Name: Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Découvrez la préparation rapide de grilles pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle. Cette méthode capture les états intermédiaires transitoires des réactions protéiques avec des délais de seulement 10 ms.

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Nous tenons à remercier Molly S.C. Gravett pour ses discussions utiles et le personnel de l’installation ABSL pour son aide à la collecte de données cryo-EM. David P. Klebl est doctorant dans le cadre du programme de doctorat de 4 ans du Wellcome Trust au Astbury Centre financé par l’Université de Leeds. Les microscopes FEI Titan Krios ont été financés par l’Université de Leeds (prix UoL ABSL) et Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Ce travail a été financé par une subvention du BBSRC à Stephen P. Muench (BB / P026397/1) et soutenu par des subventions de recherche à Howard D. White de l’American Heart Association (AMR21-236078) et Howard D. White et Vitold Galkin des National Institutes of Health des États-Unis (171261).

1. Préparation du système
Remarque : Le protocole suivant décrit comment préparer les grilles d’un seul échantillon. Habituellement, un minimum de 2 grilles de réplication sont préparées pour chaque échantillon ou condition. Pour des vitesses de plongée plus rapides (moins de ~ 20 ms de retard), 3 ou 4 grilles répliquées sont généralement préparées pour tenir compte d’un nombre réduit de zones de glace minces.
<ol><li>Diluer l’échantillon de protéines à la concentration cible dans le tampon souhaité. En règle générale, les concentrations finales ≥ 2 mg / mL fonctionnent bien pour la préparation de la grille avec le TED. Notez que l’échantillon peut être conservé sur la glace jusqu’à l’étape 10, à partir de l’étape 10, l’échantillon passera beaucoup de temps à température ambiante car il faut environ 20 minutes pour préparer 3-4 grilles.</li>
	<li>Activez le TED. Allumez ensuite le PC de contrôle et démarrez le logiciel de contrôle.</li>
	<li>Initialisez toutes les pompes à seringue en appuyant sur le bouton Initialiser (bouton noir inférieur) de chaque pompe à seringue.</li>
	<li>Allumez l’alimentation du potentiomètre, réglez-la sur 9 V et démarrez le logiciel de contrôle de l’oscilloscope.</li>
	<li>Assurez-vous que la soupape de régulation du cylindre N2est fermée. Ouvrez la soupape du cylindre. Ensuite, ouvrez lentement la vanne du régulateur en réglant la pression de sortie à la valeur souhaitée pour la pression du gaz de pulvérisation (généralement 1-2 bar). Pour les buses PDMS utilisées ici, n’utilisez pas de pressions supérieures à ~ 2,5 bar pour éviter d’endommager la buse. Le gaz qui s’écoule continuellement empêche le liquide de s’égouttre et de s’accumuler à l’extrémité de la buse, ce qui peut entraîner une pulvérisation irreproductible.</li>
	<li>Assurez-vous que toutes les vannes de la pompe à seringue sont en position de « charge ». Cela peut être fait en basculant toutes les vannes à la position « distribution » dans le logiciel de commande, puis en revenant à « charge ». Laissez toutes les vannes sur « charge ». Réglez toutes les seringues à zéro.</li>
	<li>Éliminez toutes les bulles d’air présentes dans le système à ce stade. Pour ce faire, les seringues devront peut-être être dévissées, les bulles enlevées manuellement et les seringues remontées lorsqu’elles ne contiennent plus de bulles.</li>
	<li>Les composants de manipulation des liquides sont généralement stockés dans H2O. Avant de charger la solution d’échantillon, équilibrez le système liquide avec un tampon en lavant le tube avec un excès de tampon. Utilisez un débit de liquide maximal approprié pour éviter la surpression sur la buse de pulvérisation. Des débits de liquide > 10 μL/s peuvent endommager les buses PDMS décrites ici.</li>
	<li>Placer un tube de 1,5 mL contenant ≥ tampon de 200 μL sur la seringue 1 (le dessus doit être percé pour se fixer au tube).<ol>
<li>Assurez-vous que la vanne 1 est en position de « charge ». Basculez dans le logiciel de contrôle, si nécessaire.</li>
		<li>Aspirer la quantité souhaitée (généralement 50-100 μL) de tampon avec la seringue 1, via le logiciel de contrôle.</li>
		<li>Basculez la vanne 1 en position « distribution », via le logiciel de commande.</li>
		<li>Distribuer tout le liquide dans la seringue 1, via le logiciel de contrôle.</li>
		<li>Soupape de retour pour « charger », réinitialiser la position de la seringue à « 0 » dans le programme et appuyer sur initialiser sur la seringue 1, pour préparer le système pour le cycle suivant. REMARQUE: Les étapes 1.9.1 à 1.9.5 sont généralement répétées trois fois pour assurer un lavage en profondeur du tube.</li>
	</ol></li>
	<li>Chargez les pinces à épilation avec une grille EM (aucune exigence pour un type spécifique) en desserrant la pince à bras plongeant, en plaçant la pince à épiler dans la pince et en resserrant la pince.</li>
	<li>Déplacez manuellement le bras plongeant de sorte que la grille et la buse soient à la même hauteur (position « application de l’échantillon »). Si la buse et la grille sont alignées, le liquide s’accumulera sur la grille après la pulvérisation pendant une période prolongée. Si nécessaire, ajustez la position de la buse.</li>
	<li>Ajustez la position de la tasse d’éthane liquide en déplaçant manuellement le bras plongeant avec une pince à épiler montée à sa position finale (atteignant la tasse d’éthane). Lorsqu’elle est correctement mise en place, une grille maintenue par la pince à épileuse atteindra approximativement le centre de la tasse d’éthane liquide.</li>
	<li>Vérifiez que le 'script d’exécution' utilisera les débits, volumes et minutages souhaités. Voir la section « La séquence d’exécution » ci-dessus pour plus de détails.</li>
	<li>Assurez-vous que rien n’obstrue le chemin du piston. Aspirer le volume de tampon nécessaire pour une seule course dans la seringue 1. Cela se fait dans le logiciel de contrôle, voir la section 'La séquence d’exécution' pour les paramètres et les volumes typiques. Ensuite, assurez-vous que la vanne 1 est commutée en position « distribution ». Effectuez une exécution de test en appuyant sur Exécuter le script dans le logiciel de contrôle. ATTENTION : Restez à l’écart du TED jusqu’à ce que la séquence d’exécution soit terminée. Les pièces mobiles pourraient causer des blessures!</li>
	<li>Lorsque la « séquence d’exécution » est terminée, réglez la pression sur le bras plongeant à la valeur souhaitée (généralement 1-2 bar). Ce n’est qu’alors que vous appuyez sur OK dans le logiciel de contrôle pour relâcher la pression du bras plongeant. Si la « séquence de course » ou la pression sur le bras plongeant doit être ajustée, ces réglages peuvent être modifiés à ce stade et les étapes 1.13 à 1.15 répétées.</li>
</ol>2. Préparation rapide de la grille
<ol><li>Remplissez d’abord le récipient d’éthane/azote liquide avec de l’azote liquide. Lorsqu’elle est suffisamment froide et exempte d’azote liquide, remplissez la tasse d’éthane liquide. Éviter la solidification de l’éthane liquide. Cette étape est la même que pour la préparation conventionnelle du réseau. REMARQUE : Pour minimiser la contamination par l’éthane, assurez-vous que les étapes 2.2 à 2.13 sont effectuées le plus rapidement possible. ATTENTION : L’éthane liquide est un cryogène et inflammable. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation.</li>
	<li>Préparez des grilles cryo-EM pour la décharge incandescente. Nous utilisons généralement des grilles de carbone troué et une décharge incandescente pendant 90 s, à une pression d’air de 0,1 mbar et à 10 mA. Habituellement, pas plus de 4 grilles sont déchargées à la fois. Les grilles sont utilisées dans les 30 minutes suivant la décharge de lueur.</li>
	<li>Équilibrez le tube avec l’échantillon (en suivant les étapes 1.9.1 à 1.9.5, en utilisant l’échantillon au lieu du tampon). Si le volume d’échantillon disponible est faible, le tube peut être équilibré avec seulement 1 volume mort.</li>
	<li>Aspirer la quantité d’échantillon nécessaire pour une seule course dans la seringue 1 dans le logiciel de contrôle (voir la section « La séquence d’exécution » pour plus de détails). Ensuite, basculez la vanne 1 à la position « distributeur ».</li>
	<li>Vérifiez que l’humidité relative a atteint la valeur souhaitée (nous préparons généralement des grilles à 60 % d’humidité relative ou plus). Une fois que ≥ 60 % d’humidité est atteinte, n’ouvrez la chambre d’humidité que pendant un temps minimal, afin de maintenir une humidité élevée.</li>
	<li>Placez la pince à épiler, en tenant une grille luminescente, dans le piston pneumatique et fixez-les. Déplacez le piston jusqu’à sa position de départ (en haut).</li>
	<li>Assurez-vous que le curseur du potentiomètre est en position de départ, prêt pour la mesure, en le déplaçant manuellement pour entrer en contact avec le piston. Réglez la gâchette de l’oscilloscope dans le logiciel de l’oscilloscope.</li>
	<li>Placez le récipient liquide éthane/azote.</li>
	<li>Appuyez sur Exécuter le script dans le logiciel de contrôle. Lorsque vous y êtes invité, cliquez sur OK dans le logiciel de contrôle pour démarrer l’exécution. ATTENTION : Restez à l’écart du TED jusqu’à ce que la séquence d’exécution soit terminée. Les pièces mobiles pourraient causer des blessures!</li>
	<li>Une fois la séquence de course terminée, relâchez la pression sur le piston pneumatique en cliquant sur OK dans le logiciel de contrôle.</li>
	<li>Ouvrez la chambre d’humidité, desserrez la connexion entre le bras plongeant et la pince à épiler d’une main tout en sécurisant la pince à épile de l’autre. Lorsque la pince à épilez est libre, déplacez le bras plongeant vers le haut tout en gardant la grille dans l’éthane liquide. Transférez ensuite la grille dans son espace de stockage dans le liquide environnantN2. Après la congélation, la grille doit être maintenue à la température du liquide N2 en tout temps.</li>
	<li>Enregistrez la mesure de l’oscilloscope. Réinitialisez manuellement la position du curseur du potentiomètre et du piston par la suite.</li>
	<li>Répétez les étapes 2.4 à 2.12 pour préparer les grilles de réplication</li>
	<li>Transférez les grilles dans un stockage à long terme jusqu’à l’écrêtage de la grille et la collecte de données.</li>
	<li>Lavez le système avec un tampon, conformément aux étapes 1.9.1 - 1.9.5. Ensuite, lavez le système avec H2O, conformément aux étapes 1.9.1 - 1.9.5.</li>
	<li>Éteignez le régulateur principal d’azote gazeux et coupez l’alimentation.</li>
	<li>Placez le récipient d’éthane/azote dans une hotte pour le laisser se réchauffer et laisser l’éthane liquide et leN2 s’évaporer.</li>
</ol>3. Cryo-EM à résolution temporelle
REMARQUE: Lorsque des expériences résolues dans le temps sont menées avec le TED, il y a d’autres aspects à prendre en compte, bien que la configuration de base et les variables restent les mêmes. On suppose ici que deux solutions sont mélangées dans un rapport de 1:1 (v/v) pour produire le mélange final qui se dépose sur la grille. Suivez le protocole décrit dans '1. Préparation rapide de la grille avec le TED', avec les changements suivants:
<ol><li>Utilisez des concentrations de stock plus élevées pour les expériences de mélange que pour les expériences de pulvérisation simples. Le mélange dans un rapport de 1:1 (v/v) entraînera une dilution 2x de chaque composant.</li>
	<li>Pour une expérience de mélange rapide, utilisez les trois seringues plutôt qu’une seule.<ol>
<li>Fixez le tube aux pompes à seringues 2-3.</li>
		<li>Fixez les tubes des pompes à seringue 2-3 à la buse de pulvérisation.</li>
		<li>Équilibrez les trois seringues dans un tampon et échantillonnez séparément. En règle générale, la seringue 1 est remplie de l’échantillon A et les seringues 2 à 3 sont remplies de l’échantillon B(figure 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Modifiez la séquence d’exécution. Un exemple de séquence d’exécution utilisant les 3 seringues pour une expérience de mélange rapide est donné à la figure 6. Voir aussi la section 'La séquence d’exécution' pour plus de détails.</li>
	<li>Différents délais peuvent être obtenus de deux manières:<ol>
<li>Modifiez la vitesse du piston. En ajustant la vitesse du piston, le délai peut être modifié dans une plage relativement étroite. Par exemple, avec une distance de pulvérisation/éthane de 2 cm, le piston peut être déplacé à 1 m/s ou 2 m/s pour donner un délai de 20 ms ou 10 ms, respectivement. Ceci est fait comme décrit à l’étape 1.15.</li>
		<li>Modifiez la position de pulvérisation/éthane en ajustant la position (verticale) de la buse de pulvérisation. Si la buse est positionnée à une distance de 5 cm de la surface de l’éthane, par exemple, une vitesse de plongée de 1 m/s donne un délai de 50 ms. L’obtention de délais beaucoup plus longs nécessite d’autres modifications de la configuration. REMARQUE: En raison de l’écoulement laminaire dans la région de focalisation de l’écoulement de la buse, nous ne nous attendons pas à un mélange important dans cette partie de la buse. Au lieu de cela, nous nous attendons à ce que le mélange se produise pendant la génération de pulvérisation, dans les gouttelettes en route vers le réseau et pendant l’épandage de gouttelettes sur le réseau. Le temps de vol pour que les gouttelettes de pulvérisation atteignent la grille est estimé ≤ 1 ms (pour une vitesse de gouttelette de ≥ 10 m/s et une distance buse-grille de 1 cm). Ainsi, seul le temps entre l’atterrissage des gouttelettes et la vitrification est considéré comme le « délai ».</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids%3A+from+sprays+to+jets+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li>
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</ol>

Les protocoles de ce travail peuvent être utilisés pour une préparation rapide de la grille par pulvérisation directe et expériences TrEM. La préparation rapide de la grille peut être utilisée pour réduire les interactions des particules avec l’interface air-eau5. Les principales limites sont la concentration d’échantillon disponible et l’épaisseur de glace sur la grille. Dans ces limites et à condition que la qualité de l’échantillon soit bonne, le protocole produit des grilles adaptées à la cryo...

Arrière-plan Les développements récents en cryo-microscopie électronique (cryo-EM) ont permis des études structurelles de systèmes de plus en plus complexes à haute résolution. À quelques exceptions près, ces études ont été limitées à des macromolécules biologiques à l’équilibre1 ou à des réactions relativement lentes2. De nombreux processus in vivo se produisent sur une échelle de temps plus rapide (millisecondes) et il y a un intérêt croissant pour la cryo-EM résolue dans le temps (TrEM) sur ces échelles de temps3. Cependant, la préparation conventionnelle des échantillons cryo-EM par la méthode de buvardage est trop lente pour la milliseconde TrEM.
La méthode de transfert a d’autres limitations que la mauvaise résolution du temps. Les protéines et les complexes protéiques peuvent souffrir de dénaturation ou d’orientation préférée sur les grilles4. Il a été démontré que la réduction du temps d’exposition à l’interface air-eau pendant la préparation de l’échantillon atténue l’orientation préférée et la dénaturation des protéines5,6. Ainsi, la préparation rapide du réseau permet non seulement une trEM milliseconde, mais peut également améliorer la qualité du réseau.
Actuellement, il existe trois approches différentes pour la préparation automatisée du réseau. La première approche utilise une épingle ou un capillaire qui contient une petite quantité d’échantillon. Après avoir établi le contact entre le liquide et la surface de la grille, l’échantillon est « écrit » sur la grille7,8. Le processus d’application de l’exemple est relativement lent et prend quelques secondes. Une approche alternative utilise la génération contrôlée de gouttelettes par un distributeur piézoélectrique et des grilles à mèche automatique9. Cela permet une distribution plus rapide pour geler les temps, mais est toujours limité par la vitesse des gouttelettes et de l’évacuation (atteignant actuellement 54 ms). L’approche la plus rapide jusqu’à présent est l’approche par pulvérisation directe, dans laquelle l’échantillon est atomisé dans une buse de pulvérisation et les petites gouttelettes (~ 10 - 20 μm) et rapides (&gt; 5 m / s) se propagent au contact de la grille cryo-EM. La pulvérisation d’échantillon peut être générée par différentes méthodes telles que des atomiseurs de souffle d’air, des ondes acoustiques de surface ou des humidificateurs à ultrasons10,11,12,13. D’après notre expérience, l’épaisseur de la glace avec l’approche de pulvérisation directe est plus grande, mais la pulvérisation directe permet aux distributeurs de geler des temps &lt; 10 ms.
Ce protocole décrit étape par étape comment un dispositif EM à résolution temporelle (TED) équipé d’une buse de pulvérisation microfluidique peut être utilisé pour préparer des grilles sur une échelle de temps rapide14,15. L’appareil a été utilisé pour préparer des grilles avec un délai minimum de 6 ms entre l’application de l’échantillon et la congélation et pour mélanger et congeler rapidement deux échantillons. La conception du TED est basée sur une version précédente16 et est similaire à d’autres dispositifs cryo-EM à résolution temporelle basés sur la pulvérisation17.
Tout d’abord, les quatre parties principales de la configuration TED sont décrites. Le cœur du TED est l’unité de manipulation des liquides, qui est responsable de l’aspiration et de la distribution des échantillons. Un piston pneumatique déplace la grille à travers la pulvérisation dans l’éthane liquide. La génération du spray est réalisée avec des buses de pulvérisation microfluidiques et la congélation est effectuée dans un récipient d’éthane liquide, qui sont décrits brièvement. Enfin, les fonctionnalités supplémentaires pour contrôler l’environnement du réseau, en particulier l’humidité, sont mises en évidence. Ceci est suivi de protocoles détaillés pour le fonctionnement de l’appareil et pour la réalisation d’expériences TrEM. Des résultats représentatifs sont donnés pour une préparation rapide de la grille et une expérience TrEM simple.
Configuration expérimentale
L’unité de manutention des liquides Le système de traitement des liquides du TED est formé de trois pompes d’entraînement à seringue (« pompes 1 à 3 »), chacune équipée d’une vanne rotative(Figure 1). Une alimentation fournit des pompes 1 - 3 avec 24 V DC. La communication avec le logiciel de contrôle (écrit en Visual Basic et C++) se fait via une interface RS232 pour pomper 1. Les commandes sont distribuées via les ports d’extension d’E/S série de la pompe 1 à la pompe 2-3. Les pompes 1-3 sont équipées de seringues en verre (« seringues 1-3 », nous utilisons ici des seringues de 250 μL / zéro volume mort). Chaque vanne a deux positions, « charger » et « distribuer ». La position de « charge » est utilisée pour aspirer l’échantillon dans la seringue. Une pièce courte (~ 3 - 4 cm) de 1/16 » O.D., 0.01′′ I.D. FeP tube est connectée via des raccords sans bride ETFE / ETFE à la position de « charge » des vannes 1-3. Ce court morceau de tube atteint le réservoir d’échantillon (généralement un tube en plastique de 1,5 mL ou 0,5 mL). La position « distribuer » conduit à la buse de pulvérisation. La connexion entre la sortie de distribution et la buse de pulvérisation est réalisée par des tubes en PE (~ 20-30 cm de longueur, 0,043 « O.D., 0,015 » I.D.), avec un court morceau de tube à manchon (~ 0,5 cm) et des raccords sans bride ETFE / ETFE.
Le piston pneumatique Le TED utilise un piston pneumatique pour accélérer la grille et la déplacer à travers le spray d’échantillon dans le récipient d’éthane liquide. Des pinces à pression négative maintiennent la grille, vissée dans un support construit à la maison qui est monté sur un cylindre pneumatique à double tige(Figure 2A).
La pression est fournie par une grande bouteille d’azote gazeux (taille W), équipée d’un régulateur à plusieurs étages (0 - 10 bar, « pression principale »). Un tube flexible en PVC renforcé (12 mm O.D.) relie le régulateur à un collecteur à 12 ports où l’azote sous pression est livré à la buse et au piston pneumatique. Le débit de gaz à travers la buse est constant, régulé directement au niveau de la bouteille d’azote (pression principale). La connexion à la buse est faite avec un tube en PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), un court morceau de tube PE (~ 8 cm de longueur, 0,043"O.D., 0,015 » I.D.) et des connecteurs appropriés. La pression sur le piston pneumatique est contrôlée par une électrovanne. Des tubes en PU (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) relient l’électrovanne à un régulateur et au piston pneumatique, pour permettre une pression de plongée réduite (≤ pression principale). L’électrovanne est contrôlée par ordinateur. Une vue d’ensemble schématique de la configuration est donnée à la figure 2B.
Notez qu’avec cette configuration, la pression de plongée est toujours égale ou inférieure à la pression du gaz de pulvérisation (pression principale). Cependant, la configuration peut facilement être modifiée en incorporant un deuxième régulateur en amont de la buse de pulvérisation pour permettre des vitesses de plongée plus élevées à faible pression de gaz de pulvérisation. Des pressions élevées (&gt;&gt; 2 bar) peuvent endommager la buse de pulvérisation PDMS.
ATTENTION: Il s’agit d’un système pressurisé et la « pression principale » doit toujours être &lt; 7 bars.
Des pressions comprises entre 0,5 et 2 bars sont généralement utilisées pour le piston pneumatique et montrent une relation approximativement linéaire entre la pression et la vitesse (à la position verticale de la pulvérisation). Les vitesses de plongée sont mesurées à l’avec un oscilloscope, connecté en ligne avec un potentiomètre à glissière (10 kΩ) et en parallèle avec une résistance de 2 kΩ(Figure 2C). Une alimentation fournit le potentiomètre avec 9 V DC. Alors que la vitesse de plongée approximative est réglée avant l’expérience en réglant la pression de plongée, le potentiomètre donne une lecture précise de la vitesse après l’expérience.
Buses de pulvérisation et récipient d’éthane liquide La fabrication et le fonctionnement de buses virtuelles dynamiques au gaz pour la distribution d’échantillons par pulvérisation ont été décrits ailleurs en détail15. Comme décrit ci-dessus, les sorties de distribution des vannes 1 à 3 sont connectées aux entrées de liquide de la buse (Figure 3A). Le gaz de pulvérisation sous pression est connecté à l’entrée de gaz de la buse. Les entrées dans les buses de pulvérisation PDMS sont telles que les tubes en PE O.D. de 0,043 " peuvent être utilisés directement sans avoir besoin de raccords. Notre conception de buse contient une géométrie « jet-in-jet » pour le mélange de deux échantillons, similaire au dispositif décrit à la réf.18. Un schéma de la conception est montré à la figure 3B, une image microscopique d’une buse est montrée à la figure 3C. La disposition du dispositif microfluidique nécessite l’utilisation de trois seringues pour mélanger deux échantillons. La buse de pulvérisation est généralement positionnée à une distance de 1 à 1,5 cm de la grille (pendant l’application de l’échantillon).
Nous utilisons de l’éthane liquide comme cryogène, dans un récipient liquide éthane/azote tel qu’utilisé pour la méthode de buvard standard. Le positionnement vertical de la tasse d’éthane liquide est réalisé avec une plate-forme élévatrice de laboratoire.
Contrôle de l’environnement de pulvérisation et de grille Le piston et la buse de pulvérisation sont contenus dans une boîte en PMMA (verre acrylique) construite sur mesure avec une double porte(Figure 4A). Une humidité relative élevée à l’intérieur de la boîte est obtenue par un système d’humidification de l’air à l’arrière du TED(Figure 4B). L’air est fourni par une pompe et introduit dans un premier bidon de 10 pouces (généralement utilisé pour la purification de l’eau sous l’évier). Le bidon est rempli d’un niveau d’eau bas (~ 5-10 cm) et abrite également un humidificateur. L’alimentation secteur de l’humidificateur est contrôlée par un régulateur numérique d’humidité / température et un capteur d’humidité / température situé à l’intérieur de la boîte en verre acrylique. Le contrôleur est réglé pour éteindre la pompe lorsque l’humidité relative atteint ≥ 90 %. L’air humidifié du premier bidon est pompé à travers un diffuseur, immergé dans l’eau dans un deuxième bidon de 10 pouces, puis pénètre dans la boîte en verre acrylique.
ATTENTION : Étant donné que l’échantillon est aérosolisé dans la buse de pulvérisation, les échantillons biologiques ou chimiques dangereux ne conviennent pas comme échantillons.
La séquence d’exécution Le bouton Exécuter le script du logiciel de contrôle lance la séquence d’exécution. Cette séquence de commandes peut être prédéfinie dans un fichier de script et modifiée via le logiciel. Les variables les plus importantes sont expliquées ici :
Vitesse de pulvérisation: La vitesse de pulvérisation détermine le débit de liquide utilisé par la pompe à seringue. Le débit peut être calculé comme suit: Les moteurs de pompe à seringue utilisés ici ont une taille de pas fixe. La gamme complète de la pompe est divisée en 48 000 marches. Le deuxième facteur important est le volume de la seringue. Nous utilisons généralement des seringues de 250 μL. La vitesse de pulvérisation dans le logiciel de contrôle est définie comme nombre de pas/seconde. Une vitesse de pulvérisation de 1000 pas/seconde correspond à :
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
Volume de pulvérisation: Le volume de pulvérisation détermine le volume total à pulvériser. Ainsi, il détermine également la durée de la pulvérisation. Le volume de pulvérisation dans le logiciel de contrôle est défini en plusieurs étapes. Un volume de pulvérisation de 2000 pas, à une vitesse de pulvérisation de 1000 pas/seconde, conduit à une durée de pulvérisation de 2 s et un volume total de 10,4 μL.
Temps de pré-pulvérisation : Cette variable définit le temps entre le début de la pulvérisation et la plongée. Il est important de choisir le temps de retard de manière à ce que le spray ait suffisamment de temps pour se stabiliser avant de plonger dans la grille. Habituellement, le spray est donné 1,5 - 4 s pour se stabiliser avant que la grille ne soit plongée. Le spray est maintenu jusqu’à ce que la grille se soit déplacée. Habituellement, l’écoulement du liquide (et donc la pulvérisation) est arrêté 0,5 à 1 s après la plongée de la grille. En utilisant une vitesse de pulvérisation de 1000 pas / s et un volume de pulvérisation de 2000 pas, un temps de pré-pulvérisation typique est de 1,5 s, par exemple.
Une séquence exemplaire de commandes est illustrée à la figure 5A,la position de la grille dans le temps est illustrée à la figure 5B.

<table><tbody><tr><td><appareil résolu >en temps</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>boîte en verre acrylique</td><td>USA scientific</td><td></td><td></td>contrôleur</tr><tr><td>d’humidité/température</td><td>THE20 contrôleur numérique d’humidité/température</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cylindre pneumatique à</td><td>double tige cylindre pneumatique à double tige TN 10x70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEP tubing</td><td>Upchurch Scientific 1/16" O.D., 0.01'' Tube</td><td></td><td></td>FEP I.D.</tr><tr><td>Raccords sans bride</td><td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE Tubes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>flexibles en PVC renforcé</td><td>12 mm OD. flexible en PVC renforcé Seringues</td><td></td><td></td></tr><tr><td>en verre</td><td>Kloehn 250 &micro ; L pompe d’humidification à volume</td><td></td><td></td>mort zéro</tr><tr><td></td><td>Interpret Aqua Air AP3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>récipient d’éthane liquide de Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Régulateur</td><td></td><td></td><td>multi-étagé GASARC classe 3</td></tr><tr><td>pince à épiler à pression négative</td><td>Dumont N5 Inox B pince à épiler</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>à pression négativeoscilloscope</td><td>Hantek 6022BE oscilloscope</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE tube Scientific</td><td>Commodities Inc. 0.043" D.E., 0,015" Alimentation en</td><td></td><td></td>tube I.D. PE</tr><tr><td></td><td>Mean Well GSM160A24-R7B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alimentation</td> en <td>KPS305D</td><td></td><td></td>Wanptek</tr><tr><td>Tube en PU</td><td>SMC TU0425 4 mm de diamètre extérieur, 2,5 mm de diamètre intérieur Régulateur de</td><td></td><td></td>tube en PU</tr><tr><td></td><td>Norgren R72G-2GK-RMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potentiomètre</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr>à glissière PS100<td>électrovanne</td><td>SMC NVJ314M électrovanne</td><td></td><td></td></tr> pompes <tr><td>d’entraînement de seringue</td><td>Kloehn V6 48K modèle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réactifs & Matériaux</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apoferritin de la rate équine</td><td>Sigma-Aldrich, A3660</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, A2383</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryo-EM grids</td><td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-actine</td><td>Fourni par H.D. White (pour la procédure de préparation, voir réf. 1)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>déchargeuse de phosphoresse</td><td>Cressington 208 enduction carbone avec unité</td><td></td><td></td>de décharge luminescente</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, H7006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich, P1190</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, M8266</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich, M1254</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, S9888</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myosine musculaire squelettique S1</td><td>Fourni par H.D. White (pour la procédure de préparation, voir réf. 2)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réf. 1</td><td>Spudich, J. A. & Watt, S. La régulation de la contraction du muscle squelettique du lapin I. Études biochimiques de l’interaction du complexe tropomyosine-troponine avec l’actine et les fragments protéolytiques de la myosine. Journal de chimie biologique 246, 4866-4871 (1971).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Réf 2</td><td>Blanc, H. & Taylor, E. Energie et mécanisme de l’actomyosine adénosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Le domaine de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM) se développe rapidement avec de nouveaux équipements et algorithmes de traitement, produisant des structures à plus haute résolution et des informations sur des systèmes plus difficiles. La préparation des échantillons pour le cryo-EM connaît une révolution similaire avec de nouvelles approches en cours de développement pour remplacer les systèmes de transfert traditionnels. Il s’agit notamment de l’utilisation de distributeurs piézo-électriques, de l’impression d’épingles et de la pulvérisation directe. À la suite de ces développements, la vitesse de préparation de la grille passe de quelques secondes à quelques millisecondes, offrant de nouvelles opportunités, en particulier dans le domaine de la cryo-EM à résolution temporelle où les protéines et les substrats peuvent être rapidement mélangés avant la congélation en plongée, piégeant les états intermédiaires de courte durée. Nous décrivons ici, en détail, un protocole standard pour la fabrication de grilles sur notre dispositif EM interne à résolution temporelle à la fois pour la préparation rapide standard de la grille et également pour les expériences résolues dans le temps. Le protocole exige un échantillon d’environ 50 μL à des concentrations de ≥ 2 mg/mL pour la préparation de 4 grilles. Le délai entre l’application de l’échantillon et la congélation peut être aussi bas que 10 ms. L’une des limites est l’augmentation de l’épaisseur de la glace à des vitesses plus rapides et par rapport à la méthode de buvardage. Nous espérons que ce protocole aidera d’autres personnes à concevoir leurs propres dispositifs de fabrication de grilles et ceux qui s’intéressent à la conception d’expériences résolues dans le temps.

Préparation rapide de la grille avec le TED En tant qu’échantillon d’essai pour la préparation rapide de la grille, nous avons utilisé l’apoferritine de la rate équine à 20 μM dans 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Une reconstruction à une résolution de 3,5 Å a été obtenue à partir de 690 micrographies comme décrit à la réf.15 (Figure 7A). La plage de mise au point a été choisie de manière à ce que les particules puissent être facilement identifiée...

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’utilisation d’un dispositif de fabrication de grille rapide pour la fabrication rapide de grilles et pour le mélange et la congélation rapides afin de mener des expériences résolues dans le temps.

Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Bonjour, et bienvenue dans cette vidéo JoVE. Nous voulons vous présenter la configuration que nous avons ici pour la création rapide d’un réseau, une étude résolue dans le temps que nous développons à Leeds. Sachez qu’il ne s’agit pas d’un système standard, mais nous espérons qu’en vous donnant un compte rendu détaillé de toutes les choses et des paramètres que nous faisons, vous serez en mesure de développer des systèmes similaires dans vos propres laboratoires.Une description détaillée de l’appareil est donnée dans le protocole Richmond. Ici, nous allons donner un guide étape par étape pour une préparation rapide du réseau et des EM résolus dans le temps. D’après notre expérience, la concentration en protéines devrait être de deux milligrammes par millilitre ou plus. Le protocole nécessite un volume minimum d’environ 50 microlitres.Allumez l’appareil. Allumez ensuite le PC de contrôle et démarrez le logiciel de contrôle. Initialisez toutes les pompes à seringue en appuyant sur le bouton d’initialisation de chaque pompe à seringue.Allumez l’alimentation du potentiomètre, réglez-la sur neuf volts et démarrez le logiciel de contrôle de l’oscilloscope. L’azote gazeux sous pression est nécessaire pour générer la pulvérisation. Ouvrez le cylindre d’azote et réglez la pression à 2 bar.Assurez-vous que toutes les vannes de la pompe à seringue sont en position de charge. Pour ce faire, changez toutes les vannes pour distribuer dans le logiciel de contrôle, puis revenez à la charge. Réglez toutes les seringues à zéro.Toutes les bulles d’air présentes dans le système doivent être éliminées à ce stade. Pour ce faire, les seringues devront peut-être être dévissées, les bulles enlevées manuellement et les seringues remontées lorsqu’elles ne contiennent plus de bulles. Le système de manipulation des liquides est généralement stocké dans l’eau.Avant de charger l’échantillon, le système est équilibré avec un tampon. Cela se fait en lavant le tube avec un excès de tampon. Placez un tube contenant au moins 200 microlitres de tampon sur la seringue un.Le haut du tube doit être percé pour le fixer. Aspirer une quantité appropriée de tampon, entre 50 et une centaine de microlitres avec la seringue un à l’aide du logiciel de contrôle. Interrupteur vanne un pour distribuer.Distribuer tout le liquide dans une seringue. Retour du clapet un à la position de charge, et appuyez sur le bouton d’initialisation de la seringue un pour préparer le système pour le prochain cycle de lavage. Ces étapes sont généralement répétées trois fois pour assurer un lavage en profondeur du tube.Ensuite, la buse de pulvérisation est positionnée. Placez une grille EM dans le bras plongeant. Placez la grille devant la buse de pulvérisation.Distribuez le tampon à l’aide du logiciel de contrôle. Si la buse et la grille sont alignées, le liquide devrait s’accumuler après la pulvérisation pendant une période prolongée. Si nécessaire, ajustez la position de la buse, puis vérifiez à nouveau où le liquide s’accumule sur la grille.Ensuite, ajustez la position de la tasse d’éthane. La pointe de la pince à épiler devrait atteindre approximativement le centre de la coupe d’éthane. Effectuez une série de tests pour vous assurer que tous les paramètres sont corrects.Fermez la chambre d’humidité. Assurez-vous que le chemin du piston est dégagé. Aspirer le volume de tampon requis pour une seule course dans une seringue.Interrupteur vanne un pour distribuer. Démarrez l’exécution en appuyant sur run’in le logiciel de contrôle. Vérifiez que la pompe à seringue une est en mouvement, deux secondes dans ce cas, et la grille est plongée après un délai approprié, 1,5 seconde ici.Lorsque la course est terminée, réglez la pression sur le bras du piston à la valeur souhaitée. Appuyez sur OK’in le logiciel de contrôle pour relâcher la pression du bras plongeant. Maintenant, la tasse d’éthane est fraîche et remplie d’éthane liquide.Déchargez les grilles avant utilisation. Une décharge lumineuse typique est de 90 secondes à 10 milliampères dans 0,1 millibar d’air. Le tube est ensuite équilibré avec l’échantillon.Si le volume d’échantillon disponible est faible, le tube peut être équilibré avec un seul volume mort. Aspirer l’échantillon. Généralement, le volume mort est d’environ 30 microlitres.Interrupteur vanne un pour distribuer. Distribuer l’échantillon à travers le tube et la buse. Ensuite, aspirez la quantité d’échantillon requise pour une seule exécution.Interrupteur vanne un pour distribuer. Vérifiez que l’humidité relative a atteint la valeur souhaitée. Nous préparons généralement des grilles à 60% ou plus.Cela peut prendre quelques minutes. Placez la pince à épiler tenant une grille luminescente dans le bras plongeant. Placez la glissière du potentiomètre en position de départ, prête pour la mesure de la vitesse.Réglez le déclencheur de la mesure de vitesse dans le logiciel de l’oscilloscope. Placez la tasse d’éthane liquide et près de la chambre d’humidité. Assurez-vous que le chemin du piston est dégagé.Démarrez l’exécution dans le logiciel de contrôle. Une fois l’exécution terminée, appuyez sur OK’in dans le logiciel de contrôle pour relâcher la pression du bras plongeant. Ouvrez la chambre d’humidité, desserrez la connexion entre le bras plongeant et la pince à épiler.Déplacez-vous vers le haut du bras plongeant tout en gardant la grille en éthane liquide. Ensuite, transférez les grilles à l’azote liquide et dans le stockage. Enregistrez la mesure de l’oscilloscope.Réinitialisez manuellement la position du curseur et du piston du potentiomètre. Répétez le protocole pour préparer les grilles de réplication. Les expériences résolues dans le temps sont faites de la même manière.Des concentrations de stock plus élevées sont nécessaires pour les expériences résolues dans le temps en raison de la dilution dans l’étape de mélange. Pour une expérience résolue dans le temps, utilisez les trois seringues. Le tube est fixé aux pompes à seringue et à la buse de pulvérisation.La buse de pulvérisation microfluidique utilisée ici contient également un élément de mélange. Notez que les tubes plus longs donneront un volume mort plus important et que les étapes d’équilibrage du lavage nécessitent plus de tampon et d’échantillon. Équilibrez toutes les seringues avec un tampon et échantillonnez séparément.En règle générale, la seringue un est utilisée pour l’échantillon A et les seringues deux et trois sont utilisées pour l’échantillon B’Une fois que le tube est équilibré, chargez l’échantillon A dans la seringue un et l’échantillon B dans les seringues deux et trois. Ensuite, changez les vannes une à trois pour distribuer. Démarrez l’exécution dans le logiciel de contrôle.Notez qu’un script d’exécution différent est nécessaire pour une expérience à résolution temporelle. Différents délais peuvent être obtenus de deux manières. En ajustant la vitesse du piston, le délai entre le mélange et la congélation peut être modifié.Une vitesse de plongée plus rapide entraînera un délai plus court. Alternativement, la distance de pulvérisation d’éthane est modifiée en ajustant la position verticale de la buse de pulvérisation. L’augmentation de la distance entraînera un délai plus long.Dans le microscope électronique à faible grossissement, une grille typique ressemble à ceci. Les zones de glace mince, comme indiqué, conviennent à l’acquisition de données. À des grossissements plus élevés, les particules doivent être clairement visibles.Avec un spécimen d’essai tel que l’apoferritine, un ensemble de données relativement petit à partir d’une seule grille est suffisant pour une reconstruction à une résolution de trois à quatre angströms. Pour les expériences résolues dans le temps, nous collectons des ensembles de données à partir de différents points temporels ou grilles. Il est utile de combiner les données pour la classification 3D, puis de retracer les particules jusqu’à leurs points temporels.De cette façon, les données peuvent fournir des informations structurelles et des informations sur la cinétique de réaction. En conclusion, nous espérons que vous avez apprécié la vidéo. Nous espérons qu’avec les descriptions détaillées dans l’article JoVE avec la vidéo, vous serez en mesure de mener vos propres expériences via la fabrication rapide de grilles, ce qui a été montré pour atténuer certains des problèmes de mutation ou pour aider aux interactions à l’interface air-eau, tout ce dont vous avez besoin pour mener vos propres études résolues dans le temps pour essayer de piéger certains de ces états non équilibrés.Donc, bonne fabrication de grille.

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