Un modèle murin de xénogreffe d’Ommaya pour étudier le traitement ciblé direct de la maladie leptoméningée

L’Ommaya murin, qui imite le réservoir d’Ommaya utilisé cliniquement, permet aux chercheurs de tester une variété de thérapies ciblées directes pour les métastases cérébrales et la maladie leptoméningée universellement mortelle dans un modèle préclinique. L’avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent délivrer un volume de microlitres de médicaments directement dans le liquide céphalorachidien pour traiter les métastases du système nerveux central, en contournant la barrière hémato-encéphalique. Ce protocole d’implantation Murine Ommaya est conçu pour les chercheurs ou les techniciens qui ont une expérience de la chirurgie stéréotaxique et une formation technique aseptique, qui sont essentielles pour assurer le succès de cette procédure.

Margie Baldwin et Michelle Danielson de la médecine comparée de l’Université de Floride du Sud, et Vincent Law, associé de recherche principal du laboratoire du Dr Peter Forsyth au Moffitt Cancer Center and Research Institute, feront la démonstration de la procédure. Commencez par injecter à la souris par voie sous-cutanée un milligramme par kilogramme de buprénorphine à libération prolongée. Après avoir anesthésique la souris, préparez-la pour la chirurgie.

Coupez le site chirurgical avec suffisamment de zone de bordure pour empêcher la fourrure de contaminer le site d’incision. Rasez la fourrure de toute la surface de la tête et préparez la peau en utilisant une technique stérile. Ensuite, saturez le site avec un antiseptique cutané germicide, travaillant du centre du site à la périphérie, et laissez-le sécher.

Positionnez le corps pour vous assurer que la colonne vertébrale est maintenue au niveau de la cisterna magna. Tout en appliquant une légère traction sur la queue, placez du ruban adhésif à la base de la queue pour la fixer. Appliquez un drapé stérile ou un drapé en plastique stérile à dos adhésif pour protéger le site chirurgical de la contamination.

Avec le cou en pleine extension, faites couler les pointes de ciseaux chirurgicaux vers le bas avec une légère pression sur l’os occipital, en commençant juste entre les pennes. Faites une petite incision médiane de trois à cinq millimètres, légèrement au-dessus de la concavité palpée. Aspirez cinq microlitres de la suspension cellulaire dans une seringue Hamilton de calibre 30.

Utilisez une pince à pointe émoussée avec une pointe d’un à deux millimètres pour appuyer doucement sur la cisterna magna. Introduisez les pointes en position fermée et ouvrez-les tout en appliquant une pression vers le bas sur la dura. Répétez la dissection contondante jusqu’à ce que la membrane durale soit facilement identifiée et que les vaisseaux sanguins associés soient visibles dans la zone exposée.

Tout en maintenant la pince ouverte pour rétracter la musculature environnante, introduisez une aiguille non carottante de calibre 30 sous la dura pour visualiser le biseau, en vous assurant que l’aiguille n’est introduite que juste au-delà du biseau lui-même. Déployez lentement un piston de seringue et délivrez des cellules juste en dessous de la dura. Si une fuite au site d’injection est constatée, appliquez une légère pression avec un applicateur à pointe de coton.

Fermez la peau en appliquant un clip de plaie ou une micro goutte d’adhésif pour la peau. Surveillez les souris quotidiennement après la chirurgie pendant la première semaine. Si une souris semble souffrir ou souffrir, traitez-la avec une injection sous-cutanée de 10 milligrammes par kilogramme de carprofène une fois toutes les 12 à 24 heures pendant cinq jours au plus haut point, sur la base d’une consultation et d’une directive vétérinaires.

Assemblez le dispositif d’injection Murine Ommaya à l’aide d’un port d’injection miniature de calibre 25 et d’un disque d’espacement d’un millimètre. Utilisez un adhésif stérile cyanoacrylate pour assurer la pénétration d’environ 2,5 millimètres de la canule métallique dans l’hémisphère cérébral droit et préparez la peau selon la technique stérile. Faites une petite incision cutanée suivie d’une dissection contondante des tissus sous-cutanés sous-jacents pour exposer le crâne.

Séchez le crâne à l’aide de bâtonnets applicateurs imbibés de peroxyde d’hydrogène à pointe de coton. Percez un trou de bavure de 0,9 millimètre dans le crâne de 0,5 millimètre postérieur et de 1,1 millimètre latéral du bregma pour exposer la matière dure-mère. Déplacez le micropercage de côté et marquez doucement l’os entourant immédiatement le trou de bavure.

Apposez un orifice d’injection sur le crâne à l’aide d’un adhésif stérile cyanoacrylate et insérez-le à une profondeur d’environ 2,5 millimètres. Suturez l’incision à l’aide de sutures en nylon non résorbables 4-0 dans un motif de point interrompu ou une suture de cordon de bourse. Hébergez les souris post-opératoires dans des cages individuelles pour leur rétablissement.

Pour doser la souris, accédez à l’Ommaya Murin à l’aide d’un adaptateur d’injection à bâbord et d’une seringue Hamilton. À l’aide d’une pince, maintenez le haut du port d’injection miniature et insérez doucement l’adaptateur d’injecteur de port complètement dans le cloison du port. Une fois l’injection effectuée, détachez le Murine Ommaya de l’adaptateur d’injection de port avec pince.

Dans le but de visualiser la voie de l’injection, 2% Evans Blue a été injecté via le modèle Murine Ommaya. Le colorant a réussi à s’infiltrer dans les ventricules et le cerveau en 15 minutes. Après 30 minutes, le colorant est devenu visible sur la moelle épinière.

Comme preuve de concept, des souris BALB /c ont été injectées avec une lignée cellulaire de cancer du sein Her2+ TUBO étiquetée luciférase de manière intratracisternale, et les Ommayas murins ont été implantés. Environ une semaine après l’injection, les souris ont commencé à développer une LMD. Ces souris ont été traitées une fois par semaine jusqu’à quatre semaines avec l’immunothérapie par anticorps Her2, soit par un traitement systémique par injection intrapéritonéale, soit par voie intrathécale via l’Ommaya murin.

Alors que les souris non traitées sont mortes au jour 19, toutes les souris qui ont récupéré un traitement intrathécal par l’intermédiaire de l’Ommaya murin ont survécu. À la quatrième semaine, une régression complète des tumeurs a été observée. Par rapport aux souris traitées par traitement systémique, les souris ayant reçu un traitement intrathécal avaient une survie globale beaucoup plus longue.

Lorsque vous tentez cette procédure, il est important que le crâne soit sec avant de placer l’Ommaya murin. Utilisez une petite quantité de colle et positionnez l’Ommaya murin pendant environ 10 secondes pour adhérer au crâne. Avec cette technique, les chercheurs peuvent explorer un large éventail de médicaments anticancéreux dans des modèles murins qui sont cliniquement pertinents pour concevoir des stratégies thérapeutiques rationnelles pour les patients atteints de métastases du système nerveux central.