Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif

Ce protocole permet aux chercheurs dans le domaine craniofacial de comparer quantitativement les attributs de mouvement collectif dans les cellules témoins et mutantes afin de comprendre le remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. L’utilisation de cellules mésenchymateuses embryonnaires embryonnaires primaires de souris et l’imagerie en accéléré fournissent une méthode proxy accessible pour évaluer la dynamique de l’élévation du plateau palatal. Pour prélever des coquilles palatales sur un embryon de souris, utilisez une cuillère perforée stérilisée pour placer un embryon embryonnaire de jour 13,5 dans un plat stérile de 10 centimètres rempli de milieu de culture MEPM stérile sous un stéréomicroscope.

Après la décapitation, insérez une pointe d’une pince fine n° 5 stérilisée dans la bouche juste à l’intérieur de la joue et poussez la pointe de la pince jusqu’à ce qu’elle sorte de l’arrière du crâne. Orientez la pince de manière à ce que l’autre bras plane juste au-dessus du conduit auditif avant de pincer la pince fermée pour couper le tissu. Répétez l’incision de l’autre côté de la tête, en poursuivant la procédure de coupe par pincement jusqu’à ce que la mâchoire inférieure, la langue et la partie inférieure du crâne aient été enlevées, exposant ainsi les étagères palatales.

Avec la tête placée sur le côté, positionnez les extrémités d’une paire de petits ciseaux stériles en acier inoxydable devant et derrière le crâne à peu près au niveau des yeux de l’embryon et coupez juste au-dessus des yeux pour enlever le crâne du crâne, créant ainsi une surface plane. Ensuite, placez la tête à l’envers avec l’aspect supérieur reposant à plat sur le fond du plat et localisez les étagères palatales, qui doivent être visibles sous la forme de deux ponts surélevés de chaque côté de la rainure centrale dans la moitié antérieure de la tête. Pour fixer la tête au plat, insérez une pointe d’une pince fine à travers le tissu près de la région nasale de la tête antérieure aux étagères palatales, et l’autre à travers la base du crâne postérieure aux étagères palatales.

Insérez les deux points d’une deuxième paire de pinces très pointues et fines dans le tissu à la base de la surface latérale de l’étagère et pincez lentement et soigneusement pour couper le tissu. Répétez l’incision le long de la base de la surface médiale de l’étagère et aux extrémités antérieure et postérieure de l’étagère pour détacher l’étagère de sa fixation à la tête, puis soulevez doucement l’étagère, en faisant des pincements supplémentaires si nécessaire pour libérer complètement la coquille du tissu environnant. Lorsque la deuxième étagère palatale a été retirée de la même manière, utilisez une pipette de transfert d’ampoule en plastique stérile pour transférer les étagères dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 millilitre dans environ 500 microlitres de PBS sur la glace.

Pour mettre en place une culture cellulaire MEPM, lorsque toutes les étagères ont été collectées, aspirez le PBS sans perturber les tissus et ajoutez immédiatement 200 microlitres de 37 degrés Celsius 0,25% de trypsine à chaque tube de tissu palatal. Utilisez une pipette de 1 000 microlitres pour pipeter brièvement les tissus plusieurs fois et incuber les tissus pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius, en pipetant brièvement après cinq minutes. À la fin de l’incubation, pipettez à nouveau les tissus avant d’ajouter 800 microlitres de milieu de culture MEPM à chaque tube et de centrifuger les tubes pour recueillir les cellules.

Après avoir aspiré le surnageant, remettre en service les granulés dans un millilitre de milieu de culture MEPM frais par tube, et plaquer les cellules dans des puits individuels d’une plaque traitée par culture tissulaire de six puits contenant deux millilitres par puits pour un total final de trois millilitres par puits, puis laisser les cellules adhérer à la surface plastique pendant 12 heures dans un incubateur de culture cellulaire stérile. Pour mettre en place un test de migration collective 2D, retirez le haut d’un insert stérile en silicone à deux puits à une hauteur d’environ un millimètre pour chaque échantillon à analyser et utilisez des pinces stériles pour plaquer les inserts à deux puits raccourcis et stériles au centre des puits individuels d’une plaque à six puits. Appuyez sur tous les bords pour vous assurer que les inserts sont entièrement adhérés au fond du puits et ensemencez 300 cellules MEPM par millimètre carré d’inserts en silicone raccourcis dans un volume total de 40 à 50 microlitres de milieu de culture MEPM dans chaque insert pour une incubation nocturne dans l’incubateur de culture cellulaire.

Pour mettre en place un test de réparation de plaie, utilisez une pince stérile pour placer un insert stérile en silicone à deux puits non modifié au centre d’un puits d’une plaque de six puits par échantillon et appuyez fermement sur les bords de l’insert pour attacher l’insert à la plaque de culture. Ensuite, ensemencez 1 400 cellules par millimètre carré dans 100 microlitres de milieu de culture MEPM dans chaque insert et incubez les cellules pendant 48 heures dans le milieu de culture cellulaire. Lors de l’exécution d’un test de migration collective 2D, l’ensemencement des cellules dans des inserts en silicone à deux puits dans une grande boîte de culture fournit généralement une meilleure densité cellulaire pour l’imagerie.

De petits anneaux imprimés en 3D placés dans un plat de 35 millimètres peuvent également être utilisés pour l’analyse de la motilité 2D. Pour les essais de réparation des plaies, les cellules sont cultivées dans des inserts en silicone à deux puits jusqu’à une confluence élevée. Les inserts sont ensuite retirés et la plaie est imagée jusqu’à la fermeture.

Les trajectoires MEPM sont persistantes et la direction de la motilité cellulaire est maintenue pendant plusieurs heures. L’analyse du déplacement moyen par rapport au temps indique que la persistance sous forme de déplacement est proportionnelle au temps écoulé. L’analyse en flux des données de motilité révèle que les amas de cellules MEPM co-mobiles ont une taille d’environ 300 microns.

Une profonde différence de motilité entre les cellules MEPM de type sauvage et mutantes est également observée. Cette procédure pourrait être utilisée sur diverses lignées de souris transgéniques et pour traiter les cellules MEPM avec divers réactifs biochimiques afin d’étudier leurs effets sur le mouvement cellulaire. Nous nous sommes concentrés sur les cellules de mésenchyme palatal primaire, mais l’imagerie en accéléré et les analyses quantitatives peuvent également être utilisées pour explorer les attributs de migration de tout type de cellule mobile dans les processus de développement dynamique.