Name: Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Apprenez à caractériser la dynamique des myosines non musculaires au niveau protéique grâce à des tests de motilité par microscopie à fluorescence in vitro. Cette méthode rapide et reproductible permet d'étudier les mutations pathogènes et les propriétés motiles cellulaires.

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Nous remercions le Dr Fang Zhang pour son assistance technique dans la préparation des réactifs utilisés pour la collecte de ces données. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros NHLBI/NIH HL001786 à J.R.S.

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Présenté ici est un flux de travail pour la purification et la caractérisation in vitro de la myosine 5a et de la myosine 2b nonmuscle. Cet ensemble d’expériences est utile pour quantifier les propriétés mécanochimiques des constructions de myosine purifiée de manière rapide et reproductible. Bien que les deux myosines présentées ici ne soient que deux exemples spécifiques parmi les nombreuses possibilités, les conditions et les techniques peuvent être appliquées, avec une certaine adaptation, à la plupart des myosines e...

Les myosines sont des protéines motrices qui exercent une force sur les filaments d’actine en utilisant l’énergie dérivée de l’hydrolyse de l’adénosine triphosphate (ATP)1. Les myosines contiennent un domaine de la tête, du cou et de la queue. Le domaine principal contient la région de liaison à l’actine ainsi que le site de liaison et d’hydrolyse de l’ATP. Les domaines du cou sont composés de motifs IQ, qui se lient à des chaînes légères, à la calmoduline ou à des protéines de type calmoduline2,3. La région de la queue a plusieurs fonctions spécifiques à chaque classe de myosines, y compris, mais sans s’y limiter, la dimérisation de deux chaînes lourdes, la liaison des molécules de cargaison et la régulation de la myosine via des interactions auto-inhibitoires avec les domaines de la tête1.
Les propriétés mobiles de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre. Certaines de ces propriétés comprennent le rapport de service (la fraction du cycle mécanique de la myosine dans laquelle la myosine est liée à l’actine) et la processivité (la capacité d’un moteur à effectuer plusieurs pas sur sa voie avant le détachement)4. Les plus de 40 classes de myosines ont été déterminées sur la base d’analyses deséquences 5,6,7,8. Les myosines de classe 2 sont classées comme « conventionnelles » puisqu’elles ont été les premières à être étudiées ; toutes les autres classes de myosines sont donc classées comme « non conventionnelles ».
La myosine 5a (M5a) est une myosine de classe 5 et est un moteur processif, ce qui signifie qu’elle peut prendre plusieurs étapes le long de l’actine avant de se dissocier. Il a un rapport de service élevé, indiquant qu’il passe une grande partie de son cycle mécanique lié à l’actine9,10,11,12,13,14. Comme d’autres myosines, la chaîne lourde contient un domaine moteur N-terminal qui comprend à la fois un site d’hydrolyse de liaison à l’actine et un site d’hydrolyse de l’ATP, suivi d’une région du cou qui sert de bras de levier, avec six motifs IQ qui se lient aux chaînes légères essentielles (ELC) et à la calmoduline (CaM)15. La région de la queue contient des bobines enroulées α-hélicoïdales, qui dimérisent la molécule, suivies d’une région de queue globulaire pour la liaison de la cargaison. Sa cinétique reflète son implication dans le transport des mélanosomes dans les mélanocytes et du réticulum endoplasmique dans les neurones de Purkinje16,17. M5a est considéré comme le prototype du moteur de transport demarchandises 18.
Les myosines de classe 2, ou les myosines conventionnelles, comprennent les myosines qui alimentent la contraction des muscles squelettiques, cardiaques et lisses en plus des isoformes de myosine 2 (NM2) non musculaires, NM2a, 2b et 2c19. Les isoformes NM2 se trouvent dans le cytoplasme de toutes les cellules et ont des rôles partagés dans la cytocinèse, l’adhésion, la morphogenèse tissulaire et la migration cellulaire19,20,21,22. Cet article traite des protocoles conventionnels de myosine dans le contexte de la myosine 2b (NM2b)non musculclée 23. NM2b, par rapport à M5a, a un faible rapport de service et est enzymatiquement plus lent avec un Vmax de 0,2 s-123 par rapport au Vmax de M5a de ≈18 s-124. Notamment, les constructions NM2b tronquées avec deux têtes ne se déplacent pas facilement de manière processive sur l’actine; au contraire, chaque rencontre avec l’actine entraîne un coup de puissance suivi d’une dissociation de la molécule25.
NM2b contient deux chaînes lourdes de myosine, chacune avec un domaine de tête globulaire, un bras de levier (avec un ELC et une chaîne légère régulatrice (RLC)), et un domaine de tige / queue enroulée α-hélicoïdale, d’environ 1 100 acides aminés de long, qui dimérise ces deux chaînes lourdes. L’activité enzymatique et l’état structurel du NM2b sont régulés par phosphorylation du RLC23. Le NM2b non phosphorylé, en présence d’ATP et de forces ioniques physiologiques (environ 150 mM de sel), adopte une conformation compacte dans laquelle les deux têtes font participer à une interaction asymétrique et la queue se replie sur les têtes en deux endroits23. Dans cet état, la myosine n’interagit pas fortement avec l’actine et a une très faible activité enzymatique. Lors de la phosphorylation RLC par la kinase à chaîne légère de la myosine dépendante de la calmoduline (MLCK) ou la protéine kinase associée à rho, la molécule s’étend et s’associe à d’autres myosines à travers la région de la queue pour former des filaments bipolaires d’environ 30 molécules de myosine23. La phosphorylation susmentionnée du RLC entraîne également une augmentation de l’activité de l’ATPase activée par l’actine de NM2b d’environ quatre fois26,27,28. Cet arrangement de filament bipolaire, avec de nombreux moteurs de myosine à chaque extrémité, est optimisé pour les rôles de contraction et de maintien de la tension, où les filaments d’actine avec des polarités opposées peuvent être déplacés les uns par rapport aux autres23,29. En conséquence, il a été démontré que le NM2b agit comme un ensemble de moteurs lorsqu’il interagit avec l’actine. Le grand nombre de moteurs à l’intérieur de ce filament permet aux filaments NM2b de se déplacer de manière processive sur les filaments d’actine, ce qui rend la processivité du filament in vitro possible pour caractériser29.
Bien que des progrès aient été réalisés dans la compréhension du rôle des myosines dans la cellule, il est nécessaire de comprendre leurs caractéristiques individuelles au niveau des protéines. Pour comprendre les interactions de l’actomyosine à un niveau d’interaction protéine-protéine simple, plutôt qu’à l’intérieur d’une cellule, nous pouvons exprimer et purifier les myosines recombinantes pour une utilisation dans des études in vitro. Les résultats de telles études informent ensuite les mécanobiologistes sur les propriétés biophysiques de myosines spécifiques qui conduisent finalement des processus cellulaires complexes12,13,14,25,29. Typiquement, cela est accompli en ajoutant une étiquette d’affinité à une construction de myosine pleine longueur ou tronquée et en purifiant par chromatographie d’affinité29,30,31. De plus, la construction peut être modifiée pour inclure un fluorophore génétiquement codé ou une étiquette pour le balisage des protéines avec un fluorophore synthétique. En ajoutant une telle étiquette fluorescente, des études d’imagerie à molécule unique peuvent être effectuées pour observer la mécanique et la cinétique de la myosine.
Après la purification, la myosine peut être caractérisée de plusieurs façons. L’activité de l’ATPase peut être mesurée par des méthodes colorimétriques, fournissant un aperçu de la consommation d’énergie globale et de l’affinité actine du moteur dans différentes conditions32. Pour en savoir plus sur la mécanochimie de sa motilité, d’autres expériences sont nécessaires. Cet article détaille deux méthodes basées sur la microscopie à fluorescence in vitro qui peuvent être utilisées pour caractériser les propriétés mobiles d’une protéine de myosine purifiée.
La première de ces méthodes est le test du filament d’actine planant, qui peut être utilisé pour étudier quantitativement les propriétés d’ensemble des moteurs de myosine, ainsi que pour étudier qualitativement la qualité d’un lot de protéine purifiée33. Bien que cet article traite de l’utilisation de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) pour ce test, ces expériences peuvent être réalisées efficacement à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un appareil photo numérique, que l’on trouve couramment dans de nombreux laboratoires34. Dans ce test, une couche saturante de moteurs à myosine est attachée à un couvercle. Cela peut être accompli en utilisant de la nitrocellulose, des anticorps, des membranes, des surfaces dérivatisées enSiO2(telles que le triméthylchlorosilane), entre autres29,33,35,36,37,38. Les filaments d’actine marqués par fluorescence sont passés à travers la chambre de couverture, sur laquelle l’actine se lie à la myosine attachée à la surface. Lors de l’ajout d’ATP (et de kinases dans l’étude de NM2), la chambre est imagée pour observer la translocation des filaments d’actine par les myosines liées à la surface. Un logiciel de suivi peut être utilisé pour corréler la vitesse et la longueur de chaque filament d’actine planant. Un logiciel d’analyse peut également fournir une mesure du nombre de filaments d’actine mobiles et stationnaires, ce qui peut être utile pour déterminer la qualité d’une préparation de myosine donnée. La proportion de filaments bloqués peut également être intentionnellement modulée par attache de surface de l’actine à d’autres protéines et mesurée pour déterminer la dépendance à la charge de la myosine39. Étant donné que chaque filament d’actine peut être propulsé par un grand nombre de moteurs disponibles, ce test est très reproductible, la vitesse finale mesurée étant robuste aux perturbations telles que les altérations de la concentration de myosine de départ ou la présence de facteurs supplémentaires dans la solution. Cela signifie qu’il peut être facilement modifié pour étudier l’activité de la myosine dans différentes conditions, telles que la phosphorylation altérée, la température, la force ionique, la viscosité de la solution et les effets de la charge induite par les attaches de surface. Bien que des facteurs tels que les « têtes mortes » de myosine à forte liaison incapables d’hydrolyse de l’ATP puissent provoquer des filaments d’actine bloqués, de multiples méthodes existent pour atténuer ces problèmes et permettre des mesures précises. Les propriétés cinétiques de la myosine varient considérablement d’une classe à l’autre et, selon la myosine spécifique utilisée, la vitesse de glissement du filament d’actine dans ce test peut varier de moins de 20 nm / s (myosine9) 40,41, et jusqu’à 60 000 nm / s (myosine characée 11)42.
Le second essai inverse la géométrie du test du filament d’actine glissant12. Ici, les filaments d’actine sont attachés à la surface de couverture et le mouvement de molécules uniques de M5a ou de filaments bipolaires individuels de NM2b est visualisé. Ce test peut être utilisé pour quantifier les longueurs et les vitesses d’exécution de molécules ou de filaments de myosine simples sur l’actine. Un couvercle est recouvert d’un composé chimique qui bloque la liaison non spécifique et fonctionnalise simultanément la surface, tel que la biotine-polyéthylène glycol (biotine-PEG). L’ajout de dérivés d’avidine modifiés amorce ensuite la surface et l’actine biotinylée est passée à travers la chambre, ce qui donne une couche de F-actine liée de manière stable au fond de la chambre. Enfin, la myosine activée et étiquetée par fluorescence (généralement 1-100 nM) est acheminée à travers la chambre, qui est ensuite imagée pour observer le mouvement de la myosine sur les filaments d’actine stationnaires.
Ces modalités représentent des méthodes rapides et reproductibles qui peuvent être utilisées pour examiner la dynamique des myosines non musculaires et musculaires. Ce rapport décrit les procédures pour purifier et caractériser à la fois M5a et NM2b, représentant respectivement les myosines non conventionnelles et conventionnelles. Ceci est suivi d’une discussion de certaines des adaptations spécifiques à la myosine, qui peuvent être effectuées pour obtenir une capture réussie du mouvement dans les deux types de test.
Expression et biologie moléculaire L’ADNc de la myosine d’intérêt doit être cloné sur un vecteur pFastBac1 modifié qui code soit pour une balise FLAG terminale C (DYKDDDDK) si elle exprime M5a-HMM, soit pour une balise FLAG N-terminale si elle exprime la molécule pleine longueur de NM2b23,43,44,45,46. Les marqueurs FLAG C-terminal sur NM2b entraînent une affinité affaiblie de la protéine pour la colonne d’affinité FLAG. En revanche, la protéine marquée N-terminally FLAG se lie généralement bien à la colonne d’affinité FLAG23. La protéine marquée N-terminale conserve l’activité enzymatique, l’activité mécanique et la régulation dépendante de la phosphorylation23.
Dans cet article, une construction de type M5a de type Mromyosine lourde (HMM) de souris tronquée avec un GFP entre l’étiquette FLAG et le terminus C de la chaîne lourde de myosine a été utilisée. Notez que contrairement à NM2b, M5a-HMM peut être étiqueté et purifié avec succès avec des balises FLAG N ou C-terminal et dans les deux cas, la construction résultante sera active. La chaîne lourde M5a a été tronquée à l’acide aminé 1090 et contient un tritrateur d’acides aminés (GCG) entre le GFP et la région de la bobine enroulée du M5a47. Aucun éditeur de liens supplémentaire n’a été ajouté entre le GFP et la balise FLAG. M5a-HMM a été co-exprimé avec la calmoduline. La construction NM2b humaine pleine longueur a été co-exprimée avec ELC et RLC. Le N-termini du RLC a été fusionné avec un GFP via un linker de cinq acides aminés (SGLRS). Directement attaché à la balise FLAG était un HaloTag. Entre le HaloTag et le N-terminus de la chaîne lourde de la myosine se trouvait un linker composé de deux acides aminés (AS).
Les deux préparations de myosine ont été purifiées à partir d’un litre de culture cellulaire Sf9 infectée par le baculovirus à une densité d’environ 2 x 106 cellules / mL. Les volumes du baculovirus pour chaque sous-unité dépendaient de la multiplicité d’infection du virus telle que déterminée par les instructions du fabricant. Dans le cas de M5a, les cellules ont été co-infectées par deux baculovirus différents, l’un pour la calmoduline et l’autre pour la chaîne lourde M5a. Dans le cas du NM2b, les cellules ont été co-infectées par trois virus différents: un pour ELC, un pour RLC et un pour nm2b chaîne lourde. Pour les laboratoires travaillant avec une diversité de myosines (ou d’autres protéines multi-complexes), cette approche est efficace car elle permet de nombreuses combinaisons de chaînes lourdes et légères et les chaînes légères couramment utilisées telles que la calmoduline peuvent être co-transfectées avec de nombreuses chaînes lourdes de myosine différentes. Tous les travaux cellulaires ont été effectués dans une armoire de biosécurité avec une technique stérile appropriée pour éviter la contamination.
Pour l’expression de M5a et NM2b, les cellules Sf9 produisant les myosines recombinantes ont été collectées 2 à 3 jours après l’infection, par centrifugation, et stockées à -80 °C. Les pastilles cellulaires ont été obtenues en centrifugant les cellules Sf9 co-infectées à 4 °C pendant 30 min à 2 800 x g. Le processus de purification des protéines est détaillé ci-dessous.

<table><tbody><tr><td>Seringue 1 mL</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2 M CaCl2 Solution</td><td>VWR</td><td>10128-558</td><td></td></tr><tr><td>2 M MgCl2 Solution</td><td>VWR</td><td>10128-298</td><td></td></tr><tr><td>27 Gauge Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>Solution 5 M NaCl</td><td>KD Medical</td><td>RGE-3270</td><td></td></tr><tr><td><Acide acétique fort<>/fort></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>984303</td><td></td></tr><tr><td>Acétate d’amyle</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>A2220</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf</td></tr><tr><td><fort>ATP</fort></td><td>Millipore Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td><fort>G-actine biotinylée</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Millipore Sigma</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>bPEG-silane</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>Biotin-PEG-SIL-3400-1g</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reacid Concentrate</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Calmodulin</td><td></td><td>PMID : 2985564</td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Millipore Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Cell Line (Sf9) in SF-900 II SFM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11496015</td><td>http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf</td></tr><tr><td>Circular Filter Paper - Gliding Assay</td>Papier filtre circulaire <td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001125</td><td></td></tr><tr><td> - Dosage inversé</td><td>Millipore Sigma</td><td>WHA1001090</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, sans EDTA-Free Inhibitor Tablets </td><td>Millipore Sigma</td><td>5056489001</td><td>Il doit être conservé à 4 °C °C. Les comprimés peuvent être utilisés directement ou peuvent être reconstitués sous forme de solution mère 25x en dissolvant 1 comprimé dans 2 mL d’eau distillée. La solution résultante peut être stockée à 4 &deg ; C pendant 1 à 2 semaines ou au moins 12 semaines à -20 °C °C.</td></tr><tr><td>Concentrating Tubes (100,000 MWCO)</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>UFC910024</td><td>Le MWCO du tube n’est pas nécessairement « taille unique », tant que le MWCO est inférieur au poids moléculaire total de la protéine purifiée. Le NM2b en l’espèce a été concentré avec un tube de 100 000 MWCO et le M5a a été concentré avec un tube de 30 000 MWCO.</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z688568-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips : Gliding Filament Assay</td><td>VWR International</td><td>48366-227</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips : Essai de motilité inversée </td> Tube de dialyse <td>Azer Scientific</td><td>ES0107052</td><td></td></tr><tr><td> (3500 Dalton MCWO)</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-670-5A</td><td>Le diamètre du tube de dialyse peut varier, mais le MWCO doit être le même. Le NM2b utilisé dans ce document a été dialysé dans un tube de dialyse de 18 mm. Les tubes peuvent être conservés dans une solution d’alcool à 20 % à 4 °C.</td></tr><tr><td><fort>DL-Dithiothréitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif double faceOffice</td> <td>Depot</td><td>909955</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK Peptide</td><td>GenScript</td><td>RP10586</td><td>Il peut être dissous dans un tampon contenant 0,1 M de NaCl, 0,1 mM d’EGTA, 3 mM de NaN3 et 10 mM de MOPS (pH 7,2) jusqu’à une concentration finale de 50 mg/mL. Celle-ci peut être stockée à -20 &deg ; C comme 300 & micro ; L aliquotes.&nbsp ;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Elution Column</td><td>Bio-Rad</td><td>761-1550 Ceux-ci</td><td>peuvent être réutilisés. Pour nettoyer, rincez la colonne avec 2-3 volumes de colonne de PBS et d’eau distillée. Refroidir la colonne à 4&deg ; C avant utilisation.</td></tr><tr><td><fort>éthanol</fort></td><td>Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td><fort>G-actine</fort></td><td></td><td>PMID : 4254541</td><td>stock de G-actine peut être stocké à 200 &mu ; M dans le N2 liquide.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Oxidase</td><td>Millipore Sigma</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>Glycine Buffer Solution, 100 mM, pH 2-2,5, 1 L</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-295018</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag</td><td>Promega</td><td>G100A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fischer Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Large-Orifice Tipet Tips</td><td>Fischer Scientific</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin Protéase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78435</td><td></td></tr><tr><td>Échelle standard Mark12 Unstained Standard </td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC5677</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>MX0482</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-553-10</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP308-100</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-silane</td><td>Laysan Bio, Inc</td><td>MPEG-SIL-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Myosin Light Chain Kinase</td><td></td><td>PMID : 23148220</td><td>MLCK marqué FLAG peut être purifié de la même manière que la myosine marquée FLAG a été purifiée ici.&nbsp ;</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Millipore Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31050</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10800</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4 à 12 % Bis-Tris Mini Gel, 15 puits</fort></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323PK2</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampon d’échantillon (4X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate salin, pH 7,4</fort></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>78830</td><td>Le PMSF peut être préparé sous forme de solution mère de 0,1 M dans de l’isopropanol et stocké dans 4 °C. L’ajout d’isopropanol entraîne une précipitation cristalline, qui peut être dissoute en agitant à température ambiante. Immédiatement avant l’utilisation, le PMSF peut être ajouté goutte à goutte à une solution à agitation rapide jusqu’à une concentration finale de 0,1 mM.</td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Office Depot</td><td>397492</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine-Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R415</td><td>Stock peut être dilué dans 100 % de méthanol jusqu’à une concentration finale de 200 &mu ;M.</td></tr><tr><td>Média Sf9</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12658-027</td><td>Il doit être stocké à 4&deg ; C. Sa durée de conservation est de 18 mois à compter de la date de fabrication.</td></tr><tr><td><fort>Boîte de culture tissulaire - Essai de glissement</fort></td><td>Corning</td><td>353025</td><td>Chaque boîte de culture tissulaire peut contenir environ neuf lamelles.</td></tr><tr><td>Tissue Culture Dish - Inverted Assay</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Chaque boîte de culture tissulaire peut contenir environ quatre lamelles.</td></tr><tr><td><fort>Lisse 200 & micro ; L Pointes de pipette </td><td>Thomas Scientific</td><td>1158U38</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75006590</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Modèle : Eclipse Ti avec système H-TIRF avec objectif 100x TIRF (N.A. 1.49)</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Camera</td><td>Andor</td><td>Modèle : Caméra iXon DU888 EMCCD (format de capteur 1024 x 1024)</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Environmental Control Box</td><td>Tokai HIT</td><td>Custom Thermobox</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Laser Unit</td><td></td>Nikon <td>LU-n4 quatre unités laser avec lasers à semi-conducteurs pour 405nm, 488nm, 561nm et 640nm</td><td></td></tr><tr><td>Mid Bench Centrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Modèle : CR3i</td><td></td></tr><tr><td>Misonix Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>Optima Max-Xp Tabletop Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Plasma-Cleaner</td><td>Diener electronic GmbH + Co. KG</td><td>System Type : Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Sonde sonicatrice (3,2 mm)</td><td>Qsonica</td><td>4418</td><td></td></tr><tr><td>Standard Incubator</td><td>Binder</td><td>Modèle : 56</td><td></td></tr><tr><td>Waverly Tube Mixer</td><td>Waverly</td><td>TR6E</td><td></td></tr><tr><td>SOFTWARE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJ FIJI</td><td>https://imagej.net/Fiji/Downloads</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FAST (Version 1.01)</td><td>http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements</td><td>FAST est disponible pour les systèmes Mac OSX et Linux.</td><td></td></tr><tr><td>Image Stabilizer Plugin</td><td>https://imagej.net/Image_Stabilizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ TrackMate</td><td>https://imagej.net/TrackMate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Software</td><td>NIS Elements (package AR)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> File:TrackMate-manual.pdf <td>https://github.com/turalaksel/FASTrack</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Les protéines de myosine se lient et interagissent avec l’actine filamenteuse (F-actine) et se trouvent dans les organismes à travers l’arbre phylogénétique. Leur structure et leurs propriétés enzymatiques sont adaptées à la fonction particulière qu’ils exécutent dans les cellules. La myosine 5a marche processivement sur la F-actine pour transporter les mélanosomes et les vésicules dans les cellules. Inversement, la myosine 2b nonmuscle fonctionne comme un filament bipolaire contenant environ 30 molécules. Il déplace la F-actine de polarité opposée vers le centre du filament, où les molécules de myosine travaillent de manière asynchrone pour lier l’actine, donner un coup de puissance et se dissocier avant de répéter le cycle. La myosine 2b non musculaire, ainsi que ses autres isoformes de myosine 2 non musculaires, ont des rôles qui incluent l’adhésion cellulaire, la cytocinèse et le maintien de la tension. La mécanochimie des myosines peut être étudiée en effectuant des tests de motilité in vitro à l’aide de protéines purifiées. Dans le test du filament d’actine planant, les myosines sont liées à une surface de couverture de microscope et transloquent de la F-actine étiquetée par fluorescence, qui peut être suivie. Dans le test de motilité d’une molécule unique / ensemble, cependant, la F-actine est liée à un couvercle et le mouvement des molécules de myosine étiquetées par fluorescence sur la F-actine est observé. Dans ce rapport, la purification de la myosine 5a recombinante à partir de cellules Sf9 par chromatographie d’affinité est décrite. Ensuite, nous décrivons deux essais basés sur la microscopie à fluorescence: le test du filament d’actine glissant et le test de motilité inversée. À partir de ces essais, des paramètres tels que les vitesses de translocation de l’actine et les longueurs et vitesses d’exécution d’une seule molécule peuvent être extraits à l’aide du logiciel d’analyse d’images. Ces techniques peuvent également être appliquées pour étudier le mouvement de filaments simples des isoformes de la myosine 2 nonmuscle, discutées ici dans le contexte de la myosine 2b nonmuscle. Ce flux de travail représente un protocole et un ensemble d’outils quantitatifs qui peuvent être utilisés pour étudier la molécule unique et la dynamique d’ensemble des myosines nonmuscles.

La purification de la myosine peut être évaluée en effectuant une électrophorèse sur gel-polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) réductrice comme le montre la figure 2. Bien que cette figure représente la myosine finale post-dialysée, SDS-PAGE peut être effectuée sur des aliquotes des différentes étapes de la procédure de purification pour identifier les produits perdus par le surnageant. Myosin 5a HMM a une bande dans la gamme 120-130 kDa et la myosine 2b non musclée pleine lo...

Présenté ici est une procédure pour exprimer et purifier la myosine 5a suivie d’une discussion sur sa caractérisation, en utilisant à la fois des essais in vitro de microscopie à fluorescence in vitro à molécule unique et comment ces méthodes peuvent être modifiées pour la caractérisation de la myosine 2b nonmuscle.

Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Ce protocole peut être utilisé pour caractériser la dynamique de la myosine non musculaire au niveau des protéines, ce qui peut informer les propriétés mobiles qui contribuent à leur rôle dans les cellules. Il s’agit d’une méthode rapide, reproductible et hautement contrôlée qui peut être utilisée pour étudier les effets de diverses conditions régulatrices sur la motilité de la myosine, en informant leurs comportements cellulaires. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier comment les mutations pathogènes dans les myosines non musculaires affectent leurs comportements au niveau de la molécule unique et de l’ensemble.L’approche générale de sa méthodologie peut être appliquée à divers autres systèmes cytosquelettes, tels que la caractérisation des kinésines purifiées et des dynéines avec des microtubules. La polyvalence de ce protocole peut soulever des questions sur les fluorophores et les conditions chimiques les plus appropriées, mais la méthode peut être optimisée relativement rapidement. Comprendre comment mettre en place et enduire les chambres d’écoulement constitue une base solide sur laquelle on peut s’adapter à diverses conditions pour ces expériences.Pour commencer, préparez une solution de nitrocellulose à un pour cent dans de l’acétate d’amyle et placez un papier filtre circulaire de 125 millimètres de diamètre au fond d’une plaque de culture tissulaire. Chargez huit couvercles carrés glissés sur une grille et lavez-les soigneusement avec environ deux à cinq millilitres d’éthanol à l’épreuve des 200, suivis de deux à cinq millilitres d’eau distillée. Ensuite, entraînez complètement les glissements du couvercle à l’aide d’une conduite d’air filtrée ou d’une conduite d’azote.Pipettez lentement 10 microlitres de solution de nitrocellulose à un pour cent le long d’un bord d’un couvercle. Étalez-le sur le reste du couvercle à l’aide du côté d’une pointe de pipette de 200 microlitres en un seul mouvement lisse. Ensuite, placez ce couvercle sur le plat de culture tissulaire avec le côté nitrocellulose vers le haut.Répétez cette opération pour les feuillets de couverture restants et laissez-les sécher. Essuyez une lame de microscope avec un papier à lentille optique pour nettoyer les gros débris. Coupez deux morceaux de ruban adhésif double face, d’environ deux centimètres de long, et placez-en une au milieu du long bord de la lame du microscope.Placez le deuxième morceau de ruban adhésif à environ deux millimètres sous le premier morceau de ruban de manière à ce que les deux soient parallèles, créant ainsi une chambre d’écoulement pouvant contenir environ 10 microlitres de solution. Collez soigneusement l’un des couvercles en nitrocellulose glissé sur le ruban adhésif afin que le côté recouvert de nitrocellulose entre en contact direct avec le ruban. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur l’interface du ruban adhésif pour vous assurer que le couvercle adhère correctement à la glissière.Ensuite, coupez l’excès de ruban adhésif suspendu sur le bord de la glissière avec une lame de rasoir. Préparez les solutions pour Myosin 5a et conservez-les sur la glace. Faites couler 10 microlitres de myosine 5a à travers la chambre d’écoulement à glissière et attendez une minute.Ensuite, faites circuler 10 microlitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans un tampon de motilité avec DTT. Répétez cette opération deux fois et attendez une minute après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal en plaçant doucement le coin du papier à la sortie de la chambre d’écoulement.Ensuite, lavez avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT. Pipeter la solution d’actine noire avec une seringue d’un millilitre et une aiguille de calibre 27 pour cisailler les filaments d’actine avant d’introduire cette solution dans la chambre. Ajouter l’actine noire à la chambre en présence d’un millimolaire ATP en MB millimolaire avec un millimolaire DTT.Ensuite, circulez dans 50 microlitres de tampon de motilité avec DTT et un millimolaire d’ATP pour épuiser la chambre des filaments d’actine libres. Lavez avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT trois fois pour épuiser la chambre de tout ATP. S’écouler dans 10 microlitres de solution d’actine RH nanomolaire contenant un tampon de motilité avec DTT et attendre une minute pour permettre la liaison rigoureuse des filaments d’actine à la myosine 5a fixée à la surface du couvercle.Laver avec 10 microlitres de tampon de motilité de 50 millimolaires avec DTT deux fois pour éliminer les filaments d’actine RH non liés. Débit dans 30 microlitres de tampon final. Enregistrez des images sur un microscope à fluorescence en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 561 nanomètres pour visualiser l’actine RH.Préparez les solutions pour le test de motilité inversé Myosin 5a et conservez-les sur la glace. Lavez-les chambre avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT. Débit en 10 microlitres d’un milligramme par millilitre BSA dans un tampon de motilité avec DTT.Répétez cette opération deux fois, en attendant une minute après le troisième lavage. Utilisez du papier mouchoir ou du papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal en plaçant doucement le coin du papier à la sortie de la chambre d’écoulement. Ensuite, lavez la chambre avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT trois fois.Débiter dans 10 microlitres de la solution NeutrAvidin dans un tampon de motilité avec DTT et attendre une minute. Ensuite, lavez avec 10 microlitres de cette solution trois fois. S’écouler dans 10 microlitres d’actine BRH contenant un tampon de motilité avec DTT à l’aide d’une pointe de pipette à grand alésage.Et attendez une minute. Ensuite, lavez avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT trois fois. Débit dans 30 microlitres de tampon final avec 10 nanomolaires myosine 5a.Et chargez immédiatement sur le microscope à fluorescence à réflexion interne totale. Commencez l’enregistrement une fois que la mise au point optimale pour l’imagerie TIRF est trouvée. La purification de la myosine 2b non musculaire, des chaînes légères essentielles et des chaînes légères régulatrices, ainsi que de la myosine 5a et de la calmoduline a été évaluée en effectuant SDS-PAGE.Le test de filament d’actine glissant montre les caractéristiques d’un film idéal et traçable présentant des mouvements lisses de filaments d’actine étiquetés. Le lavage à l’actine noire a permis de retirer les têtes de myosine mortes du champ de mesure, contribuant ainsi au mouvement global et lisse des filaments d’actine. Des images de sortie de suivi de filament du programme fast track ont été obtenues pour la myosine 2b et la myosine 5a non musculaires.Un histogramme représentatif montre que la vitesse de glissement de l’Actomyosine 2b est de 77 nanomètres par seconde. Et celui d’Actomyosine 5a est de 515 nanomètres par seconde. En l’absence de méthylcellulose, les filaments d’actine ne restent pas aussi étroitement associés à la surface recouverte de myosine, ce qui provoque son flop près de la surface des glissements de couverture non musculaires recouverts de myosine 2b.Le mouvement de la myosine a été observé sur des filaments d’actine fluorescents attachés à la surface à l’aide du test de motilité inversé. Il est important de cisailler l’actine non étiquetée avant de l’introduire dans la cellule d’écoulement pour le lavage de l’actine noire, ce qui permettra la translocation en douceur de l’actine. Des expériences supplémentaires peuvent étudier comment la motilité de la myosine est affectée par les mutations de la myosine, les protéines induisant la charge, la force ionique et les protéines régulatrices.Diverses conditions cellulaires peuvent être reconstituées pour de futures études. Ces méthodes permettent d’examiner de manière biochimique et biophysique comment diverses isoformes de myosine varient dans leurs propriétés mobiles et mécaniques au niveau de la molécule unique et de l’ensemble.

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Dans cette vidéo, nous effectuons un test de motilité in vitro pour analyser les interactions actine-myosine. Le mouvement de glissement des filaments d’actine sur des molécules de myosine immobilisées est visualisé à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Le test du filament d’actine glissant : un test de motilité in vitro pour étudier la translocation des filaments d’actine sur des myosines immobilisées

Essai de motilité inversée : une technique in vitro pour visualiser le mouvement de la myosine sur des filaments d’actine immobilisés

Ici, un protocole est présenté pour identifier Kinesin-1 cargaisons. Un mutant sans moteur du Kinesin-1 chaîne lourde (KIF5B) agrège dans le cytoplasme et induit une agrégation de ses cargaisons. Les deux granulats sont détectés au microscope à fluorescence. Une stratégie similaire peut être utilisée pour identifier d'autres protéines cargos à moteur.

Identification des Kinesin-1 Cargos utilisant microscopie à fluorescence

Des découvertes récentes suggèrent que les moteurs flagellaires bactériens détectent une variété de signaux environnementaux et se remodèlent en réponse. Les tests de billes discutés ici devraient aider à expliquer le rôle du remodelage dans l’adaptation cellulaire aux facteurs de stress environnementaux.

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Ici, nous illustrons comment microscopie photoactivation localisation seule molécule peut être effectuée sur le terminal de nerf moteur d’un live de Drosophila melanogaster troisième stade larve.

In Vivo Simple-molécule suivi du terminal de nerf moteur présynaptique Drosophila

La kinésine mitotique bidirectionnelle-5 Cin8 s’accumule en grappes qui se divisent et fusionnent au cours de leur motilité. L’accumulation en amas modifie également la vitesse et la directionnalité de Cin8. Ici, un protocole pour les tests de motilité avec Cin8-GFP purifié et l’analyse des propriétés mobiles de molécules uniques et de grappes de Cin8 est décrit.

Motilité de molécules uniques et d’amas de kinésine-5 Cin8 bidirectionnelle purifiée à partir de cellules de S. cerevisiae

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Criblage de la mécanique d’ensemble de la myosine dans des faisceaux de filaments d’actine à l’aide de pincettes optiques

Nous présentons ici un protocole pour reconstituer des faisceaux de microtubules in vitro et quantifier directement les forces exercées en leur sein en utilisant le piégeage optique simultané et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Ce test permet de mesurer à l’échelle nanométrique les forces et les déplacements générés par les ensembles de protéines au sein de réseaux de microtubules actifs.

Mesure directe des forces dans les faisceaux de microtubules actifs reconstitués

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Analyse à molécule unique de moteurs de la famille Sf9 superprocessive kinésine-3 purifiée

Ce protocole détaille les procédures de production recombinante de l’holoenzyme myosine-7a humaine à l’aide du système de baculovirus MultiBac et d’étude de sa motilité à l’aide d’un test de glissement de filament in vitro sur mesure.

Purification et caractérisation biophysique de la myosine-7a humaine basée sur le système MultiBac

Ici, nous présentons des méthodes pour préparer des assemblages d’actine quasi-bidimensionnels (2D) intriqués, réticulés et à cristaux liquides à partir de protéines purifiées.

Réglage des modes de contractilité et de déformation des assemblages à base d’actine active in vitro : des réseaux actifs bidimensionnels aux gouttes à cristaux liquides

Apprenez à caractériser la dynamique des myosines non musculaires au niveau protéique grâce à des tests de motilité par microscopie à fluorescence in vitro. Cette méthode rapide et reproductible permet d'étudier les mutations pathogènes et les propriétés motiles cellulaires.

Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

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