliquant sur l’icône en forme de cœur dans le ruban de l’espace de travail, sélectionnez Graphiques, puis Point Plot comme type de graphique, et vérifiez que le nombre de points dessinés dans la case correspondante est correct ou modifiez-le.
Affichez les événements non groupés dans la fenêtre du graphique dans un diagramme à points avec l’ADN-A sur l’axe des x et l’ADN-W sur l’axe des y. Utilisez l’échelle linéaire pour les deux axes. Si nécessaire, changez l’échelle de logarithmique à linéaire en cliquant sur la case indiquée avec un T proche de chaque axe dans la fenêtre graphique.
Sélectionnez une population de cellules uniques en cliquant sur rectangle dans la section de l’outil de contrôle, puis double-cliquez au centre de la porte rectangulaire pour afficher des cellules simples dans un diagramme à points avec le paramètre FSC-A sur l’axe des x et la matrice de cellules mortes sur l’axe des y. Cliquez sur le polygone pour sélectionner la population de cellules vivantes, qui sont négatives pour les matrices de cellules mortes. Double-cliquez au centre de la porte du polygone pour afficher les cellules dans un diagramme à points avec le paramètre FSC-A sur l’axe des x et le paramètre SSC-A sur l’axe des y.
Cliquez sur le rectangle et créez une porte détendue pour inclure toutes les cellules vivantes uniques dans ce graphique. Double-cliquez au centre de la porte détendue pour afficher les cellules dans un diagramme à points avec CD3 sur l’axe des x et CD8 sur l’axe des y. Utilisez l’échelle d’accès appropriée pour la visualisation dans la fenêtre graphique.
Si nécessaire, modifiez l’échelle x et y en cliquant sur la case, indiquée par un T proche de chaque axe, choisissez Personnaliser la fonction d’accès et modifiez les décennies supplémentaires avec des bases et des décennies positives si nécessaire. Sélectionnez les cellules CD3+CD8+ en cliquant sur polygone. Double-cliquez au centre de la porte CD3+CD8+ pour afficher les cellules dans un diagramme à points avec Tetr-gag sur l’axe des x et Pent-gag sur l’axe des y.
Sélectionnez les lymphocytes T CD8 spécifiques à l’antigène en cliquant sur polygone. Double-cliquez au centre de la porte spécifique au bâillon pour afficher les cellules dans un diagramme à points avec l’ADN-A sur l’axe des x et Ki67 sur l’axe des y. Sélectionnez les cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire en cliquant sur Quad » dans la section de l’outil de contrôle de la fenêtre graphique.
Copiez la stratégie de contrôle créée dans un exemple dans le groupe correspondant pour appliquer les portes à tous les échantillons du groupe. Ensuite, copiez les stratégies de contrôle pour les groupes b-rate et CBM, comme décrit dans le manuscrit du texte. Vérifiez que toutes les portes sont appropriées pour chaque échantillon des trois groupes.
Si nécessaire, désynchronisez le groupe et modifiez les portes comme décrit dans le manuscrit. Affichez les cellules BM de la porte détendue dans un diagramme à points avec l’ADN-A sur l’axe des x et Ki67 sur l’axe des y. Visualisez les résultats en cliquant sur Éditeur de mise en page dans la section du ruban de l’espace de travail.
Faites glisser chaque porte de la stratégie de contrôle dans le volet d’exemple vers l’éditeur de mise en page et placez les tracés en fonction de la séquence de la grille. Si nécessaire, modifiez le type de graphique en double-cliquant sur le tracé correspondant dans la mise en page et en sélectionnant le type approprié dans la fenêtre de définition du graphique. Cliquez sur le groupe et itérez par fonctions sur le ruban de mise en page pour visualiser les résultats obtenus dans les lymphocytes T CD8 spécifiques à l’antigène de chaque organe et comparer différents échantillons.
Visualisez les résultats des cellules de la moelle osseuse représentant un contrôle positif. Un exemple typique d’analyse du cycle cellulaire des cellules de la moelle osseuse est présenté ici. Le protocole a donné un faible coefficient de variation des pics d’ADN G0 à G1 et G2 à M, indiquant une excellente qualité de la coloration de l’ADN.
Une stratégie de contrôle en cinq étapes a été utilisée pour identifier les cellules CD8 spécifiques de l’antigène. Deux multimères ont été utilisés pour améliorer la sensibilité de la détection des lymphocytes T CD8 spécifiques au bâillon chez les souris vaccinées sans augmenter le fond de coloration chez les souris non traitées. Les lymphocytes T CD8 spécifiques du Bâillon dans les ganglions lymphatiques drainants et dans la rate contiennent une forte proportion de cellules dans les phases S-G2/M au troisième jour après le coup de pouce.
De plus, les lymphocytes T CD8 spécifiques au bâillon dans les phases S-G2/M présentaient un TAUX ÉLEVÉ de FSC-A et de SSC-A lorsqu’ils étaient superposés sur le total des lymphocytes T CD8 du même organe. Les histogrammes décalés ont montré que l’expression de CD62L par les lymphocytes T CD8 spécifiques au bâillon était faible, comme prévu pour les lymphocytes T activés, à l’exception de quelques cellules dans G0 dans les ganglions lymphatiques. Cette méthode est conçue pour que les lymphocytes T obtiennent une excellente qualité de coloration de l’ADN avec la membrane et la coloration Ki67.
L’analyse des données de cytométrie en flux est un point clé. Assurez-vous d’utiliser un contrôle approprié pour le positionnement de la porte. En utilisant cette méthode, nous avons découvert des lymphocytes T dans les phases S-G2/ M du cycle cellulaire chez le sang périphérique de la souris et de l’homme.
Cette technique a été utile dans les études d’immunosurveillance du diabète de type 1, de la mononucléose infectieuse et de la COVID-19.
Aperçu
Cette étude présente une méthode de cytométrie en flux permettant d'analyser les lymphocytes T CD8 spécifiques d'un antigène en expansion clonale dans la rate et les ganglions lymphatiques de souris vaccinées. Cette technique permet la détection des réponses des lymphocytes T sans les effets perturbateurs liés au traitement in vivo par des médicaments ou au transfert cellulaire.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Cytométrie en flux
- Biologie des lymphocytes T
Contexte
- L'expansion clonale est cruciale pour les réponses des lymphocytes T spécifiques aux antigènes.
- Le cycle cellulaire des lymphocytes T en réponse a été peu exploré en raison de difficultés techniques.
- La compréhension de la dynamique des lymphocytes T est essentielle pour obtenir des informations sur les réponses immunitaires.
- Cette étude répond au besoin d'une méthode permettant d'analyser les réponses des lymphocytes T en temps réel.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pour analyser les lymphocytes T CD8 spécifiques d'un antigène in vivo.
- Fournir des informations sur la prolifération des lymphocytes T durant les réponses immunitaires.
- Faciliter l'étude de la dynamique des lymphocytes T dans divers contextes immunologiques.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un tampon de lavage de perméabilisation frais pour la coloration cellulaire.
- Utilisation de l'anticorps monoclonal Ki67 FITC pour détecter les lymphocytes T en prolifération.
- Analyse par cytométrie en flux pour évaluer les populations de lymphocytes T et leurs états d'activation.
- Stratégies de sélection pour isoler les lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène à partir de populations mixtes.
Résultats principaux
- La méthode détecte avec succès les lymphocytes T CD8 spécifiques d'un antigène impliqués dans des réponses actives.
- La prolifération des lymphocytes T CD8 peut être mesurée avec précision, sans variables de confusion.
- La technique fournit des informations sur la dynamique des lymphocytes T lors de la vaccination et de l'infection.
- Les résultats démontrent l'utilité de cette méthode pour l'étude des maladies auto-immunes et de l'immunothérapie anticancéreuse.
Conclusions
- La méthode cytométrique en flux développée est efficace pour analyser les réponses des lymphocytes T.
- Cette approche améliore la compréhension des dynamiques immunitaires dans divers contextes.
- De futures études pourront exploiter cette technique afin d'explorer le comportement des lymphocytes T dans la santé et la maladie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une quantification précise de la prolifération des lymphocytes T CD8 spécifiques d'un antigène in vivo, comblant ainsi un manque critique dans la surveillance immunitaire pour le développement de vaccins et d'immunothérapies. En distinguant les phases G0, G1 et S-G2/M sans recourir à des analogues de nucléotides ou à la dilution de colorants, elle fournit une image mécanistique des dynamiques d'expansion clonale. Cela facilite la validation des cibles et l'identification de candidats thérapeutiques en reliant l'interaction avec l'antigène aux états prolifératifs fonctionnels dans les modèles précliniques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en corrélant la spécificité de l'antigène à la progression du cycle cellulaire dans les lymphocytes T répondeurs.
- Valeur opérationnelle : Fournit un signal lisible reproductible par cytométrie en flux pour la validation fonctionnelle de cibles, indépendamment des limites liées à la BrdU ou au CFSE.
- Valeur prédictive : Facilite la réduction des risques mécanistiques en quantifiant la proportion de lymphocytes T spécifiques de l'antigène engagés en mitose par rapport à ceux en phase G1 ou G0.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l'emploi pour les tests : Génère des résultats quantitatifs normalisés (ADN-A contre Ki67) adaptés au criblage à haut débit de candidats vaccins ou d'immunomodulateurs.
- Reproductibilité : Utilise l'Hoechst 33342 pour une discrimination de haute résolution des pics d'ADN, assurant une séparation constante des phases G0/G1 et G2/M entre les échantillons.
- Extensibilité : Compatible avec l'analyse multi-organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse) et adaptable aux espèces précliniques pour des comparaisons entre études.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Applicable aux études d'efficacité vaccinale, comme le montre l'enrichissement en phase S-G2/M des lymphocytes T CD8 spécifiques de l'antigène chez des souris vaccinées avec un vecteur HIV-gag.
- Continuité translationnelle : Fait le lien entre les phases de découverte et préclinique en fournissant une mesure cinétiquement résolue de l'expansion des lymphocytes T, prédictive de l'ampleur de la réponse immunitaire.
- Décisions ajustées au risque : Permet d'établir des critères d'engagement ou de non-engagement fondés sur la cinétique proliférative des clones spécifiques de l'antigène, réduisant ainsi la dépendance exclusive vis-à-vis des marqueurs phénotypiques terminaux.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Le test s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique, permettant une évaluation précoce de la capacité de prolifération des lymphocytes T après immunisation et orientant l'optimisation du candidat médicamental par un profilage immunitaire fonctionnel.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en associant la reconnaissance de l'antigène (via multimère CMH) au statut du cycle cellulaire, permettant de déterminer si cette interaction induit la prolifération ou l'anergie.
- Essais de criblage : Fournit des données quantitatives prêtes à l'analyse sur la distribution du cycle cellulaire, permettant de comparer les effets de différentes plateformes vaccinales ou d'adjuvants sur l'expansion des lymphocytes T.
- Analytique : Génère des lectures multiparamétriques (contenu en ADN, Ki67, diffusion, spécificité antigénique) permettant des comparaisons statistiques des indices de prolifération entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : S'intègre à la validation préclinique en identifiant des sous-populations de lymphocytes T activés et en cycle dont l'abondance corrèle avec une immunité protectrice dans les modèles d'infection et de cancer.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme reproductible de surveillance immunitaire pour des études longitudinales dans les programmes de recherche sur les maladies auto-immunes, les maladies infectieuses et l'immuno-oncologie.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en résolvant l'hétérogénéité proliférative au sein des populations de lymphocytes T spécifiques de l'antigène.
- Valeur opérationnelle : Assure une standardisation grâce à une stratégie de gating fixe et à une coloration de l'ADN basée sur l'Hoechst, réduisant ainsi la variabilité entre les essais.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant l'élimination précoce des risques associés aux candidats immunomodulateurs, fondée sur la cinétique fonctionnelle des lymphocytes T.
- Impact sur le portefeuille : Guide la progression ajustée au risque en quantifiant la fraction proliférative des lymphocytes T spécifiques de l'antigène comme biomarqueur de la qualité de la réponse.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en cytométrie en flux multicolore, y compris des contrôles de compensation pour les signaux FITC-Ki67 et Hoechst.
- Suppose l'accès à un cytomètre en flux capable d'excitation UV pour la détection de l’Hoechst 33342 et doté de jeux de filtres appropriés.
- Exige des protocoles standardisés de perméabilisation et de lavage afin de préserver l'intégrité des épitopes pour Ki67, les multimères et les marqueurs de surface.
- Implique l'optimisation de la concentration d’Hoechst (2 µg/mL) et du temps d'incubation pour éviter la cytotoxicité tout en obtenant une résolution optimale des pics d'ADN.
- Dépend d'une hiérarchie de fenêtrage adéquate, commençant par l'exclusion des événements doubles et des cellules vivantes, afin d'assurer une identification précise des lymphocytes T spécifiques de l'antigène.
