Méthode de brouillage de l’ARN à base d’électroporation à Odonata

Il s’agit d’un protocole vidéo pour la méthode d’interférence arn à base d’électroporation dans Odonata. Libellules et demoiselles, membres de l’ordre Odonata, sont parmi les insectes les plus ancestraux. Odonata adulte montrent une diversité remarquable dans les couleurs du corps et les modèles, et de nombreuses études écologiques et comportementales ont été menées.

Cependant, les études génétiques moléculaires sur Odonata ont fait défaut, parce que l’analyse fonctionnelle des gènes est très difficile. Par exemple, la méthode rnai conventionnelle n’est pas efficace chez les espèces odonata. Récemment, nous avons établi une méthode RNM en combinaison avec l’électroporation in vivo.

Ici, nous fournissons un protocole vidéo pour le RNAi à base d’électroporation dans les libellules et les demoiselles. En tant qu’espèce représentative de damselflies, nous utilisons le damselfly à queue bleue. Ischnura senegalensis.

C’est l’une des espèces de damselfly les plus communes et souvent trouvée dans les étangs ensoleillés au Japon. Tout d’abord, nous montrons le protocole RNAi ciblant l’abdomen d’un damselfly, Ischnura senegalensis. Après anesthésie glacée à cette deux broches des deux côtés du prothorax et fixer la larve à un support fixe.

Tirez et étirez la membrane interse segmentale entre le septième et le huitième segment abdominal à l’aide de forceps. Gardez la membrane interse segmentale tendue à la main. Insérez la pointe du capillaire préparé dans la membrane intersegmentale étirée.

Injectez 1 microlitre de solution siRNA ou dsRNA. Appliquer deux gouttelettes de gel à ultrasons sur la surface larvaire à l’aide de forceps. Placez les électrodes sur le gel à ultrasons, avec l’électrode positive sur le côté de l’injection.

Générer 10 fois des impulsions d’électroporation à l’aide d’un électroporateur. Essuyer le reste du gel sur la surface à l’l’l’insu de papier. Enlever les broches d’insectes et garder les larves traitées sur une serviette en papier humide pendant environ un jour pour la récupération.

Ensuite, nous montrons le protocole RNAi ciblant le thorax d’un damselfly, Ischnura senegalensis. Après anesthésie glacée fixer deux broches des deux côtés du prothorax et fixer la larve à un support fixe. Tirez et étirez la membrane intersegmentale entre le prothorax et le synthorax à l’aide de la main.

Insérez la pointe du capillaire préparé dans la membrane intersegmentale étirée. Injectez un microlitre de solution siRNA ou dsRNA. Appliquer deux gouttelettes de gel à ultrasons sur la surface de la larve à l’aide de forceps.

Placer les électrodes sur le gel à ultrasons, avec une électrode positive sur le côté de l’injection. Générer 10 fois des impulsions d’électroporation à l’aide d’un électroprolateur. Essuyer le reste du gel sur la surface à l’l’l’insu de papier.

Enlever les broches d’insectes et garder les larves traitées sur une serviette en papier humide pendant environ un jour pour la récupération. En tant qu’espèce représentative de libellule, nous utilisons la libellule pied écumoire. Pseudothemis zonata.

C’est l’une des espèces de libellules les plus courantes et on la trouve souvent dans les étangs ombragés du Japon. Enfin, nous montrons le protocole RNI ciblant l’abdomen d’une libellule, Pseudothemis zonata. Étirez la membrane intersegmentale entre le quatrième et le cinquième segment abdominal.

Faire un petit trou avec une aiguille fine entre le quatrième et le cinquième segment abdominal. Insérez la pointe du capillaire préparé dans le trou préparé. Injectez un microlitre de solution siRNA ou dsRNA.

Fixer la larve sur un support fixe à l’aide d’épingles. Appliquer deux gouttelettes de gel à ultrasons sur la surface larvaire à l’aide de forceps. Placer les électrodes sur le gel à ultrasons avec l’électrode positive sur le côté de l’injection.

Générer 10 fois des impulsions d’électroporation à l’aide d’un électroporateur. Essuyer le reste du gel sur la surface à l’l’l’insu de papier. Enlever les broches d’insectes et garder les larves traitées sur une serviette en papier humide pendant environ un jour pour la récupération.

Ici, nous avons sélectionné un gène de synthèse de mélanine MCO2 comme gène cible, et EGFP ou bla comme cible de contrôle négatif. MCO2 est essentiel pour la formation de couleur noire chez divers insectes. Nous montrons d’abord les résultats dans l’abdomen d’Ischnura senegalensis.

Les pointes de flèche blanches indiquent les régions de pigmentation noire supprimée où l’électrode positive a été placée sur l’électroporation. L’incubation de la pigmentation a été observée à la fois par le traitement de siRNA et le traitement de dsRNA. La taille et l’emplacement du phénotype RNI variaient considérablement d’un individus à l’autre.

Sans électroporation, aucun phénotype RNI n’a été observé, ce qui indique que l’électroporation est essentielle pour l’INR chez cette espèce. Ensuite, nous montrons les résultats dans le thorax d’Ischnura senegalensis. De même l’inhibition de la pigmentation noire a été observée autour de la région où l’électrode positive a été placée sur l’électroporation.

Enfin, nous montrons les résultats dans l’abdomen de Pseudothemis zonata. Comme prévu, le phénotype RNI a été détecté autour de la région où l’électrode positive a été placée sur l’électroporation. Nous confirmons que la méthode RNAi à médiatté par électroproration est très utile à Odonata.

Il peut induire la suppression des gènes locaux près de 100% d’efficacité. Au moins dans l’épiderme, lorsque nous sélectionnons les stades de développement appropriés. Cette méthode a plusieurs sur la méthode CRISPR/Cas9.

Par exemple, la région où apparaissent les phénotypes RNAi peut être contrôlée par la position de l’électrodee positive lors de l’électrporation, et les phénotypes ARN peuvent être facilement comparés aux phénotypes de contrôle côte à côte chez le même individu. En outre, cette méthode ne nécessite pas de microinjection dans les oeufs minuscules. Il est donc beaucoup plus facile et plus rapide d’observer le phénotype plus rapidement que la méthode CRISPR/Cas9.

En outre, cette méthode peut être appliquée aux insectes dont les œufs nouvellement pondus sont difficiles à recueillir. Par exemple, les femelles de Pseudothemis zonata pondent des œufs pendant le vol. Il est donc très difficile de recueillir leurs œufs nouvellement pondus.

Nous nous attendons à ce que ce protocole s’applique généralement aux organismes non modèles lorsque l’INR conventionnel ne fonctionne pas efficacement.