Name: Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Découvrez un test rapporteur pour étudier la traduction de l'ARNm dans les ovocytes pendant la maturation in vitro. Cette méthode utilise la microscopie time-lapse pour identifier les éléments régulateurs clés.

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Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM097165, GM116926 et Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 à Marco Conti. Enrico M. Daldello a été soutenu par une bourse de la Fondation Lalor et Natasja G. J. Costermans a été soutenu par une bourse Rubicon de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO).

Les procédures expérimentales impliquant des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee de l’Université de Californie à San Francisco (protocole AN182026).
1. Préparation des médias
<ol><li>Ajouter tous les composants, comme décrit dans le tableau 1, pour faire le milieu de collecte des ovocytes de base et le milieu de maturation des ovocytes. Pour le support de collecte de base, réglez le pH sur 7,4. Pour le milieu de collecte et de maturation, ajouter 3 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et 1 μM de cilostamide le jour de l’utilisation.</li>
</ol>2. Préparation du codage de l’ARNm pour Ypet-3' UTR et mCherry
<ol><li>Obtenir les séquences 3′ UTR des ARNm d’intérêt. REMARQUE: Pour cette étude, des séquences ont été précédemment obtenues à partir de l’ADNc d’ovocyte de souris.</li>
	<li>Concevoir des amorces pour amplifier les IDU 3' cibles à partir de l’ADNc ovocytaire et de parties du vecteur pcDNA 3.1 contenant une séquence codante Ypet, une étiquette d’épitope V5 et un promoteur T7.</li>
	<li>Amplifier à l’aide d’un kit d’ADN polymérase haute fidélité. Exécutez les produits de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) sur un gel pour vérifier si les fragments ont la bonne taille, découpez les bandes et extrayez l’ADN du gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Fusionnez les fragments pcr en vecteur à l’aide d’un kit de clonage PCR. REMARQUE: Des fragments de PCR ont été incubés sur la glace pendant 4 h pour faciliter un processus de recombinaison plus efficace. Ceci est contraire aux instructions du fabricant, qui recommandent un temps d’incubation de seulement 45 min.</li>
	<li>Transfecter des fragments de PCR en bactéries Escherichia coli 5-α compétentes.<ol>
<li>Ajouter le mélange et le plasmide aux bactéries et incuber sur de la glace pendant 30 min.</li>
		<li>Choc thermique du mélange et du plasmide en plaçant le mélange dans un bain-marie à 42 °C pendant 45 s, et refroidir immédiatement sur de la glace pendant 3 min.</li>
		<li>Ajouter 500 μL de bouillon Super Optimal avec un milieu de répression catabolite (SOC) et incuber pendant 1 h à 37 °C.</li>
		<li>Tournez vers le bas à 7000 × g pendant 2 min, et retirez la plupart du surnageant. Remise en suspension et plaque sur une plaque de gélose Luria Broth (LB) avec l’antibiotique de sélection approprié. REMARQUE : La carbénénicilline a été utilisée dans cette étude.</li>
		<li>Incuber pendant la nuit à 37 °C. Isolez les colonies en appuyant légèrement sur l’extrémité d’une pipette sur l’une des colonies et en la plaçant dans 3 mL de milieu LB avec 100 μg/mL de carbbénicilline. Incuber pendant 12-24 h à 37 °C.</li>
		<li>Extraire l’ADN des plasmides à l’aide du kit d’isolement de l’ADN plasmidique conformément aux instructions du fabricant et confirmer les séquences via le séquençage de l’ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour Ypet/3' UTR :<ol>
<li>Produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro. Utilisez un apprêt avant en amont de la séquence Ypet et un apprêt inverse avec 20 résidus de thymine supplémentaires. Voir le tableau 2 pour la séquence de Ypet/IL-7 3' UTR et les séquences des amorces avant et arrière. REMARQUE: Ces résidus de thymine supplémentaires ajouteront oligo(A) à l’ARNm linéaire après transcription in vitro. 
</li>
		<li>
Transcrivez in vitro le produit PCR à l’aide d’une trousse de transcription T7 conformément aux instructions du fabricant.</li>
		<li>Purifier l’ARN complémentaire (ARNc) résultant à l’aide d’un kit de nettoyage de transcription conformément aux instructions du fabricant.</li>
		<li>Éluer l’ARNc purifié dans de l’eau sans RNAse, mesurer la concentration et évaluer l’intégrité par électrophorèse de l’agarose. Conserver à −80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour mCherry:<ol>
<li>Produire un modèle de PCR linéaire pour la transcription in vitro en utilisant une enzyme de restriction haute fidélité; utiliser l’enzyme de restriction mfEI-HF si vous répliquez cet exemple. Digérer dans un tampon de digestion pendant la nuit à 37 °C.</li>
		<li>Exécutez un gel pour purifier l’échantillon et extrayez l’ADN linéaire à l’aide d’un kit d’extraction de gel conformément aux instructions du fabricant.</li>
		<li>
Transcrivez in vitro le produit PCR à l’aide d’une trousse de transcription T7 conformément aux instructions du fabricant.</li>
		<li>Polyadénylate de l’ARNc (150-200 nucléotides) à l’aide d’un kit de résidus en poly(A) selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Purifier l’ARNc résultant à l’aide d’une trousse de nettoyage de transcription selon les instructions du fabricant.</li>
		<li>Éluer l’ARNc purifié dans de l’eau sans ARNAse, mesurer les concentrations d’ARNm et évaluer l’intégrité du message par électrophorèse sur gel. Conserver à −80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procédure expérimentale
REMARQUE : Un aperçu schématique de la micro-injection d’ovocytes et de la microscopie time-lapse subséquente est donné à la figure 1.
<ol><li>Jour 1<ol>
<li>Injecter par voie intrapéritonéale des souris de 21 jours avec 5 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide pour favoriser la croissance du follicule au stade antral11.</li>
	</ol></li>
	<li>Jour 3<ol><li>Prélèvement d’ovocytes<ol>
<li>Sacrifier des souris 44-48 h après l’amorçage pour recueillir les ovaires, et les placer dans une boîte de Petri en plastique avec un milieu de collecte d’ovocytes de base.</li>
			<li>Ouvrez soigneusement les follicules antraux en faisant une petite coupe dans la paroi du follicule avec une aiguille de 26 G. Isolez les ovocytes intacts cumulus-enfermés (COC) avec plusieurs couches de cellules de cumulus utilisant une pipette en verre à bouche-actionnée.</li>
			<li>Utilisez une pipette plus petite (légèrement plus grande que le diamètre de l’ovocyte) et désamorcer mécaniquement les COC par pipetage répété. REMARQUE: Vous pouvez également effectuer une micro-injection sur des COC intacts.</li>
			<li>À l’aide d’une pipette plus grande, aspirer les ovocytes dénudés et les placer dans une boîte de Petri avec un milieu de maturation complété par 1 μM de l’inhibiteur de la phosphodiestérase, le cilostamide, pour empêcher la reprise de la maturation méiotique12. Placez le plat dans l’incubateur pendant 2 h pour laisser les ovocytes récupérer du stress induit par l’isolement des ovocytes des follicules.</li>
		</ol></li>
		<li>Micro-injection d’ovocytes<ol>
<li>Préparez les aiguilles d’injection en plaçant un tube capillaire en verre borosilicate de 10 cm de long dans un tiroir mécanique. Pour une injection optimale, pliez la pointe de l’aiguille dans un angle de 45 ° à l’aide d’un filament chauffé.</li>
			<li>Préparez des plats en polystyrène avec des gouttelettes de 20 μL de milieu de collecte d’ovocytes de base et couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère.</li>
			<li>Préparer un mélange rapporteur en ajoutant 12,5 μg/μL d’UTR Ypet-3' et 12,5 μg/μL mCherry. Préparer un plus grand volume et faire des aliquotes pour les expériences futures afin d’assurer des concentrations similaires de déclarants. Conservez ces aliquotes à -80 °C. Lors de la décongélation, centrifugez d’abord la partie aliquote pendant 2 min à 20 000 x g,puis transférez-la dans un nouveau tube de microcentrifugation. REMARQUE: Cette centrifugation empêchera l’aiguille d’injection d’être obstruée par des agrégats potentiels dans le mélange de rapporteur.</li>
			<li>Chargez l’aiguille d’injection par capillarité avec environ 0,5 μL de mélange rapporteur.</li>
			<li>Placez la pipette de maintien et l’aiguille d’injection chargée dans les supports et placez-la dans la gouttelette du milieu de collecte des ovocytes. Aspirez une partie du milieu dans la pipette de maintien.</li>
			<li>Ouvrez l’aiguille d’injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien.</li>
			<li>Placez les ovocytes dans une gouttelette de milieu de collecte de base et injectez 5 à 10 pL du mélange rapporteur.</li>
			<li>Incuber les ovocytes dans le milieu de maturation avec 1 μM de cilostamide pendant 16 h pour permettre au signal mCherry de se stabiliser.</li>
			<li>Préparer une boîte de Petri qui sera utilisée pour la microscopie en accéléré avec au moins deux gouttelettes de 20 μL de milieu de maturation pour chaque rapporteur injecté : une gouttelette avec 1 μM de cilostamide pour contrôler les ovocytes arrêtés par la prophase I et une gouttelette sans cilostamide pour la maturation des ovocytes. Couvrir les gouttelettes avec de l’huile minérale légère et placer dans l’incubateur.</li>
		</ol></li>
		<li>Microscopie time-lapse<ol>
<li>Après la pré-incubation, retirez les ovocytes injectés de l’incubateur et lavez-les quatre fois dans un milieu de maturation sans cilostamide. Conserver certains ovocytes dans un milieu de maturation avec du cilostamide de 1 μM comme groupe témoin d’ovocytes arrêté par la prophase I.</li>
			<li>Transférer les ovocytes injectés dans leurs gouttelettes respectives sur la parabole du microscope time-lapse préalablement préparée. Regroupez les ovocytes à l’aide d’une pipette en verre fermée (une pipette fermée peut être préparée en maintenant la pointe dans une flamme pendant quelques secondes). REMARQUE: Le regroupement des ovocytes aide à empêcher leur mouvement pendant l’enregistrement.</li>
			<li>Placer l’enceinte sous le microscope équipée d’un système d’éclairage à diodes électroluminescentes et d’un étage motorisé équipé d’une chambre environnementale maintenue à 37 °C et 5 % deCO2. Pour reproduire cette étude, utilisez les paramètres suivants : ensemble de filtres : miroir dichroïque YFP/CFP/mCherry 69008BS; Canal YFP (Excitation (Ex): S500/20 × 49057; Émission (EM): D535/30 m 47281), canal mCherry (Ex: 580/25 × 49829; Em : 632/60 m).</li>
			<li>Entrez les paramètres appropriés pour l’expérience time-lapse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude) : Cliquez sur Applications | Acquisition multidimensionnelle. Sélectionnez le premier onglet Main et sélectionnez timelapse, plusieurs positions de scèneet plusieurs longueurs d’onde.</li>
			<li>Sélectionnez l’onglet Enregistrement pour entrer l’emplacement où l’expérience doit être enregistrée.</li>
			<li>Sélectionnez l’onglet Timelapse pour entrer le nombre de points de temps, la durée et l’intervalle de temps. REMARQUE: La durée de l’expérience time-lapse dépend de l’espèce animale étudiée, car le moment de la maturation méiotique des ovocytes diffère d’une espèce à l’autre. Dans cette expérience avec des ovocytes de souris, des ovocytes ont été enregistrés toutes les 15 minutes pendant 16 h.</li>
			<li>Sélectionnez l’onglet Scène. Allumez brightfield et localisez la position des ovocytes en ouvrant une nouvelle fenêtre en sélectionnant Acquérir | Acquérir | Afficher en direct. Une fois les ovocytes localisés, revenez à la fenêtre Acquisition multidimensionnelle et appuyez sur + pour définir l’emplacement des ovocytes.</li>
			<li>Sélectionnez l’onglet Longueurs d’ondeet définissez 3 longueurs d’onde différentes pour brightfield (exposition 15 ms), YFP (exposition 150 ms pour Ypet / IL7 3' UTR) et mCherry (exposition 75 ms pour Ypet / IL7 3' UTR). REMARQUE : Ajustez l’exposition pour chaque déclarant UTR Ypet/3' en fonction du niveau d’accumulation du déclarant et du volume injecté. S’assurer que le signal YFP tombe au centre de la plage de détection au début de l’expérience pour éviter la sous-estimation ou la saturation en cas d’activation de la traduction. Pour mCherry, ajustez l’exposition pour chaque lot de mCherry car le signal dépend du nombre de nucléotides d’adénine qui ont été ajoutés pendant la procédure de polyadenylation. En raison de la variation de l’efficacité de la polyadenylation, utilisez le même lot de mCherry dans différentes expériences pour une meilleure comparaison entre les expériences.</li>
			<li>Démarrez l’expérience time lapse en cliquant sur Acquérir. Voir la figure 2 et le fichier supplémentaire pour obtenir un exemple d’enregistrement en accéléré dans un seul ovocyte.</li>
		</ol></li>
		<li>Analyse de la traduction de l’UTR Ypet-3'<ol>
<li>Pour cette analyse (voir la table des matériaux pour le logiciel utilisé dans cette étude), effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte: l’ovocyte lui-même - cliquez sur la région de l’ellipse et entourez l’ovocyte - et une petite région proche de l’ovocyte à utiliser pour la soustraction de fond - cliquez sur la région rectangulaire. Remarque : Assurez-vous que les ovocytes ne se déplacent pas hors de la région sélectionnée pendant l’enregistrement time-lapse. Portez une attention particulière au placement de la mesure de la région autour de l’extrusion du corps polaire, car cela provoque un mouvement dans l’ovocyte et peut fausser l’enregistrement.</li>
			<li>Exportez les données de mesure de région vers une feuille de calcul en cliquant d’abord sur Ouvrir le journal, puis sur Données du journal pour exporter le logiciel d’analyse des données.</li>
			<li>Pour chaque ovocyte individuel et pour tous les points temporels mesurés, soustrayez la mesure de la région d’arrière-plan de la mesure de la région ovocytaire. Effectuez cette option séparément pour les longueurs d’onde YFP et mCherry.</li>
			<li>Consigner le moment de la dégradation des vésicules germinales (GVBD) et de l’extrusion du corps polaire (PBE) pour référence ultérieure. REMARQUE: Exclure les ovocytes de souris en cours de maturation lorsque le GVBD dépasse 2 h.</li>
			<li>Tracez l’expression YFP et mCherry au fil du temps pour chaque ovocyte afin de vérifier les valeurs aberrantes. REMARQUE: Il doit s’agir d’une courbe lisse, si ce n’est pas le cas, cela peut indiquer que l’ovocyte s’est déplacé pendant l’enregistrement.</li>
			<li>Pour chaque ovocyte individuel, calculer l’expression moyenne de mCherry pour les dix derniers points temporels de l’enregistrement. Pour chaque point de temps, divisez l’expression YFP par l’expression mCherry moyenncée pour corriger le volume injecté afin d’obtenir un rapport YFP/mCherry à chaque point temporel pour chaque ovocyte individuel.</li>
			<li>Calculez les taux de translation pour un intervalle de temps spécifique en ajustant la pente de la courbe par régression linéaire. Évaluer les différences dans les taux de traduction à l’aide de l’inférence statistique.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Piqué, M., López, J. M., Foissac, S., Guigó, R., Méndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li>
<li>Morgan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+3%27+uridylation+and+poly%28A%29+tail+length+sculpt+the+mammalian+maternal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mRNA 3' uridylation and poly(A) tail length sculpt the mammalian maternal transcriptome.</a> Nature. 548 (7667), 347-351 (2017).</li>
<li>Yang, F., Wang, W., Cetinbas, M., Sadreyev, R. I., Blower, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+identifies+cis-acting+elements+regulating+mRNA+polyadenylation+and+translation+during+vertebrate+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis identifies cis-acting elements regulating mRNA polyadenylation and translation during vertebrate oocyte maturation.</a> RNA. 26 (3), 324-344 (2020).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cells+regulate+maternal+mRNA+translation+and+developmental+competence+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Somatic cells regulate maternal mRNA translation and developmental competence of mouse oocytes.</a> Nature Cell Biology. 15 (12), 1415-1423 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

La méthode présentée décrit une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction de l’ARNm cible à différentes transitions au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro. IL-7, une cytokine libérée par l’ovocyte qui peut être impliquée dans la communication cellulaire ovocyte-cumulus 8,13, a été choisie dans le but de décrire ce procédé. IL-7 est connu pour être de plus en plus traduit pendant la maturation d’ovocyte<sup cla...

Un ovocyte de mammifère adulte subit des changements rapides dans la préparation à la fécondation et à l’acquisition de la totipotence. Ces changements sont essentiels pour soutenir le développement embryonnaire après la fécondation. Bien que les événements associés à la maturation nucléaire soient relativement bien décrits, on en sait beaucoup moins sur les processus moléculaires et les voies dans le cytoplasme des ovocytes. Au cours des dernières étapes de la maturation des ovocytes, les ovocytes sont transcriptionnellement silencieux, et l’expression des gènes dépend entièrement de la traduction et de la dégradation de l’ARNm1,2. La synthèse des protéines critiques pour la compétence développementale s’appuie donc sur un programme de traduction chronométré d’ARNm à longue durée de vie qui ont été synthétisés plus tôt au cours de la croissancedes ovocytes 1,3. Dans le cadre d’un accent sur la définition de ce programme de traduction maternelle de l’ARNm exécuté pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote, cet article présente une stratégie pour étudier l’activation et la répression de la traduction des ARNm maternels cibles dans des ovocytes simples au cours de la maturation méiotique in vitro.
Dans cette méthode, le cadre de lecture ouvert YPet est cloné en amont de l’UTR 3' de la transcription d’intérêt. Ensuite, les ARNm codant pour ce rapporteur sont micro-injectés dans les ovocytes avec des ARNm polyadenylé codant pour contrôler le volume injecté. L’accumulation de reporter est mesurée pendant la maturation méiotique in vitro d’ovocyte utilisant la microscopie de time-lapse. L’accumulation de protéines fluorescentes jaunes (YFP) et de mCherry est enregistrée dans les ovocytes individuels, et les signaux YFP sont corrigés par le niveau stabilisé du mCherry co-injecté. Après l’acquisition des données, les taux de translation sont calculés pour différents intervalles de temps au cours de la maturation méiotique ovocytaire in vitro en calculant la pente de la courbe obtenue par ajustement de courbe.
Cette approche fournit un outil pour confirmer expérimentalement les changements dans la traduction des ARNm endogènes sélectionnés. De plus, cette méthode facilite la caractérisation des éléments régulateurs qui contrôlent la traduction lors de la maturation méiotique des ovocytes en manipulant les éléments cis-régulateurs du 3' UTR des ARNm cibles4,5,6. La manipulation de la longueur de la queue poly(A) permet également de mieux comprendre l’activité de l’adénylase/deadenylase dans les ovocytes5. La mutagenèse d’éléments cis-agissants ou d’immunoprécipitation de l’ARN peut être utilisée pour étudier les interactions avec les protéines de liaison à l’ARN apparenté6,7. De plus, cette méthode peut être utilisée pour identifier les composants essentiels du programme de traduction qui sont essentiels pour la compétence développementale des ovocytes en mesurant la traduction de l’UTR cible 3' dans des modèles associés à une diminution de la qualité des ovocytes 8,9,10. Ce document de méthode présente une expérience représentative où des ovocytes dénudés de souris C57/BL6 âgées de 21 jours ont été micro-injectés avec un journaliste de Ypet fusionné au 3' UTR d’IL-7. L’installation et le protocole pour l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits.

<table><tbody><tr><td>Preparation of media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL-A3311</td><td></td></tr><tr><td>Cilostamide</td><td>EMD Millipore</td><td>231085</td><td></td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2645</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine 100x Solution, Filtre Stérile</td><td>Genesee Scientific Corporation (GenClone)</td><td>25-512</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium&nbsp ;</td><td>JT-Baker</td><td>3506-1</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Gibco&nbsp ;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée ultrapure</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of mRNA codant pour YFP/3' UTR et mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Biomedical&nbsp ;</td><td>20-102QD</td><td></td></tr><tr><td>Sel disodique de carbenicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1389-1G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonage Choo-Choo</td><td>McLab</td><td>CCK-20</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204</td><td></td></tr><tr><td>Colorant de chargement d’ADN (6x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Solution</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Échelle d’ADN</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>LB Plaques de gélose avec 100 &micro ; g/mL de carbenicilline, Teknova&nbsp ;</td><td>Teknova</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium (Capsules)</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-021</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Kit de nettoyage de transcription</td><td>Life Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>MfeI-HF</td><td>Enzyme de restriction New England Biolabs</td><td>R3589</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription</td><td>Kit Invitrogen</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Kit de résidus</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit&nbsp ;</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction</td> Kit <td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>tampon TAE&nbsp ;</td><td>Apex Biomedical&nbsp ;</td><td>20-193</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium ultra-pur</td><td>Solution Life Technologies</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Collection d’ovocytes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ensemble de tube d’aspirateur pour micro-pipettes calibrées</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Micro-pipettes calibrées</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-025&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>PMSG- 5000</td><td>Mybiosource</td><td>MBS142665</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille PrecisionGlide 26 G x 1/2</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Ovocyte micro-injection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Plat | N° 0 Lamelle | Diamètre du verre de 20 mm | Non revêtu</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td>Pour la microscopie time-lapse</td></tr><tr><td>Verre borosilicaté avec filament</td><td>Instrument Sutter</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Huile pour culture embryonnaire</td><td>Irvine Scientific</td><td>9305</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Falcon</td><td>351006</td><td>Pour micro-injection</td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Pour l’incubation d’ovocytes</td></tr><tr><td>VacuTip Holding Capillary</td><td>Eppendorf</td><td>5195000036<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biorender</td><td>BioRender</td><td></td><td>Préparation de Figure 1S</td></tr><tr><td>MetaMorph, version 7.8.13.0&nbsp ;</td><td>Dispositifs</td><td></td> <td>moléculaires&nbsp ; Pour la microscopie time-lapse, analyse de la traduction 3' UTR&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

définition du programme de traduction de l’arnm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Des événements liés à la maturation nucléaire d’oocyte ont été bien décrits. Cependant, on en sait beaucoup moins sur les voies moléculaires et les processus qui ont lieu dans le cytoplasme en préparation de la fécondation et de l’acquisition de la totipotence. Au cours de la maturation des ovocytes, les changements dans l’expression des gènes dépendent exclusivement de la traduction et de la dégradation des ARN messagers maternels (ARNm) plutôt que de la transcription. L’exécution du programme translationnel joue donc un rôle clé dans l’établissement de la compétence développementale des ovocytes pour soutenir le développement de l’embryon. Cet article fait partie d’un accent sur la définition du programme de traduction maternelle de l’ARNm qui a lieu pendant la maturation méiotique et à la transition ovocyte-zygote. Dans cet article de méthode, une stratégie est présentée pour étudier la régulation de la traduction des ARNm cibles au cours de la maturation in vitro des ovocytes. Ici, un rapporteur Ypet est fusionné à la région non traduite 3' (UTR) du gène d’intérêt, puis micro-injecté dans les ovocytes avec l’ARNm polyadénylé codant pour mCherry pour contrôler le volume injecté. En utilisant la microscopie time-lapse pour mesurer l’accumulation de rapporteur, les taux de traduction sont calculés à différentes transitions au cours de la maturation méiotique des ovocytes. Ici, les protocoles pour l’isolement et l’injection d’ovocyte, l’enregistrement de time-lapse, et l’analyse de données ont été décrits, utilisant le Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3' UTR reporter comme exemple.

Des ovocytes I-arrêtés de prophase dénudés des souris C57/BL6 de 21 jours ont été injectés avec un mélange de journaliste contenant l’ADN messagère codant le journaliste de Ypet fusionné au 3' UTR d’IL-7 et adn messagère codant mCherry. L’expression de YFP et de mCherry a été enregistrée dans 39 oocytes, dont 30 ont été mûris, et 9 ont été arrêtés dans la prophase I comme commande négative. Trois ovocytes en maturation ont été exclus pour l’analyse parce qu’ils avaient un GVBD retardé (N = 2) ou déplacés dans la parabole...

Ce protocole décrit une analyse de journaliste pour étudier le règlement de la traduction d’ADN messagère dans les ovocytes simples pendant la maturation in vitro.

Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...

Cette méthode peut être utilisée pour identifier et caractériser les éléments régulateurs qui contrôlent la traduction pendant la maturation des ovocytes. Nous avons appliqué la microscopie de time-lapse pour évaluer l’accumulation de rapporteur dans toute la maturation in vitro d’oocyte. Cela permet de déterminer avec précision le moment où l’activation translationnelle ou la répression a lieu pendant la maturation des ovocytes.Pour commencer, ouvrez soigneusement les follicules antraux en faisant une petite coupe dans la paroi du follicule avec une aiguille de calibre 26. Isolez les COC intacts avec plusieurs couches de cellules de cumulus à l’aide d’une pipette en verre actionnée par la bouche. Utilisez une pipette plus petite et denudez mécaniquement les COC par pipetage répété.Aspirer les ovocytes dénudés et les placer dans une boîte de Pétri avec un milieu de maturation complété par une micromolaire de cilostamide. Placez le plat dans un incubateur pendant deux heures pour laisser les ovocytes récupérer du stress induit par leur isolement des follicules. Placez un tube capillaire en verre borosilicate de 10 centimètres de long dans un tiroir mécanique pour préparer les aiguilles d’injection.Pliez la pointe de l’aiguille à un angle de 45 degrés à l’aide d’un filament chauffé pour une injection optimale. Placez 20 gouttelettes microlitres du milieu de collecte des ovocytes de base dans un plat en polystyrène et couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère. Préparez un plus grand volume de mélange de rapporteurs en ajoutant 12,5 microgrammes par microlitre d’UTR Ypet et de mCherry chacun.Conservez les aliquotes de ceux-ci à moins 80 degrés Celsius. Lors de la décongélation, centrifuger la partie aliquote pendant deux minutes à 20 000 fois G, puis la transférer dans un nouveau tube à microcentrifugation. Chargez l’aiguille d’injection avec environ 0,5 microlitres de mélange de rapporteur.Placez la pipette de maintien et l’aiguille d’injection dans les supports et placez-les dans la gouttelette du milieu de collecte des ovocytes. Ouvrez l’aiguille d’injection en la tapotant doucement contre la pipette de maintien. Placer les ovocytes dans une gouttelette de milieu de collecte de base et injecter cinq à 10 picolitres du mélange rapporteur.Incuber les ovocytes et le milieu de maturation avec un cilostamide micromolaire pendant 16 heures pour permettre au signal mCherry de se stabiliser. Pour la microscopie time-lapse, préparer une boîte de Petri avec deux gouttelettes de 20 microlitres de milieu de maturation pour chaque rapporteur injecté, une gouttelette avec un cilostamide micromolaire pour contrôler les ovocytes arrêtés par I de la prophase, et une gouttelette sans cilostamide pour les ovocytes en maturation. Couvrez les gouttelettes d’huile minérale légère et placez-les dans l’incubateur.Après pré-incubation, retirez les ovocytes injectés de l’incubateur et lavez-les quatre fois dans un milieu de maturation sans cilostamide. Gardez certains ovocytes dans un milieu de maturation avec un cilostamide micromolaire comme groupe témoin d’ovocyte de la prophase I. Transférer les ovocytes injectés dans leurs gouttelettes respectives sur la parabole du microscope time-lapse préalablement préparée.Regroupez les ovocytes avec une pipette en verre fermée pour empêcher leur mouvement pendant l’enregistrement. Placez la parabole au microscope équipée d’un système d’élimination des diodes électroluminescentes et d’une scène motorisée équipée d’une chambre environnementale maintenue à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en utilisant les paramètres mentionnés dans le manuscrit de texte. Entrez les paramètres appropriés pour l’expérience time-lapse en cliquant sur Applications, puis sur Acquisition multidimensionnelle.Sélectionnez le premier onglet Main, puis sélectionnez time-lapse, plusieurs positions de scène et plusieurs longueurs d’onde. Sélectionnez l’onglet Enregistrement pour entrer l’emplacement où l’expérience doit être enregistrée. Sélectionnez ensuite l’onglet Time-Lapse pour entrer le nombre de points de temps, la durée et l’intervalle de temps.Sélectionnez l’onglet Scène, activez brightfield et localisez la position des ovocytes en ouvrant une nouvelle fenêtre et en sélectionnant Acquérir, Acquérir et Afficher en direct. Une fois les ovocytes localisés, revenez à la fenêtre d’acquisition multidimensionnelle et appuyez sur plus pour définir l’emplacement des ovocytes. Sélectionnez l’onglet Longueurs d’onde et définissez trois longueurs d’onde différentes pour brightfield, YFP et mCherry.Ajustez l’exposition pour Ypet et mCherry, puis démarrez l’expérience time-lapse en cliquant sur Acquérir. Pour l’analyse de la translation UTR à trois nombres premiers de Ypet, effectuez deux mesures de région pour chaque ovocyte, l’ovocyte lui-même en cliquant sur la région de l’ellipse et une petite région entourant l’ovocyte à utiliser pour la soustraction d’arrière-plan en cliquant sur la région rectangulaire. Exportez les données de mesure de région vers une feuille de calcul en cliquant sur Ouvrir le journal, puis sur Consigner les données.Pour chaque ovocyte individuel et pour tous les points de temps mesurés, soustrayez la mesure de la région d’arrière-plan de la mesure de la région ovocytaire séparément pour les longueurs d’onde YFP et mCherry. L’expression de mCherry et de YFP dans la prophase I et les oocytes de maturation a été enregistrée dans 39 oocytes, dont 30 ont été mûris, et neuf ont été arrêtés dans la prophase I comme commande négative. Des rapports individuels de YFP à mCherry pour des signaux des ovocytes I-arrêtés et de maturation de prophase ont été corrigés pour le volume injecté en divisant le signal de YFP par le signal moyen de mCherry des 10 derniers points de temps pour les ovocytes I-arrêtés et mûrissants de prophase.Des taux de traduction du rapporteur YFP ont été mesurés par la courbe ajustant les rapports YFP à mCherry dans la prophase I et dans les ovocytes de maturation pendant les premières zéro à deux heures, ou huit à 10 heures après libération de cilostamide utilisant la régression linéaire. L’accumulation du rapporteur ne suit pas un modèle linéaire, comme l’indique une différence significative dans les taux de traduction entre zéro à deux heures et huit à 10 heures après la libération de cilostamide, indiquant l’activation de la traduction de l’interleukine 7 au cours de la maturation myotique des ovocytes. Lorsque vous essayez ce protocole, assurez-vous que le temps d’exposition est adéquat au début de l’enregistrement.Gardez à l’esprit que le signal peut saturer pendant le cours du temps si la traduction est activée pendant la reprise méiotique des ovocytes. La stabilité du MRMA peut être confirmée par PCR, en utilisant des amorces pour YFP. Pour confirmer les changements de traduction, vous pouvez utiliser western blotting avec un anticorps contre un technicien V5.

defining-program-maternal-mrna-translation-during-vitro-maturation

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Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous démontrons qu’en présence d’un inhibiteur de phosphodiester, le cycle cellulaire de l’ovocyte est arrêté au niveau de la prophase-I, au cours de laquelle les ARNm transcrits sont stockés en l’absence de traduction. Après la libération de l’inhibiteur, la maturation des ovocytes reprend et les cellules entrent en métaphase. Le signal de l’ARNm rapporteur fusionné avec le gène cible en métaphase-I indique l’activation de la machinerie translationnelle et de l’expression des...

Le test in vitro sur un seul ovule rapporteur : une technique pour étudier la régulation de la traduction de l’ARNm cible pendant la maturation in vitro des ovocytes

Nous décrivons les méthodes de manipulation des ovocytes immatures de Xenopus laevis, de maturation in vitro des ovocytes en ovules et d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes. Ce protocole permet la dégradation de certaines protéines maternelles et la surexpression des gènes d’intérêt lors de la fécondation, et est donc précieux pour étudier les rôles de facteurs spécifiques dans le développement embryonnaire précoce.

Manipulation et<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturation du<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovocytes, Suivi par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, pour étudier le développement embryonnaire

Le contrôle de la synthèse des protéines se produit principalement à l’étape d’initiation de la traduction, dont les déficiences sont liées à divers troubles. Pour mieux comprendre leur étiologie, nous avons décrit ici un protocole utilisant des ovocytes de Xenopus laevis évaluant la traduction du transcrit mos en présence d’un mutant du facteur d’initiation de traduction eIF4G1.

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Un protocole optimisé pour la maturation in vitro des ovocytes de poisson zèbre utilisés pour la manipulation de produits de gènes maternels est présenté ici.

Manipulation fonctionnelle du gène maternel Produits utilisant<em&gt; In vitro</em&gt; Ovocyte Maturation en Zebrafish

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

Ici, nous présentons un protocole pour la visualisation, la détection, l'analyse et le suivi du trafic endogène d'ARNm dans la chambre d'oeufs de Melasophila melanogaster vivante utilisant des balises moléculaires, la microscopie confocale de disque spinning, et l'analyse open-source logiciel.

Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Pour compter reproductible les numéros des ARNm dans les ovocytes, in situ en fluorescence seule molécule RNA hybridation (RNA-poisson) a été optimisée pour les cellules non adhérentes. Ovocytes ont été recueillis, hybridaient avec des sondes spécifiques de transcription et quantifiées à l’aide d’un logiciel de quantification d’image.

Utilisation d’unique molécule fluorescente hybridation In Situ (FISH-SM) afin de quantifier et Localize ARNm dans les ovocytes murin

Nous avons développé un test de rapporteur de biogenèse de microARN intronique à utiliser in vitro dans des cellules avec quatre plasmides : un avec un miARN intronique, un avec la cible, un pour surexprimer une protéine régulatrice et un pour Renilla luciférase. Le miARN a été traité et a pu contrôler l’expression de la luciférase en se liant à la séquence cible.

Un test rapporteur pour analyser la maturation des microARN introniques dans des cellules de mammifères

L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris

Ce protocole décrit les procédures de maturation in vitro des ovocytes de souris, la fécondation in vitro et la culture embryonnaire subséquente jusqu’au stade de blastocyste.

Maturation in vitro des ovocytes de souris, fécondation et culture des embryons préimplantatoires

Découvrez un test rapporteur pour étudier la traduction de l'ARNm dans les ovocytes pendant la maturation in vitro. Cette méthode utilise la microscopie time-lapse pour identifier les éléments régulateurs clés.

Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique (Vidéo) | JoVE Journal

Définition du programme de traduction de l’ARNm maternel au cours de la maturation in vitro à l’aide d’un test de rapporteur d’ovocytes unique

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