Préparation rapide de la grille pour la cryo-microscopie électronique à résolution temporelle

Bonjour, et bienvenue dans cette vidéo JoVE. Nous voulons vous présenter la configuration que nous avons ici pour la création rapide d’un réseau, une étude résolue dans le temps que nous développons à Leeds. Sachez qu’il ne s’agit pas d’un système standard, mais nous espérons qu’en vous donnant un compte rendu détaillé de toutes les choses et des paramètres que nous faisons, vous serez en mesure de développer des systèmes similaires dans vos propres laboratoires.

Une description détaillée de l’appareil est donnée dans le protocole Richmond. Ici, nous allons donner un guide étape par étape pour une préparation rapide du réseau et des EM résolus dans le temps. D’après notre expérience, la concentration en protéines devrait être de deux milligrammes par millilitre ou plus. Le protocole nécessite un volume minimum d’environ 50 microlitres.

Allumez l’appareil. Allumez ensuite le PC de contrôle et démarrez le logiciel de contrôle. Initialisez toutes les pompes à seringue en appuyant sur le bouton d’initialisation de chaque pompe à seringue.

Allumez l’alimentation du potentiomètre, réglez-la sur neuf volts et démarrez le logiciel de contrôle de l’oscilloscope. L’azote gazeux sous pression est nécessaire pour générer la pulvérisation. Ouvrez le cylindre d’azote et réglez la pression à 2 bar.

Assurez-vous que toutes les vannes de la pompe à seringue sont en position de charge. Pour ce faire, changez toutes les vannes pour distribuer dans le logiciel de contrôle, puis revenez à la charge. Réglez toutes les seringues à zéro.

Toutes les bulles d’air présentes dans le système doivent être éliminées à ce stade. Pour ce faire, les seringues devront peut-être être dévissées, les bulles enlevées manuellement et les seringues remontées lorsqu’elles ne contiennent plus de bulles. Le système de manipulation des liquides est généralement stocké dans l’eau.

Avant de charger l’échantillon, le système est équilibré avec un tampon. Cela se fait en lavant le tube avec un excès de tampon. Placez un tube contenant au moins 200 microlitres de tampon sur la seringue un.

Le haut du tube doit être percé pour le fixer. Aspirer une quantité appropriée de tampon, entre 50 et une centaine de microlitres avec la seringue un à l’aide du logiciel de contrôle. Interrupteur vanne un pour distribuer.

Distribuer tout le liquide dans une seringue. Retour du clapet un à la position de charge, et appuyez sur le bouton d’initialisation de la seringue un pour préparer le système pour le prochain cycle de lavage. Ces étapes sont généralement répétées trois fois pour assurer un lavage en profondeur du tube.

Ensuite, la buse de pulvérisation est positionnée. Placez une grille EM dans le bras plongeant. Placez la grille devant la buse de pulvérisation.

Distribuez le tampon à l’aide du logiciel de contrôle. Si la buse et la grille sont alignées, le liquide devrait s’accumuler après la pulvérisation pendant une période prolongée. Si nécessaire, ajustez la position de la buse, puis vérifiez à nouveau où le liquide s’accumule sur la grille.

Ensuite, ajustez la position de la tasse d’éthane. La pointe de la pince à épiler devrait atteindre approximativement le centre de la coupe d’éthane. Effectuez une série de tests pour vous assurer que tous les paramètres sont corrects.

Fermez la chambre d’humidité. Assurez-vous que le chemin du piston est dégagé. Aspirer le volume de tampon requis pour une seule course dans une seringue.

Interrupteur vanne un pour distribuer. Démarrez l’exécution en appuyant sur run’in le logiciel de contrôle. Vérifiez que la pompe à seringue une est en mouvement, deux secondes dans ce cas, et la grille est plongée après un délai approprié, 1,5 seconde ici.

Lorsque la course est terminée, réglez la pression sur le bras du piston à la valeur souhaitée. Appuyez sur OK’in le logiciel de contrôle pour relâcher la pression du bras plongeant. Maintenant, la tasse d’éthane est fraîche et remplie d’éthane liquide.

Déchargez les grilles avant utilisation. Une décharge lumineuse typique est de 90 secondes à 10 milliampères dans 0,1 millibar d’air. Le tube est ensuite équilibré avec l’échantillon.

Si le volume d’échantillon disponible est faible, le tube peut être équilibré avec un seul volume mort. Aspirer l’échantillon. Généralement, le volume mort est d’environ 30 microlitres.

Interrupteur vanne un pour distribuer. Distribuer l’échantillon à travers le tube et la buse. Ensuite, aspirez la quantité d’échantillon requise pour une seule exécution.

Interrupteur vanne un pour distribuer. Vérifiez que l’humidité relative a atteint la valeur souhaitée. Nous préparons généralement des grilles à 60% ou plus.

Cela peut prendre quelques minutes. Placez la pince à épiler tenant une grille luminescente dans le bras plongeant. Placez la glissière du potentiomètre en position de départ, prête pour la mesure de la vitesse.

Réglez le déclencheur de la mesure de vitesse dans le logiciel de l’oscilloscope. Placez la tasse d’éthane liquide et près de la chambre d’humidité. Assurez-vous que le chemin du piston est dégagé.

Démarrez l’exécution dans le logiciel de contrôle. Une fois l’exécution terminée, appuyez sur OK’in dans le logiciel de contrôle pour relâcher la pression du bras plongeant. Ouvrez la chambre d’humidité, desserrez la connexion entre le bras plongeant et la pince à épiler.

Déplacez-vous vers le haut du bras plongeant tout en gardant la grille en éthane liquide. Ensuite, transférez les grilles à l’azote liquide et dans le stockage. Enregistrez la mesure de l’oscilloscope.

Réinitialisez manuellement la position du curseur et du piston du potentiomètre. Répétez le protocole pour préparer les grilles de réplication. Les expériences résolues dans le temps sont faites de la même manière.

Des concentrations de stock plus élevées sont nécessaires pour les expériences résolues dans le temps en raison de la dilution dans l’étape de mélange. Pour une expérience résolue dans le temps, utilisez les trois seringues. Le tube est fixé aux pompes à seringue et à la buse de pulvérisation.

La buse de pulvérisation microfluidique utilisée ici contient également un élément de mélange. Notez que les tubes plus longs donneront un volume mort plus important et que les étapes d’équilibrage du lavage nécessitent plus de tampon et d’échantillon. Équilibrez toutes les seringues avec un tampon et échantillonnez séparément.

En règle générale, la seringue un est utilisée pour l’échantillon A et les seringues deux et trois sont utilisées pour l’échantillon B’Une fois que le tube est équilibré, chargez l’échantillon A dans la seringue un et l’échantillon B dans les seringues deux et trois. Ensuite, changez les vannes une à trois pour distribuer. Démarrez l’exécution dans le logiciel de contrôle.

Notez qu’un script d’exécution différent est nécessaire pour une expérience à résolution temporelle. Différents délais peuvent être obtenus de deux manières. En ajustant la vitesse du piston, le délai entre le mélange et la congélation peut être modifié.

Une vitesse de plongée plus rapide entraînera un délai plus court. Alternativement, la distance de pulvérisation d’éthane est modifiée en ajustant la position verticale de la buse de pulvérisation. L’augmentation de la distance entraînera un délai plus long.

Dans le microscope électronique à faible grossissement, une grille typique ressemble à ceci. Les zones de glace mince, comme indiqué, conviennent à l’acquisition de données. À des grossissements plus élevés, les particules doivent être clairement visibles.

Avec un spécimen d’essai tel que l’apoferritine, un ensemble de données relativement petit à partir d’une seule grille est suffisant pour une reconstruction à une résolution de trois à quatre angströms. Pour les expériences résolues dans le temps, nous collectons des ensembles de données à partir de différents points temporels ou grilles. Il est utile de combiner les données pour la classification 3D, puis de retracer les particules jusqu’à leurs points temporels.

De cette façon, les données peuvent fournir des informations structurelles et des informations sur la cinétique de réaction. En conclusion, nous espérons que vous avez apprécié la vidéo. Nous espérons qu’avec les descriptions détaillées dans l’article JoVE avec la vidéo, vous serez en mesure de mener vos propres expériences via la fabrication rapide de grilles, ce qui a été montré pour atténuer certains des problèmes de mutation ou pour aider aux interactions à l’interface air-eau, tout ce dont vous avez besoin pour mener vos propres études résolues dans le temps pour essayer de piéger certains de ces états non équilibrés.

Donc, bonne fabrication de grille.