Name: Air-Gonflage des poumons murins avec perfusion vasculaire-Fixation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Découvrez une méthode économique combinant gonflage d'air et fixation par perfusion vasculaire pour préserver la morphologie pulmonaire chez la souris. Cette technique conserve l'emplacement et la structure des cellules alvéolaires pour l'analyse histologique.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été financé par les subventions HL140039 et HL130938 du National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI). Les auteurs tiennent à remercier Shannon Hott et Jazalle McClendon pour leur expertise technique.

Toutes les méthodes décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de National Jewish Health.
REMARQUE : Le protocole est organisé en trois composants. Le premier composant détaille la construction du gonflage de l’air avec un équipement de perfusion/fixation. Une deuxième section décrit comment configurer l’équipement pour une expérience. La dernière section décrit comment préparer l’animal et effectuer l’expérience.
1. Construction de l’appareil à colonne d’eau (Figure 1B)
<ol><li>Retirez le piston d’une seringue à embout glissant de 60 mL.</li>
	<li>Fixez du ruban adhésif autour de la seringue à la marque de 30 mL. Réglez la hauteur de la seringue sur cette marque pour la pression de gonflage initiale de 25 cmH2O. C’est également là que le niveau d’eau dans la colonne doit être tout au long de la procédure. Étiquetez la bande comme « 25 cm » (comme illustré à la figure 1A)ou « gonflage ». NOTE: Une pression de gonflage de 25 cmH2O est utilisée pour assurer le recrutement des espaces aériens effondrés. Une fois les alvéoles recrutées, la pression est abaissée à 20 cmH2O pour s’assurer que les espaces aériens ne sont pas distendus.</li>
	<li>Mesurez 5 cm du ruban adhésif vers l’extrémité du piston et fixez un autre morceau de ruban adhésif à la seringue. Déplacez la seringue jusqu’à cette marque pour abaisser la pression de gonflage à 20 cmH2O pendant la fixation. Étiquetez le ruban comme « 20 cm » (comme illustré à la figure 1A)ou « fixation ».</li>
	<li>Fixez 180 tubes en polychlorure de vinyle (PVC) à l’extrémité de la seringue. La longueur du tube dépend de la distance entre la seringue et la chambre de gonflage de l’air (environ 25-30 cm).</li>
	<li>Placez un tee mâle de style Luer (2) filetage (1,219 pouce de longueur, 0,904 pouce de hauteur, 0,0904 pouce de diamètre intérieur) à l’autre extrémité du tube. Ce Luer mâle se connectera au robinet d’arrêt de la chambre de gonflage de l’air (étape 2.4).</li>
</ol>2. Construction de la chambre de gonflage de l’air (Figure 1C)
<ol><li>Percez deux trous (environ 4 mm de diamètre) dans un récipient en plastique de 500 mL avec un bouchon vissé. Les trous doivent être de la même taille que la luers femelle (1,224 pouce de longueur, 0,312 pouce de hauteur, 0,098 pouce de diamètre intérieur). REMARQUE: Des supports vides ou des conteneurs tampons peuvent être utilisés pour la chambre de gonflage de l’air.</li>
	<li>Enduire les fils de Luers femelles avec un fabricant de joints en silicone et placer le plus petit côté dans les trous pré-percés du récipient.</li>
	<li>Ajoutez un joint en silicone autour des Luers femelles à l’endroit où elles pénètrent dans le récipient pour assurer une étanchéité à l’air.</li>
	<li>Vissez un robinet d’arrêt unidirections sur le Luer femelle inférieur de la chambre de gonflage à air.</li>
	<li>Coupez le tube à la longueur d’environ 25 cm et attachez les Luers mâles aux extrémités libres du tube. Connectez le Luer mâle à une extrémité du tube au Luer femelle libre sur la chambre de gonflage de l’air. L’autre mâle Luer se connectera au conteneur de traitement des animaux.</li>
</ol>3. Construction du conteneur de transformation animale (Figure 1D)
<ol><li>Percez un trou (environ 4 mm de diamètre) sur le côté d’un grand récipient en plastique. Le trou doit être le diamètre de la femelle Luer. Le récipient en plastique est nécessaire pour attraper l’excès de solution de fixation. REMARQUE: Un conteneur de stockage en plastique de 30 cm x 22 cm et 3,8 L a été utilisé.</li>
	<li>Enduisez les fils d’une femelle Luer avec un fabricant de joints en silicone et placez le plus petit côté dans le trou prépercé du récipient.</li>
	<li>Ajoutez un joint en silicone autour de la femelle Luer où il entre et sort du récipient pour assurer une étanchéité à l’air.</li>
	<li>Vissez un robinet d’arrêt à sens unique sur la femelle Luer. Le tube de la chambre de gonflage de l’air se fixera à ce robinet d’arrêt.</li>
</ol>4. Préparation des solutions
<ol><li>Solution d’héparine<ol>
<li>Remplissez un récipient avec du PBS sans calcium et de l’héparine (20 U/mL). Préparer une solution totale d’héparine de 10 mL pour chaque souris. L’héparine est un anticoagulant qui empêche la formation de caillots sanguins dans les vaisseaux pendant la perfusion-fixation. La solution d’héparine sera utilisée pour rincer le sang des poumons avant la fixation par perfusion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solution fixative ATTENTION : Les fixateurs peuvent présenter un risque pour la santé et doivent être utilisés dans une hotte chimique. Tous les appareils sont installés dans une hotte chimique pour empêcher l’inhalation de fixateurs.<ol>
<li>Remplissez un récipient avec du PBS sans calcium et du paraformaldéhyde (concentration finale de 4 %). Préparez une solution fixative totale de 50 mL pour chaque souris. REMARQUE: Le type de fixateur utilisé peut varier et dépendra des études histologiques en aval.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.   Préparation de l’appareil de perfusion
REMARQUE: Une pompe péristaltique est suggérée pour l’administration de fluides dans le système vasculaire afin d’assurer un débit constant. Les instructions suivantes concernent la mise en place de la pompe péristaltique et peuvent être différentes pour chaque modèle. Alternativement, si une pompe péristaltique n’est pas disponible, un deuxième appareil à colonne d’eau peut être construit pour perfuser les fluides à partir d’une hauteur de 35 cm H2O.
<ol><li>Placez d’abord le tube autour de l’assemblage du rouleau.</li>
	<li>Fixez le tube dans les poteaux entaillés.</li>
	<li>Verrouillez les leviers en place en plaçant d’abord le levier gauche autour du tube et en le fixant en place avec le levier supérieur, puis le levier droit.</li>
	<li>Placez l’extrémité proximale du tube dans la solution d’héparine et l’extrémité distale dans le récipient de traitement des animaux.</li>
	<li>Préchargez la solution d’héparine dans le tube en faisant fonctionner la pompe pour expulser l’air du tube.</li>
	<li>Fixez une aiguille de 25 G x 5/8 po à l’extrémité du côté gauche du tube.</li>
</ol>6. Préparation de l’appareil de gonflage de l’air
<ol><li>Placez la seringue pour la colonne d’eau dans un porte-anneau.</li>
	<li>Mesurez une hauteur verticale de 25 cm entre la plate-forme animal et la marque de ruban adhésif « 25 cm » (étape 1.2) sur la colonne d’eau.</li>
	<li>Fixez l’extrémité du tube de la colonne d’eau au robinet d’arrêt de la chambre à air.</li>
	<li>Fixez un tube de la femelle Luer de la chambre à air au robinet d’arrêt sur le récipient de traitement des animaux. REMARQUE : Si la chambre de gonflage de l’air est construite comme illustré à la figure 1C, la fixation du tube dans l’ordre inverse peut provoquer une fuite d’eau dans le tube qui se connecte à la canule trachéale.</li>
	<li>Assurez-vous que le bouchon de la chambre à air est bien fermé.</li>
	<li>Assurez-vous que le robinet d’arrêt à l’extérieur du contenant de traitement des animaux est fermé et que le robinet d’arrêt sur le tube menant de la colonne d’eau à la chambre de gonflage de l’air est ouvert.</li>
	<li>Remplissez la seringue avec de l’eau jusqu’à la marque « 25 cm ». L’eau quittera la seringue à travers le tube dans la chambre à air. Une fois la pression égalisée, l’eau cessera de couler.<ol>
<li>Il est possible que l’eau s’infiltre lentement dans la chambre de gonflage de l’air à mesure que la pression de l’air ambiant dans la hotte chimique fluctue. Gardez un œil sur le niveau d’eau à l’intérieur de la seringue et ajoutez-en plus si nécessaire. Maintenez le niveau d’eau à la marque « 25 cm » tout au long de la procédure. REMARQUE: Habituellement, les niveaux d’eau restent constants pour la première partie du gonflage de l’air à 25 cmH2O; Cependant, il faudra probablement ajouter plus d’eau à la seringue pendant la fixation. Si l’eau ne cesse pas de couler, il est probable qu’une fuite d’air existe dans la chambre de gonflage de l’air. Plus de fabricant de joints en silicone peut avoir besoin d’être appliqué autour des Luers pour éviter les fuites d’air.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Préparation des animaux (Figure 2)
REMARQUE: Cette procédure a été modifiée à partir de Gage et al13. Nous avons terminé cette procédure sur des souris mâles et femelles adultes d’âges différents et ne notons aucun biais d’âge ou de sexe.
<ol><li>Euthanasier l’animal avec du pentobarbital de sodium (150 mg/kg, par voie intrapéritonéale). Assurez-vous que l’animal est mort avant de commencer la dissection. REMARQUE: Bien que cette procédure soit effectuée sur des animaux euthanasiés, cette procédure peut être effectuée sur des animaux vivants pour utiliser le cœur pour pomper des perfusates dans tout l’animal.</li>
	<li>Faites deux incisions latérales à travers la paroi abdominale. Faites la première incision sous la cage thoracique et la seconde au-dessus des hanches. Couper le long de la ligne médiane de l’incision inférieure vers l’incision supérieure.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux contondants, faites soigneusement une incision dans le côté latéral du diaphragme. Les poumons devraient s’effondrer dès que le diaphragme est perforé. REMARQUE: Des précautions doivent être prises pour éviter de percer les poumons. Un poumon perforé est moins susceptible de se gonfler au cours des étapes ultérieures.</li>
	<li>Couper transversalement le long du diaphragme pour ouvrir la cavité thoracique.</li>
	<li>Coupez de manière supérieure le long du sternum du processus xiphoïde à l’encoche jugulaire et latéralement au-dessus de la cage thoracique pour exposer complètement le cœur et les poumons. Épinglez les côtés de la cage thoracique.</li>
	<li>Faites une incision médiane dans le cou au-dessus de la trachée. Enlevez la peau, les muscles, la glande thyroïde et le tissu conjonctif entourant la trachée.</li>
	<li>À l’aide d’une pince incurvée, faites glisser deux morceaux de fil ou de suture sous la trachée postérieure. Utilisez un morceau de suture pour maintenir l’adaptateur Luer-stub de gonflage en place, et utilisez l’autre pour attacher la trachée à la fin du gonflage de l’air et de la fixation de perfusion vasculaire.</li>
	<li>Percez un petit trou dans la trachée à l’aide d’une aiguille de 18G x 1 » ou de ciseaux à ressort Vannas.</li>
	<li>Placez un adaptateur Luer-stub 20G dans ce trou de la trachée.</li>
	<li>Attachez un fil autour de la trachée immédiatement distale à l’endroit où l’adaptateur Luer-stub entre pour le maintenir en place.</li>
	<li>Transférez l’animal dans le contenant de traitement des animaux.</li>
	<li>Fixez l’adaptateur Luer-stub à la femelle Luer à l’intérieur du récipient de traitement des animaux.</li>
</ol>8. Gonflage de l’air, perfusion et fixation des poumons (Figure 2)
<ol><li>Placez l’aiguille 25G x 5/8 " attachée au tube de l’appareil de perfusion dans le ventricule droit du cœur.</li>
	<li>Couper l’aorte abdominale pour permettre au sang de s’écouler du cœur et pour favoriser la circulation du perfusate dans les poumons.</li>
	<li>Ouvrez le robinet d’arrêt à l’extérieur du récipient de traitement des animaux pour gonfler les poumons. REMARQUE: Il peut prendre du temps pour que les poumons se gonflent complètement. Surveillez le niveau d’eau dans la seringue, il ne devrait pas diminuer rapidement à moins qu’il n’y ait une fuite dans les poumons.</li>
	<li>Gonfler les poumons à 25 cmH2O pendant 5 minutes. L’inflation à 25 cmH2O préconditionne le poumon et aide au recrutement dans les régions pulmonaires électriques. REMARQUE: Une petite quantité d’eau peut être nécessaire d’ajouter à la seringue pour maintenir la hauteur de 25 cm. L’inflammation et/ou les lésions pulmonaires induites expérimentalement peuvent influencer l’inflation des poumons. Dans ce cas, il peut être nécessaire d’augmenter la pression de gonflage jusqu’à un maximum de 35 cmH2O pour faciliter le recrutement dans les régions électriques.</li>
	<li>Pendant la dernière minute du gonflage pulmonaire, allumez la pompe péristaltique à un débit de 10 mL / min. La solution d’héparine doit s’écouler de la bouteille à travers le tube dans l’animal.<ol>
<li>Le but de la perfusion d’héparine est de prévenir la formation de thrombus dans les vaisseaux. En conséquence, infuser l’héparine jusqu’à ce que les poumons deviennent blancs et soient dépourvus de sang. Si les poumons ne blanchissent pas, un ajustement de l’aiguille ventriculaire droite peut être nécessaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après avoir gonflé pendant 5 minutes, éteignez la pompe péristaltique et passez le tube de perfusion de la solution d’héparine au fixateur.</li>
	<li>Abaissez la seringue de la colonne d’eau à la marque « 20 cm » (étape 1.3). Il est normal que les bulles d’air se déplacent à l’intérieur de la colonne d’eau lorsque la pression passe de 25 à 20 cmH2O.<ol>
<li>Vérifiez le niveau d’eau dans la seringue. Il devrait être à la marque « 25 cm ». Il peut être nécessaire d’en ajouter d’autres pour le moment.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Attendez 1 min pour permettre aux poumons de se dégonfler de 25 à 20 cmH2O.</li>
	<li>Redémarrez la pompe de perfusion à un débit de 6,5 mL/min.</li>
	<li>Perfusion vasculaire-fix pendant 10 à 15 minutes.</li>
</ol>9. Extraction des poumons (Figure 3)
<ol><li>Attachez fermement le deuxième morceau de fil autour de la trachée distale à l’adaptateur Luer-stub. Retirez l’adaptateur Luer-stub de la trachée.</li>
	<li>Retirez l’aiguille du cœur.</li>
	<li>Libérez les poumons et le cœur de la cavité thoracique en coupant le tissu conjonctif postérieur au médiastin avec des ciseaux contondants. Prenez soin d’éviter de percer les poumons.</li>
	<li>Retirez soigneusement le cœur des poumons.</li>
	<li>Placez les poumons en fixateur pendant la nuit. NOTE: La durée des variers fixateurs dépend des études histologiques en aval.<ol>
<li>Placez les poumons dans un tube conique de 50 mL contenant 20 à 25 mL de fixateur. Placez le fil en fixant la trachée à travers l’ouverture du tube conique et fixez-le par les fils du capuchon. Inverser le tube conique pour s’assurer que les poumons flottants et gonflés à l’air restent complètement immergés dans le fixateur, sinon ils flotteront vers le haut du liquide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Traiter les poumons pour les études histologiques.</li>
</ol>

<ol><li>Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Official+Research+Policy+Statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+Standards+for+Quantitative+Assessment+of+Lung+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Official Research Policy Statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for Quantitative Assessment of Lung Structure.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).</li>
<li>Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+rapidly+frozen+lungs%3A+evaluation+on+the+basis+of+standard+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 516-527 (1982).</li>
<li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis%3A+credits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 53 (2), 528-533 (1982).</li>
<li>Gil, J., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+volume-surface+area+relation+in+air-+and+saline-filled+lungs+fixed+by+vascular+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%3A+Respiratory%2C+Environmental+and+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alveolar volume-surface area relation in air- and saline-filled lungs fixed by vascular perfusion.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 47 (5), 990-1001 (1979).</li>
<li>Harris, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-Volume+Curves+of+the+Respiratory+System%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Care%22%5BJournal%5D)">Pressure-Volume Curves of the Respiratory System.</a> Respiratory Care. 50 (1), 78-99 (2005).</li>
<li>Bachofen, H., Schürch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+surface+forces+and+lung+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+A%3A+Molecular+%26+Integrative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alveolar surface forces and lung architecture.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 129 (1), 183-193 (2001).</li>
<li>Mead, J., Takishima, T., Leith, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+distribution+in+lungs%3A+a+model+of+pulmonary+elasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stress distribution in lungs: a model of pulmonary elasticity.</a> Journal of Applied Physiology. 28 (5), 596-608 (1970).</li>
<li>Mariano, C. A., Sattari, S., Maghsoudi-Ganjeh, M., Tartibi, M., Lo, D. D., Eskandari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Mechanical+Strain+Characterization+of+Ventilated+ex+vivo+Porcine+and+Murine+Lung+using+Digital+Image+Correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Novel Mechanical Strain Characterization of Ventilated ex vivo Porcine and Murine Lung using Digital Image Correlation.</a> Frontiers in Physiology. 11, 600492(2020).</li>
<li>Braber, S., Verheijden, K. aT., Henricks, P. aJ., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fixation+methods+on+lung+morphology+in+a+murine+model+of+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), 843-851 (2010).</li>
<li>Brain, J. D., Gehr, P., Kavet, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Airway Macrophages.</a> American Review of Respiratory Disease. 129 (5), 823-826 (1984).</li>
<li>Wheeldon, E. B., Podolin, P. L., Mirabile, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophage+Distribution+in+a+Mouse+Model%3A+The+Importance+of+the+Fixation+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophage Distribution in a Mouse Model: The Importance of the Fixation Method.</a> Toxicologic Pathology. 43 (8), 1162-1165 (2015).</li>
<li>Matulionis, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+deformation+and+macrophage+displacement+in+smoke-exposed+and+normal+mice+%28Mus+musculus%29+following+different+fixation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Archiv.+A%2C+Pathological+Anatomy+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Lung deformation and macrophage displacement in smoke-exposed and normal mice (Mus musculus) following different fixation procedures.</a> Virchows Archiv. A, Pathological Anatomy and Histopathology. 410 (1), 49-56 (1986).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (65), e3564(2012).</li>
<li>Crosfill, M. L., Widdicombe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+characteristics+of+the+chest+and+lungs+and+the+work+of+breathing+in+different+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physical characteristics of the chest and lungs and the work of breathing in different mammalian species.</a> The Journal of Physiology. 158 (1), 1-14 (1961).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Methods+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Safety+Evaluation%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Principles and Methods of Immunohistochemistry.</a> Drug Safety Evaluation: Methods and Protocols. , 115-128 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Bien que couramment utilisées, les méthodes de fixation intratrachéales déplacent les leucocytes des voies respiratoires et peuvent modifier l’architecture pulmonaire normale. La méthode de gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation qui est fournie dans ce protocole surmonte ces pièges et préserve plus précisément l’anatomie pulmonaire. Les clés pour obtenir des tissus de haute qualité à partir de la méthode de perfusion-fixation vasculaire comprennent une surveillance attentive des pressions de gonflage de l’a...

L’histologie pulmonaire représente l’étalon-or pour évaluer l’architecture pulmonaire pendant la santé et la maladie et est l’un des outils les plus couramment utilisés par les chercheurs enpneumologie 1. L’un des aspects les plus critiques de cette technique est l’isolement et la préservation appropriés du tissu pulmonaire, car la variabilité de cette étape peut entraîner une mauvaise qualité des tissus et des résultats erronés1,2,3. Chez les animaux vivants, le volume pulmonaire est déterminé par l’équilibre entre le recul élastique vers l’intérieur du poumon et les forces extérieures transmises par la paroi thoracique et le diaphragme par la tension superficielle. En conséquence, lorsque le thorax est entré, les forces extérieures sont perdues et le poumon s’effondre. Les sections histologiques préparées à partir de poumons effondrés ont une apparence encombrée et les limites entre les compartiments anatomiques (c.-à-d. les espaces aériens, les vascularisations et l’interstitium) peuvent être difficiles à distinguer. Pour contourner ce défi, les chercheurs gonflent souvent les poumons pendant la fixation chimique afin de maintenir la taille et l’architecture de l’espace aérien.
Les poumons peuvent être gonflés avec de l’air ou du liquide. La pression nécessaire pour gonfler les poumons au même volume diffère entre le gonflage de l’air et celui du liquide en raison des forces intermoléculaires à l’interface air-liquide. Une pression plus élevée (p. ex., 25 cmH2O) est nécessaire pendant le gonflage à l’air que le gonflage liquide (p. ex., 12 cmH2O) pour surmonter la tension superficielle et ouvrir les alvéoles effondrées4. Une fois les alvéoles recrutées, une pression plus faible peut maintenir les alvéoles ouvertes au même volume que les plateaux de la courbe pression-volume, et les pressions s’égalisent dans tout le poumon selon la loi de Pascal4,5,6,7,8.
Deux méthodes principales d’inflation et de fixation pulmonaires existent pour préserver les poumons murins pour l’histologie. Le plus souvent, les espaces aériens sont instillés avec du liquide - contenant souvent un fixateur. Le principal avantage de cette approche est qu’elle est relativement facile et nécessite peu de formation. Alors que l’instillation intratrachéale de fixateur peut être préférée dans les études qui se concentrent sur le système vasculaire, le liquide qui est instillé par la trachée a tendance à pousser les cellules des voies respiratoires proximales et les mucines dans des régions d’espace aérien plus distales tandis que l’inflation de l’air n’a pas1,3,4,9,10,11. De plus, le détachement accidentel des leucocytes de l’épithélium lors de l’inflation liquide modifie leur morphologie, leur donnant de manière artéfactuelle un aspect simple et arrondi4,10,11,12. Enfin, le gonflage des poumons avec du liquide peut involontairement comprimer l’interstitium4,10,11. Ensemble, ces facteurs peuvent déformer l’anatomie normale et les distributions cellulaires dans les poumons préservés, limitant ainsi la technique.
Une autre méthode de préservation des tissus est la perfusion vasculaire-fixation. Dans cette méthode, le fixateur est perfusé dans le système vasculaire pulmonaire via la veine cave ou le ventricule droit. Cette méthode préserve l’emplacement et la morphologie des cellules dans la lumière de l’espace aérien. Cependant, à moins que les poumons ne soient gonflés pendant la perfusion-fixation, le tissu pulmonaire est susceptible de s’effondrer.
Le gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation exploite les forces de chacune des techniques de fixation ci-dessus. Ici, nous fournissons un protocole pour cette technique. Les matériaux et l’équipement requis sont relativement peu coûteux et peuvent être facilement obtenus et assemblés. La configuration terminée, illustrée à la figure 1A,fournit une pression constante des voies respiratoires aux poumons au moyen d’une colonne réglable remplie de liquide tandis qu’une pompe péristaltique fournit un fixateur via le ventricule droit. Les poumons à morphologie préservée peuvent ensuite être traités pour des analyses structure-fonction.

<table><tbody><tr><td>00117XF-Robinet d’arrêt 1 voie 100/PK M Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>Mfr # VPB1000050N &ndash ; Article # EW-00117-XF</td><td>Robinet</td></tr><tr><td>d’arrêt BD Seringue de 60 mL, embout coulissant</td><td>BD</td><td>309654</td><td>Seringue utilisée pour construire la colonne d’eau</td></tr><tr><td>Aiguille BD PrecisionGlide 25G x 5/8</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td>Aiguille pour perfusion/fixation vasculaire</td></tr><tr><td>Femelle Luer Thread Style Panel Mount 1/4-28 UNF à Luer mâle</td><td>Nordson Medical</td><td>FTLLBMLRL-1</td><td>Luer</td></tr> <tr><td>femelleSel d’héparine sodique de la muqueuse intestinale porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td>Solution d’héparine.</td></tr><tr><td>Adaptateur Luer-Stub BD Intramedic Calibre 20</td><td>BD Biosciences</td><td>427564</td><td>Adaptateur Luer-Stub</td></tr><tr><td>Mâle Luer (2) vers Filetage Luer Femelle Style Tee</td><td>Nordson Medical</td><td>LT787-9</td><td>Mâle Luer</td></tr><tr><td>Nalgene 180 Tube en PVC en plastique transparent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8000-9020</td><td>Tube</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde Solution Aqueuse - 32 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15714-S</td><td>Solution fixatrice. Dilué à 4 % avec une solution saline tamponnée au phosphate</td></tr><tr><td>Permatex Ultra Blue Fabricant de joints en silicone RTV polyvalents</td><td>Permatex</td><td>81724</td><td>Fabricant de joints en silicone pour l’étanchéité à l’air des chambres</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate, 1x sans calcium ni magnésium</td><td>Bouteille Corning</td><td>21-040-CV</td><td>utilisée pour construire la chambre de gonflage à air et tampon utilisé pour l’héparine et les solutions fixatrices</td></tr><tr><td>Sterilite Ultra Seal 16,0 tasse récipient rectangulaire de conservation des aliments</td><td>Sterilite</td><td>0342</td><td>Récipient de transformation animale</td></tr></tbody></table>

air-gonflage des poumons murins avec perfusion vasculaire-fixation

Air-Inflation of Murine Lungs with Vascular Perfusion-Fixation

L’histologie pulmonaire est souvent utilisée pour étudier les contributions fournies par les cellules de l’espace aérien au cours de l’homéostasie pulmonaire et de la pathogenèse de la maladie. Cependant, les méthodes de fixation basées sur l’instillation couramment utilisées peuvent déplacer les cellules de l’espace aérien et le mucus dans les voies respiratoires terminales et peuvent modifier la morphologie des tissus. En comparaison, les techniques de perfusion-fixation vasculaire sont supérieures pour préserver l’emplacement et la morphologie des cellules dans les espaces aériens et la muqueuse. Cependant, si la pression positive des voies respiratoires n’est pas appliquée simultanément, des régions des poumons peuvent s’effondrer et les capillaires peuvent gonfler dans les espaces alvéolaires, entraînant une distorsion de l’anatomie pulmonaire. Ici, nous décrivons une méthode peu coûteuse de gonflage de l’air pendant la perfusion vasculaire-fixation afin de préserver la morphologie et l’emplacement des cellules alvéolaires et de l’interstitium dans les poumons murins pour les études histologiques en aval. Une pression d’air constante est délivrée aux poumons via la trachée à partir d’une chambre scellée remplie d’air qui maintient la pression via une colonne de liquide réglable tandis que le fixateur est perfusé à travers le ventricule droit.

Dans un thorax intact, les poumons sont maintenus ouverts par des forces extérieures appliquées par la paroi thoracique via l’espace pleural6,14. Lorsque le diaphragme est entré pendant la dissection, l’intégrité de l’espace pleural est abolie et les poumons doivent s’effondrer (Figure 2A, 2B). Pour réatenser les poumons, un gonflage de l’air est effectué. Dans un premier temps, 25 cm de pression d’eau sont appliqués...

Présenté est une méthode de gonflage de l’air avec perfusion vasculaire-fixation des poumons qui préserve l’emplacement des cellules dans les voies respiratoires, les alvéoles et l’interstitium pour les analyses structure-fonction. La pression constante des voies respiratoires est maintenue avec une chambre de gonflage de l’air tandis que le fixateur est perfusé via le ventricule droit. Les poumons sont traités pour des études histologiques.

Air-Gonflage des poumons murins avec perfusion vasculaire-Fixation

Lung histology is often used to investigate the contributions provided by airspace cells during lung homeostasis and disease pathogenesis. However, ...

Il s’agit d’une méthode peu coûteuse qui combine les avantages du gonflage de l’air et de la fixation par perfusion vasculaire pour préserver les poumons pour les analyses structurelles et fonctionnelles. Le principal avantage de cette technique est la préservation de la morphologie cellulaire et de l’emplacement dans les espaces aériens du poumon. Des précautions doivent être prises lors de la mise en place de l’adaptateur de talon de leurre dans la trachée et de l’aiguille de perfusion dans le ventricule droit pour assurer un gonflage et une fixation adéquats.Pour installer l’appareil de gonflage de l’air, placez une seringue pour la colonne d’eau dans un porte-anneau et mesurez une hauteur verticale de 25 centimètres de la plate-forme animale à 25 centimètres sur la colonne d’eau. Fixez à l’extrémité du tube de la colonne d’eau au robinet d’arrêt de la chambre à air et fixez un tube du leurre femelle de la chambre à air au robinet d’arrêt du récipient de traitement des animaux. Vérifiez que le bouchon de la chambre à air et le robinet d’arrêt à l’extérieur du récipient de traitement des animaux sont fermés et que le robinet d’arrêt du tube menant de la colonne d’eau à la chambre

air-inflation-of-murine-lungs-with-vascular-perfusion-fixation

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure d’isolement et de fixation chimique de la valeur pulmonaire de la souris en conformation fermée par pressurisation par perfusion.

Fixation par pression d’une valve pulmonaire murine isolée : une procédure pour isoler et fixer chimiquement la valve pulmonaire de souris en conformation fermée

La vasoconstriction pulmonaire hypoxique (HPV) est un phénomène physiologique important par lequel à l’hypoxie alvéolaire la perfusion pulmonaire est assortie à la ventilation. Le segment vasculaire principal contribuant au VPH est l’artère intra-acinnaire. Ici, nous décrivons notre protocole pour l’analyse du VPH des vaisseaux pulmonaires murins d’un diamètre de 20 à 100 μm.

Analyse vidéomorphométrique de la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des artères intra-pulmonaires à l’aide de tranches pulmonaires coupées de précision murine

La préparation des poumons dans le sang perfusé isolé, il est possible de visualiser des réseaux microvasculaires à la surface du poumon. Ici, nous décrivons une méthode pour quantifier la perméabilité des microvaisseaux simples dans les poumons isolés en utilisant l'imagerie de fluorescence en temps réel.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

Le but de cet article est de décrire les méthodes simples qui va grandement aider dans la configuration et l'analyse des poumons de souris avec le cancer du poumon ou d'autres pathologies. Nous présentons 3 protocoles d'effectuer simplement et de manière fiable sur instillations pulmonaires, la fixation, et les mesures de volume pulmonaire.

Instillation et la fixation méthodes utiles en recherche sur le cancer du poumon de souris

La zone de surface pulmonaire interne (ISA) est un critère critique pour évaluer la morphologie pulmonaire et la physiologie dans les maladies pulmonaires et la régénération alvéolaire induite par les blessures. Nous décrivons ici une méthode standardisée qui peut minimiser le biais de mesure pour ISA dans les modèles de la pneumonectomie pulmonaire et de la souris implantation de la prothèse.

Une méthode standardisée pour mesurer la surface interne du poumon par la pneumonie et la prothèse

Présenté ici est un protocole utile pour la fixation pulmonaire qui crée une condition stable pour l'évaluation histologique des spécimens de poumon à partir d'un modèle de souris de l'emphysème. Le principal avantage de ce modèle est qu'il peut fixer de nombreux poumons avec la même pression constante sans effondrement pulmonaire ou déflation.

Fixation pulmonaire sous pression constante pour l'évaluation de l'emphysème chez les souris

Le but de cette méthode est de présenter une méthode simple et efficace pour la perfusion, l’inflation, et la fixation des poumons de souris pour l’examen de la pathologie de tumeur de poumon et l’évaluation des métastases au poumon.

Perfusion et inflation du poumon de souris pour l’histologie de tumeur

Le but de cette technique est la visualisation ex vivo des réseaux artériels pulmonaires des souris postnatales et adultes précoces par l’inflation pulmonaire et l’injection d’un composé à base de polymère radio-opaque par l’intermédiaire de l’artère pulmonaire. Les applications potentielles pour les tissus moulés sont également discutées.

Moulage vasculaire des poumons de souris postnatales adultes et précoces pour l’imagerie micro-CT

Les souris exposées à l’ozone et à l’endotoxine bactérienne combinées montrent une mort cellulaire largement répandue, y compris celle des neutrophiles. Nous avons observé des adaptations cellulaires telles que la rupture du lamellipodia cytosquelettique, l’expression cellulaire accrue de la sous-unité complexe de synthase de V ATP β et l’angiostatin dans le lavage broncho-alvéolaire, la suppression de l’immuno-réaction de poumon et le recrutement retardé de neutrophile.

Visualisation des adaptations cellulaires pulmonaires pendant les lésions pulmonaires aiguës murines induites par l’ozone et le LPS

L’objectif est de développer un nouveau modèle de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) chez le rat capable de maintenir une fonction pulmonaire constante pendant 4 h tout au long de l’EVLP et de fournir à l’industrie des spécificités de mise en œuvre qui offriront une méthode solide pour appliquer l’EVLP à des modèles de rongeurs.

Mise en place d’un nouveau système de perfusion pulmonaire ex vivo pour les poumons de rat après mort circulatoire

Nous présentons une méthode pour un modèle de pathogenèse fongique qui préserve le positionnement naturel des spores fongiques dans les voies respiratoires pulmonaires pour une analyse par microscopie fluorescente.

Méthode efficace d’imagerie des poumons murins qui préserve la dynamique spatiale des spores fongiques dans les voies respiratoires

Découvrez une méthode économique combinant gonflage d'air et fixation par perfusion vasculaire pour préserver la morphologie pulmonaire chez la souris. Cette technique conserve l'emplacement et la structure des cellules alvéolaires pour l'analyse histologique.

Air-Gonflage des poumons murins avec perfusion vasculaire-Fixation

Explorer plus de vidéos