Analyse du temps de séjour d’une molécule unique du clivage de l’ADN médié par l’endonucléase de restriction

Avec ce protocole, nous pouvons observer directement le clivage de l’ADN spécifique au site par des endonucléases de restriction au niveau de la molécule unique. Notre approche multiplexée nous permet de mesurer le temps nécessaire à des centaines de REases individuelles pour terminer le cycle catalytique. Le multiplexage nous permet de générer des distributions de temps de séjour jusqu’au clivage bien remplies que nous pouvons ajuster avec la distribution de probabilité gamma pour obtenir des informations sur le mécanisme du clivage de l’ADN.

Commencez par préparer un tube frais pour chaque oligonucléotide remis en suspension à 50 microlitres de l’oligonucléotide et 50 microlitres de solution DTT fraîchement préparée dans chaque tube, pipetez de haut en bas pour mélanger et incubez pendant 30 minutes à température ambiante. Pipeter doucement tout le volume de chaque mélange d’échantillons sur une colonne préparée et centrifuger à 750 G pendant deux minutes. Après la centrifugation, stockez tous les échantillons qui ne seront pas utilisés immédiatement à 20 degrés Celsius pour éviter l’oxydation des groupes thiols et la formation de liaisons disulfure.

Pipetez une aliquote de 50 microlitres de la crosse à points quantiques dans un appareil de dialyse pour chaque construction à fabriquer, en veillant à ne pas toucher la membrane avec la pointe de la pipette. Dialyser contre un volume de tampon CHES qui est au moins 1 000 fois le volume de l’échantillon en agitant à 100 tr/min pendant 15 minutes. À l’aide d’un pipteur, récupérez soigneusement les points quantiques suspendus de l’appareil de dialyse et transférez-les dans un tube frais contenant un volume égal de solution Sulfo-SMCC fraîchement préparée, en pipetant de haut en bas pour mélanger.

Incuber pendant 1 heure à température ambiante en agitant à 1 000 tr/min pour permettre au Sulfo-SMCC de réagir avec les amines primaires sur les points quantiques. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez soigneusement chaque échantillon dans un appareil de dialyse frais. Pour éliminer l’excès de Sulfo-SMCC, dialyser contre un volume de tampon CHES qui est au moins 1 000 fois le volume contenu dans l’appareil de dialyse en agitant pendant 15 minutes.

Remplacez le tampon deux fois et effectuez la dialyse avec un nouveau tampon CHES trois fois au total, ce qui permet à la dialyse de se poursuivre pendant 15 minutes après chaque remplacement de tampon. Répétez ensuite la dialyse avec PBS. À l’aide d’une pipette, récupérez soigneusement la solution contenant les points quantiques de l’appareil de dialyse et transférez chaque échantillon dans un tube frais contenant une quantité équivalente d’oligonucléotide dilaté dilué dans du PBS.

Incuber pendant 2 heures à température ambiante en agitant à 1 000 tr/min. Ajouter de la BSA à chaque échantillon pour une concentration finale de 0,5 milligramme par millilitre. Ensuite, à l’aide d’une pipette, transférez soigneusement chaque échantillon dans un appareil de dialyse frais et dialysez contre le tampon de stockage.

Après la dialyse, récupérez soigneusement chaque échantillon et placez-le dans un tube frais. Conservez les échantillons à 4 degrés Celsius. Combinez un échantillon d’oligonucléotides marqués à l’aide de points quantiques avec un excès molaire dix fois plus élevé d’oligonucléotides biotinylés.

Faites chauffer le mélange dans un bloc de chaleur à 75 degrés Celsius et maintenez-le à cette température pendant 5 minutes. Éteignez ensuite le bloc de chaleur et laissez le mélange refroidir lentement. Rangez la construction terminée à 4 degrés Celsius À l’aide d’un outil rotatif à main équipé d’un foret à pointe diamantée conique, percez deux trous dans les coins opposés de la glissière en quartz pour servir d’entrée et de sortie.

Assurez-vous de fixer la glissière en place, de lubrifier le foret et de le faire glisser constamment avec de l’eau pendant le perçage. Après chaque expérience, récupérez la lame de quartz préparée en trempant l’appareil usagé dans de l’acétone pour dissoudre l’adhésif et l’époxy. Jetez les composants restants.

Combinez 25 microlitres de solution de streptavidine avec 80 microlitres de PBS et 20 microlitres de tampon de blocage. Enduisez une lamelle traitée PEG avec ce mélange et incubez dans un environnement humide pendant 30 minutes. Pendant l’incubation de la lamelle, préparez l’espaceur d’imagerie pour créer un canal d’écoulement.

Coupez un morceau carré de 1 pouce de matériau d’espacement d’imagerie, puis marquez un canal de 2 millimètres de large aligné sur les extrémités des trous percés dans la lame de quartz. Découpez le canal dans le matériau de l’entretoise avec un scalpel. Nettoyez soigneusement la lame de quartz avec de l’acétone pour éliminer tout reste d’adhésif des expériences précédentes.

Décollez un côté du support de l’entretoise d’image et placez-le soigneusement sur la glissière en quartz, en prenant soin de ne pas couvrir les trous d’entrée et de sortie. Lavez la lamelle de recouvrement à l’eau et séchez-la à l’air comprimé. Retirez l’autre côté du support de l’entretoise d’imagerie et placez-le en sandwich entre la lame de quartz et la lamelle de recouvrement fonctionnalisée recouverte de streptavidine à l’aide d’une pince à épiler en plastique pour presser l’ensemble et éliminer les bulles d’air de l’adhésif.

Coupez l’extrémité du tube en biais pour assurer la libre circulation de la solution. Insérez ensuite un tube en polyéthylène de 30 centimètres de long dans chaque trou de la glissière en quartz. Maintenez les tubes en place à l’aide d’un support de tubes, puis utilisez de l’époxy pour sceller les tubes en place et les bords de l’appareil assemblé.

Une fois l’époxy pris, insérez l’aiguille émoussée d’une seringue vide dans le tube de sortie de l’appareil et plongez l’extrémité du tube d’entrée dans un récipient rempli du tampon de blocage. Tirez sur le piston de la seringue pour remplir l’appareil de tampon de blocage. Laissez ensuite l’appareil incuber pendant au moins 30 minutes avant de l’utiliser.

Fixez le dispositif microfluidique à la plaque de la platine du microscope à l’aide de ruban adhésif. Mettez l’objectif en contact avec le bas de l’appareil et positionnez-le de manière à ce que le champ de vision se trouve à l’intérieur du canal microfluidique. Après avoir connecté le tube de sortie à la pompe à seringue, rincez le canal microfluidique avec un tampon de blocage frais en tirant vers l’arrière le piston de la seringue.

Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles piégées dans le tube ou dans le canal. Diluez 1 microlitre du substrat d’ADN préparé dans 1 millilitre de tampon de blocage. Placez le tube d’entrée dans le substrat d’ADN dilué et faites couler 800 microlitres de la solution de substrat à travers le canal à une vitesse de 200 microlitres par minute.

Laissez la solution d’ADN incuber dans le canal pendant 15 minutes après l’arrêt de l’écoulement. Après l’incubation, versez au moins 800 microlitres de tampon bloquant à travers le canal à une vitesse de 200 microlitres par minute pour rincer l’ADN non lié hors du canal. Ajustez la mise au point du microscope de manière à ce que les points quantiques attachés à la surface soient clairement visibles.

Rincez le dispositif microfluidique avec 800 microlitres de tampon expérimental sans magnésium à un débit de 200 microlitres par minute. Ajouter la REase à une aliquote de tampon expérimental sans magnésium et mélanger doucement par pipetage. Écoulez 800 microlitres de 400 unités par millilitre d’EcoRV à travers le canal à un débit de 200 microlitres par minute.

Commencez l’expérience en faisant couler le tampon expérimental contenant du magnésium et de la fluorescéine à un débit de 200 microlitres par minute. Commencez à capturer des données immédiatement après avoir démarré le pousse-seringue. Arrêtez l’acquisition des données après avoir écoulé 800 microlitres de tampon.

Après avoir introduit le substrat d’ADN dans la cellule d’écoulement et éliminé l’excès d’ADN et de points quantiques, il y a généralement des milliers de points quantiques individuels dans un champ de vision. Ils sont fixés de manière stable à la surface du verre et ne subissent pas de gradation notable ou de blanchiment significatif tout au long de l’expérience. Lorsque la REase s’est écoulée dans le canal en l’absence de magnésium, au moins 95 % des points quantiques présents au début de l’expérience sont encore visibles à la fin de la période d’observation.

Cependant, lorsque le tampon contenant du magnésium s’écoule immédiatement après la REase, jusqu’à la moitié des points quantiques disparaissent à la fin de la période d’observation, comme c’est le cas lorsque la REase et le magnésium circulent ensemble dans le canal. La disparition des points quantiques se produit rapidement et entraîne une forte diminution de la trajectoire d’intensité, fournissant une indication claire du moment où une molécule d’ADN donnée est clivée. Cette expérience a été réalisée avec le type II P REase EcoRV, bien étudié.

L’ajustement non linéaire de la courbe des moindres carrés et l’estimation du paramètre du maximum de vraisemblance ont été utilisés pour extraire les valeurs de n et bêta des données. Les deux méthodes d’estimation des paramètres étaient en accord. En utilisant l’ajustement non linéaire des moindres carrés, n était de 3,52 et bêta était de 5,78 secondes.

En utilisant l’estimation du maximum de vraisemblance, n était de 3,41 et bêta était de 6,06 secondes. Ce test peut mettre en évidence la présence d’étapes intermédiaires le long de la voie de clivage. La réalisation de ce test dans des conditions de réaction changeantes peut aider à établir la nature des intermédiaires de réaction qui ne peuvent pas être observés directement.