Name: 使用微流体混合平台为基因传递制订和定性脂质纳米粒子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 了解如何使用微流体混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米粒子。该方法可快速、可重复地生产高包封率的核酸负载LNPs，适用于基因治疗应用。

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感谢 Atul Saluja、Yatin Gokarn、Maria-Teresa Peracchia、Walter Schwenger 和 Philip Zakas 在 LNP 开发方面的指导与贡献。

整体流程的示意图见图1。
1. 缓冲液的制备
注意：建议在此处对缓冲液进行无菌过滤，以去除可能影响核酸和脂质纳米颗粒（LNP）质量的任何微粒。
<ol>
	<li>磷酸盐缓冲液（PBS）
	<ol>
		<li>使用8 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、137 mM NaCl 和 2.7 mM KCl 溶于无核酸酶水中配制1x PBS，并将pH值调节至7.4。</li>
		<li>使用0.22 µm孔径滤膜通过真空过滤法进行灭菌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>柠檬酸盐缓冲液
	<ol>
		<li>使用5 mM 柠檬酸钠、5 mM 柠檬酸和150 mM 氯化钠溶于无核酸酶水中配制柠檬酸盐缓冲液，并调节pH至4.5。</li>
		<li>使用0.22 µm孔径滤膜通过真空过滤法进行灭菌。 
		​注意：仅当mRNA为将被包封于LNP中的核酸时，才需要配制柠檬酸盐缓冲液。若将包封DNA，则跳过步骤1.2，直接进入步骤1.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苹果酸缓冲液
	<ol>
		<li>使用20 mM 苹果酸和30 mM 氯化钠溶于无核酸酶水中配制苹果酸缓冲液，并调节pH至3.0。</li>
		<li>使用0.22 µm孔径滤膜通过真空过滤法进行灭菌。 
		​注意：仅当DNA为将被包封于LNP中的核酸时，才需要配制苹果酸缓冲液。若将包封mRNA，则跳过步骤1.3。mRNA包封使用柠檬酸盐缓冲液，因为苹果酸缓冲液在pH 3.0的较低pH条件下可能导致mRNA降解风险增加。本方案可在此处暂停。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脂质混合物的制备
<ol>
	<li>如果储备脂质为粉末形式，需溶于纯200 proof乙醇中。</li>
	<li>根据所需的摩尔比例计算脂质组分的混合比例。此处以总脂质浓度为10 mM为例，采用50:10:39:1（可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：PEG）的摩尔比。表1列出了各组分所需的浓度和体积。 
	注意：在计算微流控混合器中乙醇（EtOH）内脂质混合物所需体积时，需计入总体积，以确保乙醇的加入不会影响脂质浓度。例如，可电离脂质的体积68.5 µL是通过将乙醇中5 mM的浓度乘以总脂质混合体积533 µL，再除以储备脂质浓度38.9 mM计算得出。</li>
	<li>将适量的每种脂质储备液加入玻璃小瓶中，并通过间歇性涡旋混合各组分。加入200 proof乙醇，使总体积达到533 µL。以表1中的示例为例，需加入254 µL乙醇。 
	​注意：为完成一次制备1 mL脂质纳米颗粒（LNP）的实验，需要342.5 µL脂质溶液。这是由于水相核酸与有机相脂质溶液按3:1比例混合，且在样品收集前后会弃去部分体积。因此配制533 µL混合液以作为过量补偿。</li>
</ol>
3. 核酸溶液的制备
注意：核酸溶液的制备和操作应尽可能在无菌且无RNase的环境中进行。操作核酸时应尽可能在生物安全柜内进行。
<ol>
	<li>计算 N/P 比值。N/P 比值是指可电离脂质的胺基总数（N）与核酸磷酸基团的负电荷总数（P）之间的比例。在脂质纳米颗粒（LNP）形成过程中，N/P 比值通常是一个可优化的参数。请按照以下步骤进行计算。
	<ol>
		<li>使用以下公式计算 N 的数量： 
		<img alt="可电离脂质计算公式，与化学实验中的分子浓度相关。" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 1"> 
		注意：表 1 中的可电离脂质浓度为 5 mM，相当于 5 × 10-6 mol/mL。所需脂质注射体积为 0.3425 mL。例如，若每个分子含有 1 个 N 单位，根据上述公式，脂质混合物中含有 1.03 × 1018 个 N 单位。</li>
		<li>根据目标 N/P 比值计算 P 单位的数量。此处以 N/P = 36 为例。 
		<img alt="公式 P=N/36=1.03x10^18/36=2.86x10^16；静态测量计算方法。" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 2"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下公式计算获得 2.86 × 1016 个 P 单位所需的核酸浓度。 
	<img alt="核酸摩尔数公式：P/(阿伏伽德罗常数 × 每碱基对的 P 数 × 碱基数)。" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 3"> 
	其中，mRNA 每碱基对的 P 单位数为 1，DNA 为 2。对于含有 1,200 个碱基的 mRNA，在 N/P = 36 时所需的 mRNA 量为 3.96 × 10-11 摩尔。</li>
	<li>使用以下公式计算在 N/P = 36 时所需的 mRNA 质量浓度。 
	<img alt="质量浓度公式；mRNA，核酸定量；方程，用于教学。" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式 4"> 
	核糖核苷酸单磷酸单位的平均分子量为 322 g/mol30。对于 1,200 个碱基的 mRNA，其分子量为 386,400 g/mol。核酸溶液所需的注射体积为 1.028 mL。因此，所需 mRNA 的浓度为 1.488 × 10-5 g/mL，即 14.88 µg/mL。</li>
	<li>用柠檬酸盐缓冲液配制 1.5 mL 浓度为 14.88 µg/mL 的 mRNA 溶液。 
	​注意：若封装的核酸为 DNA，则应使用苹果酸缓冲液配制核酸溶液。</li>
</ol>
4. 启动微流控通道
注意：本方案改编自仪器制造商的使用指南。
<ol>
	<li>通过点击相应的字段，在仪器软件中输入启动参数（表2）。 
	注意：建议流速比为3:1，流速为4–12 mL/min27,31。本研究中展示的结果以及仪器制造商均表明该条件为最优参数。若应用需求不同，可适当调整。</li>
	<li>打开仪器盖板，将微流控芯片放入旋转模块中。</li>
	<li>用1 mL注射器吸取至少0.5 mL乙醇，确保注射器尖端无气泡或空气间隙。将该注射器装载至芯片的右侧入口。</li>
	<li>用3 mL注射器吸取1.5 mL水相缓冲液（RNA提取使用柠檬酸缓冲液，DNA提取使用苹果酸缓冲液），确保无气泡或空隙。将该注射器装载至芯片的左侧入口。</li>
	<li>在夹持器中插入两个15 mL锥形管，作为废液收集容器。</li>
	<li>在仪器软件中点击运行，开始混合过程，并确保参数已正确输入。</li>
	<li>当仪器完成启动（以底部蓝色指示灯熄灭为标志）时，打开盖板，妥善处理锥形管和注射器。</li>
</ol>
5. LNP 的形成
注意：本方案改编自仪器制造商的操作指南。
<ol>
	<li>通过点击相应的字段更新软件中的配方参数（表2）。</li>
	<li>用1 mL注射器吸取脂质混合物（步骤2中制备）。去除注射器尖端的任何气隙或气泡，并将注射器插入卡盒的右侧。</li>
	<li>将核酸溶液（步骤3中制备）吸入3 mL注射器中，确保注射器尖端无气泡或气隙。将注射器插入卡盒左侧入口。 
	注意：提供的体积用于制备1 mL的脂质纳米颗粒（LNP）溶液。该仪器可使用最大10 mL的注射器，体积可相应放大，且不会影响结果。单次制备可生成的LNP最大体积为12 mL。</li>
	<li>用样品名称标记一个15 mL无RNase的锥形管，并插入左侧管夹中。将一个15 mL废液锥形管放入右侧管夹中。</li>
	<li>关闭仪器盖，确认参数输入正确后，点击运行。</li>
	<li>仪器运行结束后，妥善丢弃废液容器和卡盒。保留含有LNP样品的锥形管。</li>
	<li>用PBS将LNP稀释5倍，使乙醇浓度降至&lt;5%（v/v）。 
	​注意：微流控混合后应尽快在PBS中稀释LNP，以防止降解。稀释操作始终应在生物安全柜中进行，并在后续缓冲液置换过程中持续在生物安全柜中操作。</li>
</ol>
6. 缓冲液置换
注意：提供了使用超速离心过滤器的方案。尽管该方法能够更高效地完成缓冲液置换，但此处也可用透析替代。
<ol>
	<li>使用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）预清洗超滤离心滤器（孔径 100 kDa），在 1000 × g 条件下离心 5 分钟，然后弃去底部组分中的 PBS。 
	注意：选择 PBS 是为了将 pH 值提高至 7.4 ± 0.2，该 pH 值具有生理相关性，可使可电离脂质呈中性电荷。</li>
	<li>将稀释后的脂质纳米颗粒（LNP）加入已预清洗的超滤离心滤器的上层组分中，在 1000 × g 条件下离心 12 分钟。</li>
	<li>弃去底部组分中的滤过液。每次向超滤离心滤器中加入 5 mL PBS，重复洗涤两次，每次均采用相同的离心参数。无需维持最大体积。 
	注意：若制备的 LNP 体积有所放大，应相应增加每次洗涤所用 PBS 的体积。例如，若单次制备了 2 mL LNP，则建议每次洗涤使用 10 mL PBS。</li>
	<li>用移液器将 LNP 溶液沿超滤离心滤器管壁吹打数次，以尽量减少 LNP 损失。收集滤器中的 LNP 溶液，转移至无核酸酶的离心管中保存。如需，可加入 PBS 以使 LNP 溶液终体积达到 1 mL。</li>
	<li>如需要，可通过预润湿的 0.2 µm 注射式滤器进行过滤。 
	​注意：本方案可在此处暂停。</li>
</ol>
7. 测定包封效率
<ol>
	<li>通过将工作浓度的核酸溶液用 PBS 进行2倍系列稀释，制备标准曲线，起始最高浓度为 500 ng/mL，至少进行五次稀释。使用 PBS 作为空白对照。</li>
	<li>制备 LNP 样品的稀释液。用 PBS 稀释 LNP 样品，使其理论浓度接近标准曲线的中点（例如，根据初始浓度估算约为 250 ng/mL 的核酸）。</li>
	<li>配制含有 TritonX-100 的 RNA 定量试剂溶液（用于 mRNA 测定），以破坏 LNPs 并测量 LNP 内外的总核酸量。该溶液包含 0.5% (v/v) RNA 试剂、0.4% (v/v) TritonX-100 和 99.1% (v/v) PBS。</li>
	<li>配制不含 TritonX-100 的试剂溶液，用于测量未被 LNP 包封的核酸量。该溶液包含 0.5% (v/v) RNA 试剂和 99.5% (v/v) PBS。 
	注意：如果 LNP 包封的是双链 DNA (dsDNA)，例如质粒 DNA，则在步骤 7.3 和 7.4 中改用 dsDNA 试剂，并遵循相同操作流程。</li>
	<li>在96孔黑色荧光检测板中，分别加入步骤 7.1 和 7.2 制备的 LNP 样品及核酸标准品溶液，每种至少设置四个重复孔。</li>
	<li>向标准品和样品的半数重复孔中加入等体积的含 TritonX-100 的试剂。此步骤用于定量总核酸量。</li>
	<li>向标准品和样品剩余的孔中加入等体积的不含 TritonX-100 的试剂。此步骤用于定量未被 LNP 包封的核酸量。</li>
	<li>将酶标板在室温下振荡 5 分钟，确保标准品和样品与所加试剂充分混匀，同时注意避免光照。</li>
	<li>使用酶标仪检测荧光信号，激发波长为 480 nm，发射波长为 520 nm。</li>
	<li>利用加入不含 TritonX-100 试剂所建立的标准曲线，计算 LNP 外核酸的浓度，并乘以步骤 7.2 中使用的稀释倍数。</li>
	<li>利用加入含 TritonX-100 试剂所建立的标准曲线，计算 LNP 内外总核酸的浓度，并乘以步骤 7.2 中使用的稀释倍数。</li>
	<li>通过从总核酸浓度（步骤 7.11 计算所得）中减去 LNP 外核酸浓度（步骤 7.10 计算所得），计算 LNP 内核酸的浓度。</li>
	<li>根据 LNP 内核酸浓度（步骤 7.12 计算所得）与总核酸浓度（步骤 7.11 计算所得）的比值，计算包封效率。 
	​注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
8. 浓度调整
<ol>
	<li>如有需要，根据包封效率的检测结果调整LNP溶液中的核酸浓度。</li>
	<li>若需要较低浓度的溶液，可用PBS稀释至目标浓度。</li>
	<li>若需要较高浓度的溶液，可使用超滤离心管进行额外的离心浓缩步骤。 
	​注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
9. 测定LNP的流体动力学尺寸和多分散性
<ol>
	<li>取一份脂质纳米颗粒（LNP）溶液，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释40倍，定容至1 mL。 
	注意：如有需要，可调整稀释倍数。建议采用此稀释比例，因其仅需少量LNP储备液，同时可获得高质量的检测结果。</li>
	<li>使用半微量比色皿，测定LNP溶液的流体动力学直径和多分散系数。将LNP溶液加入比色皿中，并插入仪器。在仪器软件中设置操作程序，包括测量类型、样品信息（材料、分散介质、温度和比色皿类型）以及测量参数（测量次数）。准备就绪后，点击开始以启动测量。</li>
</ol>
10. 测定LNP的Zeta电位
<ol>
	<li>取一份LNP溶液，用无核酸酶水稀释40倍，得到终体积为1 mL的溶液。 
	​注意：使用无核酸酶水作为测定Zeta电位的溶剂，以尽量减少高盐缓冲液对电导率的影响。</li>
	<li>使用折叠毛细管Zeta池测量Zeta电位。
	<ol>
		<li>将LNP溶液加入比色皿中，液面达到填充线。将比色皿插入仪器，确保电极与仪器接触良好。</li>
		<li>在仪器软件中设置操作程序，包括测量类型、样品信息（材料、分散剂、温度和池类型）以及测量指令（运行次数）。准备就绪后，点击 开始 以启动测量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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所有作者均为赛诺菲公司的员工。作者声明不存在利益冲突或竞争性经济利益。

与现有其他方法（如脂质膜水合和乙醇注射）相比，采用微流控混合制备脂质纳米颗粒（LNP）具有可重复性高、速度快和样品用量少等显著优势。我们已证实该方法具有良好的可重复性，在不同批次的LNP制备中，包封效率和粒径均未出现显著差异。这对于包括LNP在内的任何治疗性产品实现临床应用而言，是一项至关重要的标准。
本文所述技术采用交错鱼骨状微流控混合方法，可在仅几分钟的时间尺度内实现脂质纳米颗粒（LNP）的形成。该混合方式利用混沌对流，有利于混合过程的控制并缩短混合时间27。这种混合器可使水相与有机相有效地相互包裹27。已有研究显示，采用交错鱼骨状混合时，颗粒会形成热力学上最小的稳定尺寸32，这意味着组分通常会影响LNP的粒径和多分散性27,32,33。在代表性结果中...

药物载体用于保护和递送治疗性药物，通常具有低细胞毒性、提高的生物利用度和增强的稳定性等有利特性1,2,3。聚合物纳米颗粒、胶束和基于脂质的颗粒此前已被用于核酸的包封与递送4,5,6,7。脂质已被用于多种类型的纳米载体系统中，包括脂质体和脂质纳米颗粒（LNP），因其具有良好的生物相容性和高稳定性8。LNP可有效包封核酸用于基因递送9,10。它们可在全身循环过程中保护核酸免受血清蛋白酶的降解11，并可改善向特定部位的递送效果，因为LNP的表面形貌和物理性质会影响其在体内的分布12。LNP还可提高组织穿透性和细胞摄取效率9。先前的研究已证明将siRNA成功包封于LNP中的可行性13，其中包括首个获批上市的含siRNA的LNP疗法，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性多发性神经病14&#160;，该疗法已于2018年获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局批准。最近，LNP正被研究用于递送更大的核酸分子，即mRNA和DNA9。截至2018年，约有22种基于脂质的核酸递送系统正处于临床试验阶段14。此外，含mRNA的LNP目前是领先的候选疫苗之一，并已被用于开发新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫苗15,16。这些非病毒基因疗法的潜在成功依赖于形成尺寸小（~100 nm）、稳定且均一、并具有高核酸包封率的颗粒。
在LNP配方中使用可电离脂质作为主要组分，已在复合、包封和递送效率方面显示出优势14。可电离脂质通常具有酸解离常数（pKa）&#60; 7；例如，FDA批准的LNP配方中所用的可电离脂质——二亚油酰甲基-4-二甲氨基丁酸酯（D-Lin-MC3-DMA）的pKa为&#160;6.4417。在低pH条件下，可电离脂质上的胺基发生质子化并带正电荷，从而能够与mRNA和DNA上的带负电磷酸基团组装结合。通过调节胺基（&#34;N&#34;）与磷酸基（&#34;P&#34;）的摩尔比，可优化组装过程。N/P比值取决于所用的脂质和核酸类型，并随不同配方而变化18。形成LNP后，可将pH调节至中性或生理pH，以利于治疗给药。在此类pH值下，可电离脂质去质子化，使LNP表面呈现中性电荷。
可电离脂质还有助于内涵体逃逸19,20。脂质纳米颗粒（LNP）在细胞摄取过程中会经历内吞作用，必须从内涵体中释放出来，才能将mRNA递送至细胞质，或将DNA递送至细胞核21。内涵体内部通常比细胞外环境更酸性，这使得可电离脂质带正电荷22,23。带正电荷的可电离脂质可与内涵体脂质膜上的负电荷相互作用，从而导致内涵体膜不稳定，促使LNP及其携带的核酸释放。目前，多种不同的可电离脂质正在被研究，以提高LNP在体内的分布效率以及内涵体逃逸能力14。
LNP 的其他典型组分包括辅助脂质，例如磷脂酰胆碱（PC）或磷脂酰乙醇胺（PE）类脂质。1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）是常用的辅助脂质24,25DOPE 已被证明可形成反向六角相 II（HII 相），并通过膜融合促进转染26，而DSPC因其圆柱形几何结构被认为可稳定脂质纳米颗粒（LNPs）27胆固醇也被加入到配方中，以增加膜的刚性，从而提高脂质纳米颗粒（LNP）的稳定性。最后，配方中包含脂质偶联的聚乙二醇（PEG），以提供必要的空间位阻，促进颗粒的自组装。27聚乙二醇（PEG）还可通过防止脂质纳米颗粒（LNP）聚集，提高其储存稳定性。此外，PEG常被用作隐形组分，可延长LNP在体内的循环时间。然而，这一特性也可能对LNP通过载脂蛋白E（ApoE）介导的内源性靶向机制向肝细胞募集造成挑战。28因此，已有研究探讨了脂质纳米颗粒（LNP）中聚乙二醇（PEG）扩散的酰基链长度，发现短链长度（C8-14）更易从LNP解离，并较之长链更有利于载脂蛋白E（ApoE）的募集28此外，已发现PEG所连接的脂质尾链的饱和度会影响LNPs的组织分布29最近的研究显示，Tween 20（一种在生物药物制剂中常用的表面活性剂，具有长的不饱和脂质尾）与PEG-DSPE相比，在引流淋巴结中表现出更高的转染效率，而PEG-DSPE主要在注射部位的肌肉中实现转染。29该参数可进行优化以实现所需的脂质纳米颗粒（LNP）体内分布。
形成脂质纳米颗粒（LNPs）的传统方法包括薄膜水化法和乙醇注入法27。尽管这些技术易于获取，但它们劳动强度大，可能导致包封效率低，且难以放大生产27。混合技术的进步催生了更易于放大、同时可生成更均匀颗粒的方法27。这些方法包括T型接头混合、交错人字形混合以及微流控流体动力聚焦27。每种方法具有独特的结构，但均能实现含有核酸的水相与含有脂质组分的有机相之间的快速混合，从而实现核酸的高效包封27。在本实验方案中，采用通过微流控芯片实现的快速且可控的混合，该芯片采用交错人字形混合设计。本方案详细阐述了含核酸的LNPs的制备、组装及表征过程。

<table><tbody><tr><td>1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（C-14 PEG）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880151P</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;l 带刻度滤芯吸头&amp;nbsp;（无RNase、无DNase、无DNA）</td><td>USA Scientific</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;l 带刻度滤芯吸头（无RNase、无DNase、无DNA）</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l 斜面滤芯吸头（无RNase、无DNase、无DNA）</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l 带刻度滤芯吸头（无RNase、无DNase、无DNA）</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;beta;-羟基-5-胆甾烯，5-胆甾烯-3&amp;beta;-醇（胆固醇）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip 无菌注射器（1 ml 注射器）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip 无菌注射器（3 ml 注射器）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer 通用注射器针头（BD 钝头填充针 18G）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>黑色 96 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-245-177</td><td></td></tr><tr><td>BrandTech BRAND BIO-CERT 无RNase、无DNase、无DNA 微量离心管（1.5 mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-380-813</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-611</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 ml 真空过滤/储存瓶系统，0.22 µm 孔径</td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>一次性折叠毛细管池</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，纯度 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand 半微量比色皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 圆底离心管（15 mL）（无DNase-RNase）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12500</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Amicon Ultra 离心过滤装置</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr 台式系统</td><td>Precision Nanosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 定量检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp;P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA 定量检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-036</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠二水合物，颗粒状</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-056</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用微流控混合平台制备和表征用于基因递送的脂质纳米颗粒

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

基于脂质的药物载体因其尺寸小、生物相容性好以及包封效率高，已被用于临床和商业化给药系统。利用脂质纳米颗粒（LNPs）包封核酸具有优势，可保护RNA或DNA免于降解，同时促进细胞摄取。LNPs通常包含多种脂质组分，如可电离脂质、辅助脂质、胆固醇以及聚乙二醇（PEG）偶联脂质。由于可电离脂质的存在，LNPs能够高效包封核酸：在低pH条件下，该脂质呈阳离子态，可与带负电荷的RNA或DNA发生复合。本文中，LNPs通过将信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）包封，并将脂质组分的有机相与核酸组分的水相进行快速混合而形成。该混合过程采用精确的微流控混合平台完成，可在维持层流的同时实现纳米颗粒的自组装。通过动态光散射（DLS）测定其流体动力学尺寸和多分散性。通过测量Zeta电位确定LNPs的有效表面电荷。采用荧光染料定量被包封的核酸，以表征包封效率。代表性结果展示了该方法的可重复性，以及不同配方和工艺参数对所制备LNPs的影响。

在不同日期制备了多批具有相同脂质配方和N/P比为6的脂质纳米颗粒（LNPs），以验证该技术的可重复性。第1批和第2批的粒径分布重叠，且多分散性相似（图2A）。两批样品在粒径和包封效率方面均未观察到显著差异（图2B）。每批样品的包封效率均较高（>98.5%），粒径相似，脂质纳米颗粒直径为77 nm。颗粒均一，第1批的平均多分散系数（PDI）为0.15，第2批为0.18。
在N/P比、所用可电离脂质及包封的核酸方面，配方参数的变化显示出一些微小但具有统计学意义的差异。尽管存在这些差异，但需要指出的是，所有形成的脂质纳米颗粒（LNP）的包封率均超过80%，大多数配方的包封率高于95%，且粒径小于110 nm，表明本研究中开发的所有配方均适用于基因递送。首先，使用可电离脂质A在N/P比为10和36的条件下制备LNP。降低N/P比导致包封效率下...

采用微流控混合平台方法开发用于mRNA和DNA包封的脂质纳米颗粒。

基于脂质的药物载体因其体积小、生物相容性好以及高效性，已被用于临床和商业化给药系统。

本方案可用于快速、高重复性地制备包裹核酸的脂质纳米颗粒，并可使用较低体积的试剂。可根据临床应用需求调节制剂参数，以实现理想的生物分布。微流控芯片采用标准的鱼骨状设计，可在混合过程中实现快速、精确且可控的层流流动。该方法易于放大生产，可生成均匀且包封率高的颗粒。鉴于目前大多数已获商业批准的基因治疗产品依赖病毒载体，本方法因其非病毒递送途径，可为基因传递研究提供参考，尤其适用于需要重复给药的应用场景。首先，将适量的每种液体储备溶液依次加入玻璃小瓶中，间歇性涡旋混匀。如表格所示，随后加入200 proof乙醇，使终体积达到533微升。然后加入适量的mRNA储备液，并用柠檬酸盐缓冲液稀释，以获得终体积为1.5毫升、浓度符合要求的溶液。为启动微流控通道，首先按照表格中所述，将启动参数输入仪器软件中。接下来，打开仪器盖子，将微流控芯片放入旋转模块中。用1毫升注射器吸取至少500微升乙醇，注意注射器尖端不得有气泡或空气间隙，然后将注射器插入芯片的右侧入口。另取一支5毫升注射器，吸取1.5毫升柠檬酸盐缓冲液，确保其中无气泡或空气间隙，随后将注射器插入芯片的左侧入口。将两个15毫升的锥形管放入夹持器中，作为废液容器，并点击“Go”以混合溶液。当仪器底部的蓝灯关闭，表明引液过程结束时，打开舱门，妥善处理锥形管和注射器。进行脂质纳米颗粒制备时，根据表格中所示设置相应的配方参数，并用预先配制好的脂质混合物装填一支1毫升注射器。排除注射器尖端的任何气隙或气泡，并将注射器插入卡盒右侧。将先前制备的核酸溶液装入一个3毫升注射器中，注意确保注射器尖端无气泡或气隙，然后将注射器插入卡盒左侧入口。将标有样品名称的15毫升无RNA酶锥形管放入左侧管夹中，将15毫升废液锥形管放入右侧管夹中。关闭仪器盖，然后点击“Go”。脂质和mRNA溶液将流经微流控芯片，脂质纳米颗粒溶液将被收集到锥形管中。在配方过程结束时保留最后一根锥形管，然后在生物安全柜中用5毫升PBS稀释脂质纳米颗粒。为进行缓冲液置换，首先用2毫升PBS预清洗孔径为100千道尔顿的超滤离心过滤器，离心后，将底部腔室中的PBS弃去。将稀释后的脂质纳米颗粒加入预先洗涤过的超速离心滤器的上层室中，进行三次离心洗涤，每次离心后弃去滤过液，并在前两次洗涤后向超速离心滤器中加入 5 毫升 PBS。最后一次洗涤后，用移液器将脂质纳米颗粒溶液沿超速离心滤器管壁反复吹打数次，以尽量减少纳米颗粒的损失，然后将纳米颗粒溶液转移至无核酸酶的离心管中。随后根据需要加入 PBS，将纳米颗粒悬液调整至适当的实验浓度和体积。为了评估脂质纳米颗粒的包封效率，首先在 PBS 中配制工作浓度的核酸溶液，从 500 纳克/毫升开始进行两倍系列稀释，至少配制五个稀释梯度，以生成标准曲线。接下来，在 PBS 中配制纳米颗粒样品的稀释液，使其理论浓度处于标准曲线中点附近。然后配制 RiboGreen RNA 检测试剂，通过混合适量的 RNA 检测试剂、Triton X-100 和 PBS，以检测脂质纳米颗粒内外的 RNA 存在情况。然后，为了检测液态纳米颗粒外部是否存在RNA，仅将适量的RNA试剂与PBS混合。将核酸标准品和脂质纳米颗粒溶液的重复样本加入黑色荧光检测用96孔板中，随后向标准品和样本重复孔中分别加入等体积的RNA定量试剂，一组加入Triton X100，另一组不加。将酶标板置于酶标仪中，在室温避光条件下振荡5分钟，以充分混匀样品，然后在微孔板读数仪上以480纳米激发波长和520纳米发射波长测定荧光信号。为了测定脂质纳米颗粒的流体动力学尺寸和多分散性，首先将纳米颗粒溶液在磷酸盐缓冲液（PBS）中稀释40倍，并将稀释后的溶液加入半微量比色皿中。将比色皿装入Zetasizer仪器，选择标准操作程序，根据纳米颗粒的材料、分散剂、温度和比色皿类型设置仪器参数。然后点击“开始”，以测量脂质纳米颗粒的流体动力学尺寸和多分散性。为了测定脂质纳米颗粒的Zeta电位，需将纳米颗粒溶液在无核酸酶水中稀释40倍，并将稀释后的溶液加入比色皿至填充线处。将比色皿放入Zeta电位分析仪中，确保电极与仪器接触良好，并根据脂质纳米颗粒的具体组成设置仪器以测定Zeta电位。然后点击“开始”以测量脂质纳米颗粒的Zeta电位。在本项分析中，不同日期制备了多批具有相同脂质配方和胺基与磷酸基比例的脂质纳米颗粒，以验证该技术的可重复性。如图所示，第一批次与第二批次的粒径分布重叠，多分散性相似，且各批次间的粒径和包封效率均未观察到显著差异。通常情况下，配方参数的改变会引发一些虽小但具有统计学意义的差异。例如，降低胺基与磷酸基的比例会导致包封效率下降 4%，同时纳米颗粒的流体动力学直径相应增加。使用不同可电离脂质但具有相同胺基与磷酸基比例配制的脂质纳米颗粒，其包封效率表现出显著变化，粒子直径也存在轻微差异。与包封 mRNA 的脂质纳米颗粒相比，包封质粒 DNA 的颗粒尺寸更大，尽管这两类纳米颗粒均表现出相似的包封效率。然而，流速这一工艺参数的变化不会影响脂质纳米颗粒的制备。脂质纳米颗粒具有广泛的应用前景，近期获批的新冠疫苗便是最佳例证。该技术提供了一套高效的工具，通过实现更少剂量的配方筛选，为未来的应用开辟了道路。

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