Intégration médiée par φC31 dirigée sur site et échange de cassettes chez les anophèles vecteurs du paludisme

Ce protocole soutient la caractérisation du rôle des gènes des moustiques impliqués dans une variété de voies physiologiques, y compris, par exemple, la résistance aux insectes et le développement du parasite du paludisme. La méthode entraîne l’insertion de transgènes dans des emplacements génomiques précaractérisés uniques et permet donc de comparer directement les phénotypes résultant de transgènes alternatifs évitant efficacement la question de l’effet positionnel. Cette méthode peut être appliquée à une variété d’espèces d’insectes d’importance sanitaire et agricole et ses applications s’étendent largement des bactéries aux cellules de mammifères.

Commencez par concevoir des plasmides donneurs attB transportant le marqueur fluorescent dominant, les sites de recombinaison attB et la cargaison de transgène souhaitée. Utilisez un seul site attB pour l’intégration de l’ensemble du plasmide transportant la cassette transgénique ou deux sites attB inversés pour l’échange de cassettes. Purifiez les plasmides donneurs et auxiliaires à l’aide d’un kit de purification sans endotoxines.

Combinez le plasmide donneur marqué attB portant le transgène d’intérêt et le plasmide auxiliaire portant l’intégrase pour obtenir un mélange avec une concentration finale de 350 nanogrammes par microlitre du plasmide donneur et de 150 nanogrammes par microlitre du plasmide auxiliaire. Précipiter l’ADN en ajoutant 0,1 volume de trois molaires acétate de sodium et 2,5 volumes d’éthanol glacé à 100%, puis vortex. Un précipité blanc doit être immédiatement visible.

Lavez la pastille et remettez-la en suspension dans un tampon d’injection pour atteindre une concentration finale totale de 500 nanogrammes par microlitre. Ensuite, préparez des aliquotes de 10 à 15 microlitres chacune et stockez-les à 20 degrés Celsius négatifs. Le sang nourrit les moustiques âgés de quatre à sept jours à partir de la ligne d’amarrage souhaitée et de leurs homologues de type sauvage 72 heures avant la micro-injection.

Effectuer des micro-injections d’embryons d’Anophèles gambiae dans du chlorure de sodium de 25 millimolaires en ciblant le pôle postérieur de l’embryon à un angle de 45 degrés. Effectuer des micro-injections d’embryons d’Aophèle stephensi dans de l’huile d’halocarbure en ciblant le pôle postérieur à un angle de 30 degrés. Immédiatement après l’injection, transférer les œufs dans une boîte de Pétri remplie d’eau distillée stérile et les remettre dans des conditions insectaires.

À l’éclosion, transférer la larve de G0 dans un plateau avec de l’eau distillée salée tous les jours et l’élever jusqu’aux nymphes. Trier les pupes G0 par sexe sous un stéréoscope. Laissez les mâles émerger dans des cages séparées en groupes de trois à cinq et ajoutez dix fois plus de femelles de type sauvage appariées selon l’âge.

Laissez les femelles émerger dans des cages séparées en groupes de 10 à 15 et ajoutez un nombre égal de mâles de type sauvage appariés selon l’âge. Laissez les adultes s’accoupler pendant quatre à cinq jours et fournissez aux femelles un repas de sang. Ramassez les œufs et élevez les G1 émergents de la prochaine génération.

Recueillir les larves G1, L3 et L4 dans une boîte de Pétri recouverte de papier filtre humide ou sur une lame de microscope et les filtrer à l’aide d’un stéréoscope fluorescent pour détecter la présence du marqueur introduit avec la cargaison étiquetée attB. Pour les conceptions à un seul attB, écran pour la présence du nouveau marqueur préexistant. Pour les conceptions à double attB pour l’échange de cassettes, écran pour la présence du nouveau marqueur et la perte du préexistant.

Triez les nymphes G1 transformées par sexe et croisez-les en masse avec des individus de type sauvage de sexe opposé correspondant à l’âge. Laissez les adultes s’accoupler pendant quatre à cinq jours et fournissez un repas de sang. Pour les expériences d’intégration unique, collectez les œufs directement à partir de la croix en masse.

Pour les expériences d’échange de cassettes, collectez les œufs de femelles individuelles et maintenez la progéniture séparée jusqu’à ce que l’évaluation moléculaire soit terminée en raison de la présence potentielle de deux orientations de cassette alternatives. Dépister la descendance G2 pour la présence du marqueur fluorescent et réserver un sous-ensemble d’individus G2 positifs pour l’analyse moléculaire. Élevez le reste à l’âge adulte.

Effectuer la validation moléculaire des sites d’insertion avec la PCR comme décrit dans le manuscrit textuel. Pour une intégration unique, assurez-vous que le site d’insertion prévu porte la construction d’amarrage d’origine, ainsi que toute la séquence du plasmide donneur entre les deux sites hybrides attL et attR. Pour l’échange de cassettes, assurez-vous que le site d’insertion prévu est identique à celui de la ligne d’accueil où les sites attL inversés hybrides remplacent les sites attP inversés d’origine et le modèle d’échange remplace la cassette initialement présente entre eux.

Le protocole a été utilisé pour générer une lignée transgénique Anopheles stable en environ 10 semaines. La validation phénotypique de la transformation a été réalisée par criblage de marqueurs fluorescents régulés par le promoteur 3xP3 sont montrés ici. Une nouvelle ligne Anopheles stephensi a été obtenue par l’insertion d’une cassette marquée en rouge DS dans une ligne d’amarrage marquée avec CFP, ce qui a permis à la progéniture G1 d’exprimer les deux marqueurs, comme l’indique la fluorescence rouge et bleue dans les yeux.

Les conceptions d’échange de cassettes entraînent le remplacement du marqueur inséré à l’origine dans la ligne d’amarrage par celui du plasmide donneur. Cet échange de marqueurs a été démontré dans une ligne d’amarrage d’Anopheles gambiae où le marqueur CFP a été perdu et le marqueur YFP acquis, ce qui a entraîné une fluorescence jaune des yeux et du cordon nerveux. Parfois, le RMCE peut entraîner un seul événement d’intégration au lieu de l’échange de la cassette transgénique souhaitée où une larve est marquée à la fois avec le CFP d’origine et les nouveaux marqueurs YFP.

Lors du dépistage de la présence d’un marqueur fluorescent, il est crucial de distinguer son signal de l’autofluorescence de fond possible. Il est nécessaire d’augmenter le grossissement et de se concentrer sur les tissus et les organes où la fluorescence devrait être entraînée par le promoteur pour identifier les véritables individus positifs à la CFP. Les transformants individuels ont également été évalués moléculairement par PCR pour confirmer le site d’insertion attendu.

La validation par PCR chez les individus d’une ligne d’échange Anopheles gambiae est montrée ici. Même une technique de micro-injection appropriée, la conception et la préparation précises des plasmides donneurs et auxiliaires, ainsi que le suivi du schéma d’élevage de moustiques approprié sont essentiels pour obtenir des individus transgéniques. Cette procédure peut être utilisée pour insérer des éléments provoquant une surexpression ou un silence des gènes, par exemple, le système GAL4 / UAS, ainsi que des éléments de forçage génétique et des molécules anti-pathogènes pour le contrôle génétique des moustiques.