Microscopie multiphotonique intravitale en temps réel pour visualiser les traitements par ultrasons focalisés et par microbulles afin d’augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique

L’exposition aux ultrasons en présence de microbulles est apparue comme une méthode efficace pour augmenter transitoirement et localement la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. Normalement, la barrière hémato-encéphalique empêche l’administration de médicaments potentiels pour plusieurs maladies du cerveau. Lors de la sonication, les microbulles injectées commencent à osciller et à induire une tension sur la paroi des vaisseaux, ouvrant des jonctions serrées et permettant éventuellement aux médicaments de traverser la barrière hémato-encéphalique Dans les modèles précliniques, l’effet du traitement par ultrasons et microbulles est souvent étudié par imagerie par résonance magnétique améliorée par contraste ou en étudiant l’extravasation des colorants ex vivo.

L’inconvénient de cette approche est que la réponse en temps réel pendant et immédiatement après l’exposition aux ultrasons ne peut pas être acquise. L’imagerie multiphotonique intravitale du cerveau donne l’occasion d’étudier ces effets en temps réel. Dans la vidéo suivante, nous présenterons des instructions par étapes sur la façon de placer une fenêtre crânienne dans une souris et d’effectuer un traitement par microbulles à ultrasons à l’aide d’un transducteur annulaire monté sur le crâne.

Cette procédure permet la sonication simultanée et l’imagerie multiphotonique in vivo. Pour commencer, préparez le matériel nécessaire à la chirurgie de la fenêtre crânienne et aux traitements par microbulles à ultrasons. Dans cette vidéo, nous montrons une chirurgie aiguë de la fenêtre crânienne sans récupération.

Pour la chirurgie de la fenêtre crânienne de récupération chronique, des outils et des matériaux stérilisés, un espace chirurgical stérile et des médicaments appropriés sont nécessaires. Avant la chirurgie administrer l’anesthésie et l’analgésie. Retirez la fourrure sur la tête.

Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique. Insérez un cathéter dans la veine caudale pour les injections de dextran et de microbulles. Maintenez la température centrale de l’animal de 37 degrés en utilisant une source de chaleur.

Ici, nous utilisons un gant rempli d’eau tiède. Pour enlever le cuir chevelu, soulevez la peau entre les yeux à l’aide d’une pince et coupez le long de la suture sagittale. Retirez le périoste recouvrant la surface externe du crâne avec un coton-tige.

Ensuite, marquez l’emplacement souhaité de la fenêtre crânienne sur le crâne et commencez à forer le long du contour. Pour éviter que le crâne ne surchauffe pendant le forage, égouttez une solution saline sur le crâne à l’aide d’une seringue ou appliquez un morceau d’éponge chirurgicale imbibé d’une solution saline. Alternez entre le perçage et le refroidissement du crâne.

Vérifiez la progression du forage en appliquant une légère pression sur l’îlot osseux. Retirez l’îlot osseux à l’aide d’une pince. Assurez-vous que le cerveau est maintenu humide en utilisant un morceau d’éponge chirurgicale qui a été pré-trempé dans une solution saline.

Pour placer une fenêtre crânienne, placez une goutte de solution saline sur un côté d’un couvercle et manœuvrez-la sur le trou dans le crâne. Étalez une couche de colle autour du périmètre de la lèvre de couverture pour l’attacher au crâne. Une fois la colle complètement sèche, déposez la solution d’agarose sur la fenêtre et placez le transducteur sur le dessus.

Appliquez une pression ferme de telle sorte qu’il y ait un minimum d’agarose entre le transducteur et la fenêtre crânienne. Lorsque l’agarose a refroidi à une consistance semblable à celle de Jell-O, coupez l’excès d’agarose des circonférences du couvercle du transducteur. Étalez une couche de colle le long des circonférences de la glissière de couverture du transducteur pour l’adhérer au crâne.

Une fois la colle complètement séchée, placez l’animal sous la lentille de l’objectif du microscope. Assurez-vous que l’objectif n’entre pas en collision avec le transducteur ou le couvercle. Sélectionnez un champ de vision dans le microscope multiphotonique.

Configurez une imagerie de la vascularisation et commencez la sonication. Pour ce protocole, nous utilisons un transducteur annulaire qui fonctionne à une fréquence d’entraînement de 0,82 mégahertz, des cycles de 10 millisecondes indexés mécaniquement de 0,2 à 0,4 et des fréquences de répétition d’impulsions entre un et quatre Hertz. Les microbulles sonovue sont injectées à une dose d’un millilitre par kilogramme.

Les traitements par microbulles échographiques réussis peuvent être détectés par l’extravasation du dextran fluorescent de l’espace intravasculaire à l’espace extravasculaire, indiquant une augmentation de la perméabilité à la BHE. Pour évaluer la cinétique des fuites de dextran en tant que modèle représentatif de l’administration de médicaments, l’intensité du signal entre les espaces intra et extravasculaire peut être évaluée à l’aide d’outils tels que MATLAB. Pour évaluer les changements vasculaires induits par les traitements par microbulles à ultrasons, le diamètre du vaisseau d’intérêt peut être mesuré avant, pendant et après le traitement par microbulles échographiques.

L’analyse d’images peut être effectuée à l’aide de logiciels tels que ImageJ, FIJI ou d’outils de programmation. Ici, Imaris a été utilisé pour la segmentation et la classification des vaisseaux sanguins. La microscopie multiphotonique intravitale du cerveau combinée à des transducteurs annulaires fournit une méthode pour surveiller les effets induits par le traitement par microbulles ultrasonores en temps réel à une résolution spatiale et temporelle élevée.

Des données quantitatives et qualitatives peuvent être obtenues pour étudier, par exemple, la cinétique d’extravasation et les changements vasculaires. La méthode expérimentale présentée ici peut être appliquée à plusieurs modèles de recherche et à diverses applications échographiques.