Name: Microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Apprenez la microscopie multiphotonique intravitale pour visualiser en temps réel les traitements par ultrasons focalisés et microbulles chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer l'augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique.

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Le logement des animaux a été fourni par le Centre de médecine comparée (CoMed, NTNU). La figure 3 a été créée en BioRender.com. L’enregistrement et le montage vidéo ont été réalisés par Per Henning, webmaster à la Faculté des sciences naturelles de NTNU. Le projet a été financé par l’Université norvégienne des sciences et de la technologie (NTNU, Trondheim, Norvège), le Conseil de recherches de Norvège (RCN 262228), les Instituts de recherche en santé du Canada (FDN 154272), l’Institut national de la santé (R01 EB003268) et la Chaire Temerty en recherche ciblée sur les ultrasons au Sunnybrook Health Sciences Centre.

Charissa Poon, Melina Mühlenpfordt, Marieke Olsman et Catharina de Lange Davies ne déclarent aucun conflit d’intérêts financier ou non financier concurrent. Spiros Kotopoulis est un employé à temps plein et détient des actions dans EXACT Therapeutics AS, une société développant des ultrasons et une administration améliorée de médicaments par microbulles / grappes. Kullervo Hynynen est le fondateur de FUS Instruments, dont il reçoit un soutien non lié à la recherche.

La surveillance intravitale du cerveau par microscopie multiphotonique est un outil précieux pour étudier les réponses cérébrales lors de l’exposition aux ultrasons. À notre connaissance, le protocole décrit ici est la seule méthode d’imagerie par microscopie multiphotonique du parenchyme cérébral lors de traitements échographiques-microbulles. La création de fenêtres crâniennes et l’utilisation de transducteurs annulaires permettent de surveiller en temps réel les réponses vasculaires, cellulaires et autres réponses en aval aux traitements ultrasonores-microbulles à haute résolution spatiale et temporelle. D’autres groupes ont effectué une imagerie par microscopie multiphotonique après l’achèvement des traitements par microbulles par ultrasons, manquant ainsi la réponse en temps réel du parenchyme cérébral aux traitements19. La procédure décrite offre un meilleur contrôle temporel, permettant la collecte de données qui peuvent aider à éclairer les mécanismes aigus derrière les traitements à ultrasons et à microbulles. Des données quantitatives et qualitatives peuvent être extraites et analysées à partir des piles d’images acquises, telles que la cinétique d’extravasation27,29,30, les changements dans le volume de la plaque β-amyloïde31 et la dynamique cellulaire32.
Plusieurs étapes de dépannage ont été mises en évidence tout au long du protocole. Tout d’abord, les étapes chirurgicales particulièrement sensibles à l’erreur de l’opérateur ont été soulignées, telles que l’utilisation de l’agarose lors de la chirurgie de la fenêtre crânienne et la mise en place du transducteur. Des mesures visant à prévenir l’inconfort et la mort des animaux ont également été fournies, notamment la surveillance de la physiologie animale pendant la chirurgie et le vortex complet du dextran avant l’injection. Deuxièmement, les spécifications physiques du transducteur et l’alignement de la lentille de l’objectif, du transducteur et de la fenêtre crânienne ont également été mis en évidence. Les spécifications du transducteur annulaire et ses propriétés acoustiques doivent être déterminées en tenant compte de la lentille d’objectif utilisée ainsi que du modèle animal. Plus précisément, le diamètre intérieur du transducteur annulaire doit être assez grand pour entourer la lentille de l’objectif, mais suffisamment petit pour être monté solidement sur le crâne de l’animal. De plus, la zone focale du transducteur doit s’aligner sur la portée de l’objectif utilisé.
Un défi courant est que la fenêtre crânienne et le transducteur annulaire sont inclinés par rapport à l’objectif. Un centrage approprié (XY) et un alignement (Z) de la lentille de l’objectif avec la fenêtre crânienne et le transducteur garantissent que la zone focale du transducteur, et donc la région du tissu cérébral traité, s’aligne sur le champ de vision d’imagerie et réduit le risque de collision entre la lentille de l’objectif et le transducteur pendant l’imagerie. L’alignement peut être réalisé en ajustant la position de la tête de l’animal et/ou en faisant pivoter le cadre stéréotaxique dans lequel il est fixé.
Les composants du microscope (p. ex., détecteurs, séparateurs de faisceau) et les paramètres d’acquisition d’images doivent être choisis en fonction de l’objectif de l’étude. Ici, un objectif avec une longue distance focale (> 2 mm) est utilisé en raison de la présence du ou des couvercles et du transducteur annulaire situé entre l’objectif et le cerveau. Un microscope vertical est également recommandé car il permet plus d’espace pour manœuvrer l’animal, en particulier pour les expériences cérébrales. Pour capturer la cinétique de la fuite induite par ultrasons-microbulles du colorant intravasculaire, une résolution temporelle élevée est favorable, ce qui peut être obtenu en utilisant un système de balayage par résonance. La combinaison de cela avec un système de détection à haute sensibilité, tel que les détecteurs de phosphure d’arséniure de gallium (GaAsP), donnera également des images plus favorables.
La procédure expérimentale présentée présente plusieurs limites. Tout d’abord, l’intervention chirurgicale est assez invasive et il a été rapporté qu’elle provoque une inflammation45, bien que l’inflammation puisse être minimisée46. De plus, les réponses immunitaires induites par les chirurgies de la fenêtre crânienne ont été observées pour disparaître de 2 à 4 semaines après la chirurgie23,24,25. En outre, le processus de forage, en particulier lorsqu’il est mené avec une force ou une vitesse excessive, peut endommager les tissus sous-jacents en raison de la génération de chaleur, de vibrations et de pression appliquée. On a également observé que les chirurgies de fenêtre crânienne et l’imagerie multiphotonique affectaient la température du cerveau47. Ces limitations peuvent être réduites dans une certaine mesure grâce à la création minutieuse de fenêtres crâniennes immaculées, à la récupération appropriée des animaux ayant des fenêtres crâniennes chroniques et au maintien de la température corporelle normotherme à l’aide d’une source de chauffage avec contrôle de rétroaction. Deuxièmement, la profondeur d’imagerie est limitée par le microscope et la lentille d’objectif utilisés. Par exemple, l’effet du traitement par microbulles à ultrasons dans les structures cérébrales plus profondes, telles que l’hippocampe, ne peut être étudié sans mesures plus invasives, telles que l’élimination du tissu cortical sus-jacent48 ou l’utilisation de microlentilles en conjonction avec la pénétration corticale49. L’utilisation d’un objectif avec une longue distance de travail pourrait résoudre ce problème dans une certaine mesure, mais la pénétration de la lumière est également limitée à de plus grandes profondeurs.
Bien que les images représentatives de ce protocole aient été acquises auprès de rongeurs de type sauvage, la procédure expérimentale présentée peut également être appliquée à des animaux transgéniques et à des modèles de maladies, tels que la maladie d’Alzheimer31. Les expériences échographiques non liées à la modulation BBB, telles que la neuromodulation induite par ultrasons, peuvent également être surveillées à l’aide de ce protocole33,34. D’autres applications possibles peuvent être réalisées en utilisant différentes configurations de microscope ou de détecteur, telles que l’appariement d’un microscope confocal avec une caméra ultra-haute vitesse50. Alors que le photoblanchiment et la phototoxicité sont comparativement pires dans les microscopes confocaux en raison du grand volume d’excitation, l’imagerie à ultra-haute vitesse peut permettre de visualiser les interactions cellules endothéliales-microbulles capillaires cérébrales avec une résolution temporelle élevée, ce qui pourrait éclairer davantage les mécanismes à l’origine des traitements BBB ultrasonore-microbulle. Pour conclure, le protocole décrit fournit une méthode pour surveiller les effets vasculaires et cellulaires induits par les expériences de BBB à microbulles à ultrasons en temps réel, fournissant un outil pour déterminer davantage les mécanismes à l’origine de ces traitements, ainsi que pour éclairer les réponses en aval du parenchyme cérébral aux traitements par ultrasons-microbulles.

Un défi clé pour traiter les troubles neurologiques est la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Le BBB empêche les molécules hydrophiles, chargées, polaires et de grande taille (> 400 Da) d’entrer dans le parenchyme cérébral1. Une méthode actuellement utilisée pour administrer des traitements à travers le BBB dans le parenchyme cérébral consiste à utiliser des injections intracrâniennes stéréotaxiques2. D’autres méthodes moins invasives à l’étude sont entravées par la complexité des techniques utilisées, telles que la conception de médicaments pour l’administration médiée par les récepteurs à travers le BBB3, ou sont limitées dans la précision spatiale des zones ciblées, telles que les injections intranasales4 ou l’administration de solutions hyperosmotiques5.
L’utilisation d’ultrasons en conjonction avec des microbulles injectées de manière systémique, un agent de contraste à ultrasons, a été développée comme un moyen non invasif d’augmenter transitoirement la perméabilité du BBB6. En utilisant un transducteur focalisé7 ou un réseau de transducteurs phasés orientables8,9, les ultrasons peuvent être ciblés sur des zones sélectionnées du cerveau avec une précision millimétrique, minimisant ainsi les effets hors cible. Les traitements par microbulles par ultrasons peuvent être adaptés à l’anatomie cérébrale de chaque sujet en utilisant le guidage par imagerie par résonance magnétique7,10,11,12,13,14 ou des cadres stéréotaxiques15. En outre, l’étendue de l’augmentation de la perméabilité au BBB peut être contrôlée en temps réel en surveillant les émissions acoustiques des microbulles16,17,18. Des essais cliniques portant sur l’innocuité et la faisabilité des traitements par ultrasons-microbulles sont actuellement en cours dans le monde entier (p. ex., identificateur ClinicalTrials.gov NCT04118764).
Les traitements BBB à microbulles échographiques sont généralement évalués en confirmant les augmentations induites par le traitement de la perméabilité à la BHE, visualisées dans l’imagerie par résonance magnétique améliorée par contraste, ou par extravasation de colorant dans l’imagerie in vivo ou l’histologie ex vivo. Cependant, la plupart des analyses microscopiques ont été effectuées ex vivo, après l’achèvement des traitements par microbulles à ultrasons11,19, manquant ainsi les réponses biologiques dynamiques pendant et immédiatement après l’exposition aux ultrasons. L’imagerie en temps réel réalisée pendant l’exposition aux ultrasons peut aider à comprendre les mécanismes à l’origine des traitements de BBB à microbulles échographiques ainsi que les réponses en aval, ce qui peut améliorer notre compréhension de ses applications thérapeutiques. En outre, l’utilisation de fenêtres crâniennes chroniques avec des techniques d’imagerie in vivo permettrait des études longitudinales pour évaluer les aspects temporels des traitements par ultrasons et microbulles.
L’objectif de ce protocole est de décrire les procédures chirurgicales et techniques nécessaires pour effectuer une imagerie multiphotonique en temps réel des traitements par ultrasons et microbulles pour les études aiguës et chroniques chez les rongeurs (Figure 1). Ceci est réalisé en deux parties: premièrement, pour créer une fenêtre crânienne pour permettre l’imagerie in vivo, et deuxièmement, pour monter un transducteur annulaire sur le dessus pour permettre la sonication et l’imagerie simultanées. Les fenêtres crâniennes ont été largement utilisées par les neuroscientifiques pour l’imagerie in vivo du couplage neurovasculaire20, la pathogenèse β-amyloïde21 et la neuroimmunologie22, entre autres. Dans ce protocole, les procédures chirurgicales pour créer des fenêtres crâniennes aiguës (non-récupération) et chroniques (récupération) dans le crâne de souris et de rat sont décrites. Les méthodologies de fenêtre crânienne, en particulier pour les expériences chroniques, ont été bien documentées23,24,25. Pour être cohérent avec la littérature existante, les termes « aigu » et « chronique » seront utilisés tout au long de ce protocole. La conception de transducteurs annulaires pour l’imagerie in vivo a également été décrite précédemment26. Malgré la disponibilité de ces techniques et les connaissances qui peuvent être obtenues grâce à l’imagerie en temps réel des traitements par ultrasons et microbulles, très peu de laboratoires de recherche ont publié avec succès de la littérature utilisant cette technique26,27,28,29,30,31,32 . En tant que tel, dans ce protocole, les détails chirurgicaux et techniques de la réalisation de ces expériences échographiques-microbulles en temps réel sont décrits. Bien que les paramètres de sonication et d’imagerie spécifiés aient été optimisés pour les expériences de BHE, d’autres effets de l’exposition aux ultrasons sur le cerveau, tels que la neuromodulation33,34, la surveillance de la plaque β-amyloïde31 et les réponses des cellules immunitaires32, peuvent également être étudiés à l’aide de cette technique.

<table><tbody><tr><td>Ring transducer placement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose (poudre)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Beaker ou Erlenmeyer flask (50 ml)</td><td>VWR</td><td>213-0462 ou 214-1130</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate (gel)</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre (13 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CB00130RA120MNT0</td><td>Lamelle pour transducteur annulaire.</td></tr><tr><td>Plaque chauffante ou micro-ondes</td><td>Corning</td><td>PC-400D</td><td>Pour chauffer la solution d’agarose.</td></tr><tr><td>PBS (1X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Sonde annulaire</td><td>Sur mesure Sur</td><td></td> mesure <td>Sur mesure. Par ex. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518</td></tr><tr><td>Bouchon en caoutchouc</td><td>VWR</td><td>217-0867</td><td></td></tr><tr><td>Préparation animale et médicaments</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bupivacaïne*A</td><td>Aspen</td><td>169912</td><td>Dose : 1 mg/kg, s.c., anesthésique local injecté au site d’incision.</td></tr><tr><td>Buprénorphine*A</td><td>Indivior</td><td>521634</td><td>Dose souris : 0,05-0,1 mg/kg, s.c., opioïde, administrer avant la chirurgie.</td></tr><tr><td>Buprénorphine*A</td><td>Indivior</td><td>521634</td><td>Dose rat : 0,01-0,05 mg/kg, s.c..</td></tr><tr><td>Carprofène*C</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02255693</td><td>Dose : 5 mg/kg, s.c., AINS, administrateur post-opératoire.</td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Veet</td><td>N/A</td><td>Pour l’épilation complète après la coupe.</td></tr><tr><td>Dexaméthasone*C</td><td>Sandoz</td><td>DIN 00664227, 2301</td><td>Dose : 3 mg/kg, i.m., corticostéroïde, réduit l’œdème cérébral, administrer avant l’opération.</td></tr><tr><td>Enrofloxacine*C</td><td>Bayer</td><td>DIN : 02249243</td><td>Dose : 5 mg/kg, i.p., antibiotique, administrer après la chirurgie.</td></tr><tr><td>Tondeuses</td><td>à fourrure Aesculap</td><td>90200714</td><td>Exacta/Isis.</td></tr><tr><td>Coussin chauffant</td><td>Physitemp Instruments INC</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>ESDG9623C</td><td>Dose : 3 % induction, 1 % entretien ; anesthésique.</td></tr><tr><td>Meloxicam*A</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td>25388</td><td>Dose souris : 2-3 mg/kg, s.c., AINS, administrer avant l’opération.</td></tr><tr><td>Meloxicam*A</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td>25388</td><td>Dose rat : 1 mg/kg, s.c.</td></tr><tr><td>Oxymètre de pouls</td><td>STARR Life Sciences Corp</td><td>N/A</td><td>MouseOx.</td></tr><tr><td>Cadre stéréotaxique</td><td>Kopf</td><td>Kopf 900</td><td></td></tr><tr><td>Pommade ophtalmique stérile</td><td>Th&eacute ; a</td><td>597562</td><td>Viscotears.</td></tr><tr><td>Cathéter de veine caudale (24 G)</td><td>BD Neoflon</td><td>391350</td><td></td></tr><tr><td>* Discutez de la posologie et du type d’administration avec le vétérinaire avant l’utilisation. A Pour les chirurgies de fenêtre aiguës, C Pour les chirurgies de fenêtre chroniques. La dose pour les souris et les rats est la même, sauf indication contraire.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Matériel et équipement pour la pose de fenêtres crâniennes</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampons imbibés d’alcool</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux fins incurvés</td><td>Outils de science fine</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Coton-tige ou sans fibres</td><td>Chemtronics</td><td>CX50</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate (gel)</td><td>Loctite</td><td>1594457 (gel), 230992 (liquide)</td><td>S’il n’est pas disponible, la colle cyanoacrylate liquide peut être mélangée à de la poudre d’acrylate extra-fine.</td></tr><tr><td>Ciment dentaire</td><td>Lang Dental</td><td>Jet Set-4 Denture Repair Package</td><td></td></tr><tr><td>Perceuse à main à micromoteur dentaire</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070-2</td><td>Kit de micromoteur rotatif à grande vitesse avec pince de serrage de 2,35 mm.</td></tr><tr><td>Pince</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10, 11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CB00050RA120MNT0 (5 mm)</td><td>Fenêtres crâniennes de souris.</td></tr><tr><td>Lamelles en verre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CB00080RA120MNT0 (8 mm)</td><td>Fenêtres crâniennes pour rats.</td></tr><tr><td>Micro-fraises de foret (0,5 mm)</td><td>Meisinger</td><td>HM71005 (0,5 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Micro-fraises de foret (0,7 mm)</td><td>Meisinger</td><td>HM71007 (0,7 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td></td></tr><tr><td>Éponge de gélatine chirurgicale</td><td>Ethicon</td><td>MS0005</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond Colle tissulaire</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Pesée bateaux / plateaux</td><td>VWR</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>* Autoclave les champs opératoires, les outils, les matériaux et les blouses, et utiliser des gants chirurgicaux stériles, pour les chirurgies chroniques des fenêtres crâniennes.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopie multiphotonique</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objectif à immersion dans l’eau 20x</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20 XW</td><td>Ouverture numérique 1,0, distance de travail 2,0 mm.</td></tr><tr><td>Dextran fluorescent (par exemple FITC 70 kDa)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46945</td><td>Recommandé 10 kDa-2 MDa.</td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee Ti :Sapphire oscillateur laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope SliceScope</td><td>Scientifica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Traitement par ultrasons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 dB Amplificateur RF</td><td>E& I</td><td>2100L</td><td></td></tr><tr><td>Circuit assorti Sur</td><td>mesure Sur</td><td>mesure Sur</td><td>mesure.</td></tr><tr><td>Microbulles</td><td>Bracco Imaging</td><td>N/A</td><td>SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg.</td></tr><tr><td>Microbulles</td><td>Lantheus</td><td>N/A</td><td>Definity (Lantheus Medical Imaging, Amérique du Nord). Dose 0,02-0,04 ml/kg.</td></tr><tr><td>Générateur de signaux</td><td>Agilent Technologies</td><td>33500B</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un défi clé pour la livraison réussie de médicaments au cerveau. L’exposition aux ultrasons en présence de microbulles est apparue comme une méthode efficace pour augmenter transitoirement et localement la perméabilité du BHE, facilitant ainsi le transport para- et transcellulaire des médicaments à travers le BHE. L’imagerie de la vascularisation pendant le traitement par microbulles échographiques fournira des informations précieuses et nouvelles sur les mécanismes et la dynamique des traitements ultrasonores-microbulles dans le cerveau.
Nous présentons ici une procédure expérimentale pour la microscopie multiphotonique intravitale utilisant une fenêtre crânienne alignée avec un transducteur annulaire et un objectif 20x. Cette configuration permet une imagerie du cerveau à haute résolution spatiale et temporelle pendant les traitements par microbulles échographiques. L’accès optique au cerveau est obtenu via une fenêtre crânienne ouverte du crâne. En bref, un morceau de crâne de 3 à 4 mm de diamètre est retiré et la zone exposée du cerveau est scellée avec un couvercle en verre. Un transducteur annulaire de 0,82 MHz, qui est fixé à un deuxième couvercle en verre, est monté sur le dessus. L’agarose (1 % p/v) est utilisée entre le couvercle du transducteur et le couvercle recouvrant la fenêtre crânienne pour empêcher les bulles d’air qui entravent la propagation des ultrasons. Lorsque des procédures chirurgicales stériles et des mesures anti-inflammatoires sont prises, des traitements par microbulles échographiques et des séances d’imagerie peuvent être effectués à plusieurs reprises pendant plusieurs semaines. Les conjugués de dextran fluorescents sont injectés par voie intraveineuse pour visualiser le système vasculaire et quantifier les effets induits par les ultrasons et les microbulles (p. ex., cinétique des fuites, changements vasculaires). Cet article décrit le placement de la fenêtre crânienne, le placement du transducteur annulaire, la procédure d’imagerie, les étapes de dépannage courantes, ainsi que les avantages et les limites de la méthode.

Les traitements échographiques-microbulles réussis peuvent être détectés par l’extravasation du dextran fluorescent de l’espace intravasculaire à l’espace extravasculaire (Figure 8), indiquant une augmentation de la perméabilité au BBB. Selon le champ de pression du transducteur annulaire, les vaisseaux piaux et/ou les capillaires seront affectés.
Pour évaluer les changements vasculaires induits par les traitements par microbulles à ultrasons, le diamètre du vaisseau d’intérêt peut être mesuré avant, pendant et après le traitement par microbulles échographiques (figure 9). Cela peut être fait manuellement dans un logiciel disponible dans le commerce (par exemple, le logiciel Olympus Fluoview). Lors de l’acquisition d’images, des injections de bolus dextran et des balayages linéaires peuvent également être utilisés pour évaluer le flux sanguin30,41. Pour évaluer la cinétique des fuites de dextran en tant que modèle représentatif de l’administration de médicaments, l’intensité du signal entre les espaces intra et extravasculaires peut être évaluée à l’aide d’outils tels que MATLAB26,27,29,41 (Figure 10).
Un traitement d’image supplémentaire peut être réalisé à l’aide d’ImageJ/FIJI. ImageJ/FIJI est un logiciel open source compatible avec MATLAB et bien adapté pour effectuer des analyses courantes dans l’analyse d’images biologiques, telles que la mesure des changements vasculaires, ou la longueur ou la distance entre les objets fluorescents (par exemple, les plaques β-amyloïdes aux vaisseaux sanguins). Les pipelines de traitement d’image créés dans ImageJ/FIJI peuvent être automatisés en écrivant des macros personnalisées.
Des analyses plus complexes, telles que la segmentation 3D des vaisseaux sanguins et le suivi cellulaire, peuvent être réalisées à l’aide d’un logiciel semi-automatisé plus avancé (Figure 11). Après la segmentation, des analyses plus spécifiques peuvent être effectuées, telles que la classification des vaisseaux sanguins en tant qu’artérioles, veinules ou capillaires, en fonction du diamètre, de la ramification, des modèles de tortuosité et de la direction de l’écoulement42,43. Des algorithmes d’apprentissage automatique ont également été développés pour automatiser la segmentation des vaisseaux sanguins22,44.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4.jpg"> Figure 1 : Flux de travail général des expériences cérébrales intravitales multiphotoniques à ultrasons et microbulles. Un flux de travail général des expériences cérébrales intravitales multiphotoniques à ultrasons et microbulles décrites dans ce protocole est montré. Il y a 6 étapes: (A) Préparation animale pour (A1) souris et (A2) rats, (B) injection de Dextran, (C) Injection de microbulles, (D) Imagerie prétraitemente, (E) Traitement et imagerie, (F) Imagerie post-traitement et analyse des données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig1v4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig02.jpg"> Figure 2 : Coupe et vue de dessus du moule imprimé en 3D. (A) Coupe transversale du moule. Une fine couche de colle cyanoacrylate est appliquée sur la surface supérieure du transducteur annulaire et un couvercle est placé sur le dessus. Un tampon peut être utilisé pour appliquer une pression ferme et uniforme sur le couvercle et le transducteur annulaire. (B) Vue de dessus du moule. Une encoche peut être ajoutée dans le moule pour faciliter le retrait du transducteur préparé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig03.jpg"> Figure 3 : Configuration des ultrasons. Le matériel typique pour les expériences d’échographie est montré. Les paramètres ultrasonores sont réglés et déclenchés par le générateur de signaux et amplifiés par l’amplificateur. Un capteur de puissance peut être utilisé pour enregistrer les puissances avant et réfléchies avant d’envoyer le signal à la boîte correspondante, qui est adaptée au transducteur. Toutes les connexions sont réalisées à l’aide de câbles BNC, sauf indication contraire. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig04.jpg"> Figure 4 : Zone d’enlèvement de la fourrure et du cuir chevelu. (A) L’enlèvement de la fourrure doit commencer entre les yeux et s’étendre jusqu’à la moitié antérieure du cou. (B) L’ablation du cuir chevelu doit être suffisante pour exposer les os pariétaux. Le saignement doit être arrêté avant de continuer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig05.jpg"> Figure 5 : Contour de la fenêtre crânienne. La fenêtre crânienne est située sur un os pariétal. (A) Un contour de la fenêtre crânienne peut être dessiné sur le crâne pour faciliter le processus de forage. (B) Le contour de la fenêtre crânienne peut être vu après le forage à travers l’os compact. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig06.jpg"> Figure 6 : Alignement de la fenêtre crânienne et du transducteur. (A) La fenêtre crânienne est créée sur un os pariétal. L’îlot osseux a été enlevé, exposant le cerveau en dessous. (B) La fenêtre crânienne est complète lorsqu’un couvercle en verre est scellé sur le crâne à l’aide de colle cyanoacrylate. (C) Le transducteur est centré sur la fenêtre crânienne et adhéré à l’aide de colle cyanoacrylate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig07.jpg"> Figure 7 : Positionnement de l’objectif et du transducteur. (A,B) L’objectif est centré sur le transducteur annulaire. (C) Les vaisseaux sanguins remplis de dextran fluorescent sont visibles à travers les oculaires, sous épifluorescence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig08.jpg"> Figure 8 : Projection maximale d’images multiphotoniques d’augmentations de la perméabilité induite par des microbulles à ultrasons. Images de projection maximale de la vascularisation (A) avant et (B) après les traitements par ultrasons-microbulles. Les traitements échographiques-microbulles réussis peuvent être confirmés en observant une augmentation de la perméabilité à la BHE après le traitement, visualisée sous forme d’extravasation fluorescente de la dextrane (flèches). Barre d’échelle : 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4.jpg"> Figure 9 : Analyse de la vasomodulation induite par les traitements par ultrasons-microbulles. Images de projection maximale des vaisseaux sanguins cérébraux avant, pendant et après les traitements par microbulles échographiques. Des microbulles sont présentes dans toutes les images. Par rapport aux conditions de prétraitement (A), une vasomodulation claire peut être observée (B) lors de traitements par microbulles échographiques (flèches rouges). Les augmentations de la perméabilité à la BHE médiées par les ultrasons et les microbulles sont également évidentes après le traitement de la fuite de dextran fluorescent de l’espace intravasculaire vers l’espace extravasculaire (flèches jaunes). (C) Lorsque l’échographie est désactivée, les diamètres vasculaires reviennent aux tailles de base du prétraitement. (D) Les changements vasculaires peuvent être analysés en traçant le diamètre du vaisseau d’intérêt avant, pendant et après le traitement par microbulles échographiques. Barre d’échelle : 100 μm. (Œuvre inédite). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig9v4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4.jpg"> Figure 10 : Analyse de la cinétique des fuites après des traitements par microbulles par ultrasons. L’augmentation de la perméabilité au BBB est visualisée comme une fuite de dextran fluorescent de l’espace intravasculaire vers l’espace extravasculaire. Les changements dans la perméabilité à la BHE sont évidents lorsque l’on compare les piles d’images acquises (A) avant et (B) après les traitements par microbulles échographiques. (C) La cinétique de fuite peut être analysée en suivant l’intensité, le volume et la vitesse du dextran dans des compartiments extravasculaires (rectangle jaune). Barre d’échelle : 50 μm. (Œuvre inédite.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/62235fig10v4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62235/632235fig11.jpg"> Figure 11 : Segmentation des vaisseaux sanguins de la pile XYZ de microscopie multiphotonique. (A) Profondeur (XYZ) pile de vaisseaux sanguins chez un rat EGFP transgénique. Les vaisseaux sanguins sont visualisés par injection intraveineuse de texas red fluorescent 70 kDa dextran (rouge). Le canal vert montre les cellules fluorescentes et l’autofluorescence tissulaire. (B) Des reconstructions 3D des vaisseaux sanguins sont créées, puis codées par couleur en fonction du type de vaisseau sanguin pour faciliter les analyses spécifiques au type. Les veines/veinules sont bleues, les artères/artérioles sont rouges et les capillaires sont cyan. Barre d’échelle: 50 μm. Reconstructions créées à l’aide de Bitplane Imaris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62235/632235fig11large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit les procédures chirurgicales et techniques qui permettent l’imagerie en temps réel in vivo par fluorescence multiphotonique du cerveau des rongeurs pendant les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique.

Microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

L’exposition aux ultrasons en présence de microbulles est apparue comme une méthode efficace pour augmenter transitoirement et localement la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. Normalement, la barrière hémato-encéphalique empêche l’administration de médicaments potentiels pour plusieurs maladies du cerveau. Lors de la sonication, les microbulles injectées commencent à osciller et à induire une tension sur la paroi des vaisseaux, ouvrant des jonctions serrées et permettant éventuellement aux médicaments de traverser la barrière hémato-encéphalique Dans les modèles précliniques, l’effet du traitement par ultrasons et microbulles est souvent étudié par imagerie par résonance magnétique améliorée par contraste ou en étudiant l’extravasation des colorants ex vivo.L’inconvénient de cette approche est que la réponse en temps réel pendant et immédiatement après l’exposition aux ultrasons ne peut pas être acquise. L’imagerie multiphotonique intravitale du cerveau donne l’occasion d’étudier ces effets en temps réel. Dans la vidéo suivante, nous présenterons des instructions par étapes sur la façon de placer une fenêtre crânienne dans une souris et d’effectuer un traitement par microbulles à ultrasons à l’aide d’un transducteur annulaire monté sur le crâne.Cette procédure permet la sonication simultanée et l’imagerie multiphotonique in vivo. Pour commencer, préparez le matériel nécessaire à la chirurgie de la fenêtre crânienne et aux traitements par microbulles à ultrasons. Dans cette vidéo, nous montrons une chirurgie aiguë de la fenêtre crânienne sans récupération.Pour la chirurgie de la fenêtre crânienne de récupération chronique, des outils et des matériaux stérilisés, un espace chirurgical stérile et des médicaments appropriés sont nécessaires. Avant la chirurgie administrer l’anesthésie et l’analgésie. Retirez la fourrure sur la tête.Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique. Insérez un cathéter dans la veine caudale pour les injections de dextran et de microbulles. Maintenez la température centrale de l’animal de 37 degrés en utilisant une source de chaleur.Ici, nous utilisons un gant rempli d’eau tiède. Pour enlever le cuir chevelu, soulevez la peau entre les yeux à l’aide d’une pince et coupez le long de la suture sagittale. Retirez le périoste recouvrant la surface externe du crâne avec un coton-tige.Ensuite, marquez l’emplacement souhaité de la fenêtre crânienne sur le crâne et commencez à forer le long du contour. Pour éviter que le crâne ne surchauffe pendant le forage, égouttez une solution saline sur le crâne à l’aide d’une seringue ou appliquez un morceau d’éponge chirurgicale imbibé d’une solution saline. Alternez entre le perçage et le refroidissement du crâne.Vérifiez la progression du forage en appliquant une légère pression sur l’îlot osseux. Retirez l’îlot osseux à l’aide d’une pince. Assurez-vous que le cerveau est maintenu humide en utilisant un morceau d’éponge chirurgicale qui a été pré-trempé dans une solution saline.Pour placer une fenêtre crânienne, placez une goutte de solution saline sur un côté d’un couvercle et manœuvrez-la sur le trou dans le crâne. Étalez une couche de colle autour du périmètre de la lèvre de couverture pour l’attacher au crâne. Une fois la colle complètement sèche, déposez la solution d’agarose sur la fenêtre et placez le transducteur sur le dessus.Appliquez une pression ferme de telle sorte qu’il y ait un minimum d’agarose entre le transducteur et la fenêtre crânienne. Lorsque l’agarose a refroidi à une consistance semblable à celle de Jell-O, coupez l’excès d’agarose des circonférences du couvercle du transducteur. Étalez une couche de colle le long des circonférences de la glissière de couverture du transducteur pour l’adhérer au crâne.Une fois la colle complètement séchée, placez l’animal sous la lentille de l’objectif du microscope. Assurez-vous que l’objectif n’entre pas en collision avec le transducteur ou le couvercle. Sélectionnez un champ de vision dans le microscope multiphotonique.Configurez une imagerie de la vascularisation et commencez la sonication. Pour ce protocole, nous utilisons un transducteur annulaire qui fonctionne à une fréquence d’entraînement de 0,82 mégahertz, des cycles de 10 millisecondes indexés mécaniquement de 0,2 à 0,4 et des fréquences de répétition d’impulsions entre un et quatre Hertz. Les microbulles sonovue sont injectées à une dose d’un millilitre par kilogramme.Les traitements par microbulles échographiques réussis peuvent être détectés par l’extravasation du dextran fluorescent de l’espace intravasculaire à l’espace extravasculaire, indiquant une augmentation de la perméabilité à la BHE. Pour évaluer la cinétique des fuites de dextran en tant que modèle représentatif de l’administration de médicaments, l’intensité du signal entre les espaces intra et extravasculaire peut être évaluée à l’aide d’outils tels que MATLAB. Pour évaluer les changements vasculaires induits par les traitements par microbulles à ultrasons, le diamètre du vaisseau d’intérêt peut être mesuré avant, pendant et après le traitement par microbulles échographiques.L’analyse d’images peut être effectuée à l’aide de logiciels tels que ImageJ, FIJI ou d’outils de programmation. Ici, Imaris a été utilisé pour la segmentation et la classification des vaisseaux sanguins. La microscopie multiphotonique intravitale du cerveau combinée à des transducteurs annulaires fournit une méthode pour surveiller les effets induits par le traitement par microbulles ultrasonores en temps réel à une résolution spatiale et temporelle élevée.Des données quantitatives et qualitatives peuvent être obtenues pour étudier, par exemple, la cinétique d’extravasation et les changements vasculaires. La méthode expérimentale présentée ici peut être appliquée à plusieurs modèles de recherche et à diverses applications échographiques.

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Microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (Vidéo) | JoVE Journal

Microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique

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