Adaptations spécifiques à la myosine des tests de motilité basés sur la microscopie à fluorescence in vitro

Ce protocole peut être utilisé pour caractériser la dynamique de la myosine non musculaire au niveau des protéines, ce qui peut informer les propriétés mobiles qui contribuent à leur rôle dans les cellules. Il s’agit d’une méthode rapide, reproductible et hautement contrôlée qui peut être utilisée pour étudier les effets de diverses conditions régulatrices sur la motilité de la myosine, en informant leurs comportements cellulaires. Ces techniques peuvent être utilisées pour étudier comment les mutations pathogènes dans les myosines non musculaires affectent leurs comportements au niveau de la molécule unique et de l’ensemble.

L’approche générale de sa méthodologie peut être appliquée à divers autres systèmes cytosquelettes, tels que la caractérisation des kinésines purifiées et des dynéines avec des microtubules. La polyvalence de ce protocole peut soulever des questions sur les fluorophores et les conditions chimiques les plus appropriées, mais la méthode peut être optimisée relativement rapidement. Comprendre comment mettre en place et enduire les chambres d’écoulement constitue une base solide sur laquelle on peut s’adapter à diverses conditions pour ces expériences.

Pour commencer, préparez une solution de nitrocellulose à un pour cent dans de l’acétate d’amyle et placez un papier filtre circulaire de 125 millimètres de diamètre au fond d’une plaque de culture tissulaire. Chargez huit couvercles carrés glissés sur une grille et lavez-les soigneusement avec environ deux à cinq millilitres d’éthanol à l’épreuve des 200, suivis de deux à cinq millilitres d’eau distillée. Ensuite, entraînez complètement les glissements du couvercle à l’aide d’une conduite d’air filtrée ou d’une conduite d’azote.

Pipettez lentement 10 microlitres de solution de nitrocellulose à un pour cent le long d’un bord d’un couvercle. Étalez-le sur le reste du couvercle à l’aide du côté d’une pointe de pipette de 200 microlitres en un seul mouvement lisse. Ensuite, placez ce couvercle sur le plat de culture tissulaire avec le côté nitrocellulose vers le haut.

Répétez cette opération pour les feuillets de couverture restants et laissez-les sécher. Essuyez une lame de microscope avec un papier à lentille optique pour nettoyer les gros débris. Coupez deux morceaux de ruban adhésif double face, d’environ deux centimètres de long, et placez-en une au milieu du long bord de la lame du microscope.

Placez le deuxième morceau de ruban adhésif à environ deux millimètres sous le premier morceau de ruban de manière à ce que les deux soient parallèles, créant ainsi une chambre d’écoulement pouvant contenir environ 10 microlitres de solution. Collez soigneusement l’un des couvercles en nitrocellulose glissé sur le ruban adhésif afin que le côté recouvert de nitrocellulose entre en contact direct avec le ruban. À l’aide d’une pointe de pipette, appuyez doucement sur l’interface du ruban adhésif pour vous assurer que le couvercle adhère correctement à la glissière.

Ensuite, coupez l’excès de ruban adhésif suspendu sur le bord de la glissière avec une lame de rasoir. Préparez les solutions pour Myosin 5a et conservez-les sur la glace. Faites couler 10 microlitres de myosine 5a à travers la chambre d’écoulement à glissière et attendez une minute.

Ensuite, faites circuler 10 microlitres d’un milligramme par millilitre de BSA dans un tampon de motilité avec DTT. Répétez cette opération deux fois et attendez une minute après le troisième lavage. Utilisez le coin d’un papier de soie ou d’un papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal en plaçant doucement le coin du papier à la sortie de la chambre d’écoulement.

Ensuite, lavez avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT. Pipeter la solution d’actine noire avec une seringue d’un millilitre et une aiguille de calibre 27 pour cisailler les filaments d’actine avant d’introduire cette solution dans la chambre. Ajouter l’actine noire à la chambre en présence d’un millimolaire ATP en MB millimolaire avec un millimolaire DTT.

Ensuite, circulez dans 50 microlitres de tampon de motilité avec DTT et un millimolaire d’ATP pour épuiser la chambre des filaments d’actine libres. Lavez avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT trois fois pour épuiser la chambre de tout ATP. S’écouler dans 10 microlitres de solution d’actine RH nanomolaire contenant un tampon de motilité avec DTT et attendre une minute pour permettre la liaison rigoureuse des filaments d’actine à la myosine 5a fixée à la surface du couvercle.

Laver avec 10 microlitres de tampon de motilité de 50 millimolaires avec DTT deux fois pour éliminer les filaments d’actine RH non liés. Débit dans 30 microlitres de tampon final. Enregistrez des images sur un microscope à fluorescence en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 561 nanomètres pour visualiser l’actine RH.

Préparez les solutions pour le test de motilité inversé Myosin 5a et conservez-les sur la glace. Lavez-les chambre avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT. Débit en 10 microlitres d’un milligramme par millilitre BSA dans un tampon de motilité avec DTT.

Répétez cette opération deux fois, en attendant une minute après le troisième lavage. Utilisez du papier mouchoir ou du papier filtre pour évacuer la solution à travers le canal en plaçant doucement le coin du papier à la sortie de la chambre d’écoulement. Ensuite, lavez la chambre avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT trois fois.

Débiter dans 10 microlitres de la solution NeutrAvidin dans un tampon de motilité avec DTT et attendre une minute. Ensuite, lavez avec 10 microlitres de cette solution trois fois. S’écouler dans 10 microlitres d’actine BRH contenant un tampon de motilité avec DTT à l’aide d’une pointe de pipette à grand alésage.

Et attendez une minute. Ensuite, lavez avec 10 microlitres de tampon de motilité avec DTT trois fois. Débit dans 30 microlitres de tampon final avec 10 nanomolaires myosine 5a.

Et chargez immédiatement sur le microscope à fluorescence à réflexion interne totale. Commencez l’enregistrement une fois que la mise au point optimale pour l’imagerie TIRF est trouvée. La purification de la myosine 2b non musculaire, des chaînes légères essentielles et des chaînes légères régulatrices, ainsi que de la myosine 5a et de la calmoduline a été évaluée en effectuant SDS-PAGE.

Le test de filament d’actine glissant montre les caractéristiques d’un film idéal et traçable présentant des mouvements lisses de filaments d’actine étiquetés. Le lavage à l’actine noire a permis de retirer les têtes de myosine mortes du champ de mesure, contribuant ainsi au mouvement global et lisse des filaments d’actine. Des images de sortie de suivi de filament du programme fast track ont été obtenues pour la myosine 2b et la myosine 5a non musculaires.

Un histogramme représentatif montre que la vitesse de glissement de l’Actomyosine 2b est de 77 nanomètres par seconde. Et celui d’Actomyosine 5a est de 515 nanomètres par seconde. En l’absence de méthylcellulose, les filaments d’actine ne restent pas aussi étroitement associés à la surface recouverte de myosine, ce qui provoque son flop près de la surface des glissements de couverture non musculaires recouverts de myosine 2b.

Le mouvement de la myosine a été observé sur des filaments d’actine fluorescents attachés à la surface à l’aide du test de motilité inversé. Il est important de cisailler l’actine non étiquetée avant de l’introduire dans la cellule d’écoulement pour le lavage de l’actine noire, ce qui permettra la translocation en douceur de l’actine. Des expériences supplémentaires peuvent étudier comment la motilité de la myosine est affectée par les mutations de la myosine, les protéines induisant la charge, la force ionique et les protéines régulatrices.

Diverses conditions cellulaires peuvent être reconstituées pour de futures études. Ces méthodes permettent d’examiner de manière biochimique et biophysique comment diverses isoformes de myosine varient dans leurs propriétés mobiles et mécaniques au niveau de la molécule unique et de l’ensemble.