Name: Criblages de toxicité dans les organoïdes rétiniens humains pour la découverte pharmaceutique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Découvrez un protocole de criblage de toxicité dans des organoïdes rétiniens humains matures pour la découverte de traitements contre la maculopathie telangiectasique de type 2. Cette méthode permet d'évaluer l'efficacité de molécules comme le fénofibrate.

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Soutenu par le Lowy Medical Research Institute. Nous tenons à remercier la famille Lowy pour son soutien au projet MacTel. Nous tenons à remercier Mari Gantner, Mike Dorrell et Lea Scheppke pour leur contribution intellectuelle et leur aide à la préparation du manuscrit.

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<li>Othman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fenofibrate+lowers+atypical+sphingolipids+in+plasma+of+dyslipidemic+patients%3A+A+novel+approach+for+treating+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy.</a> Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).</li>
<li>Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+highly+enriched+populations+of+optic+vesicle-like+retinal+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+three-dimensional+retinal+tissue+with+functional+photoreceptors+from+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs.</a> Nature Communication. 5, 4047(2014).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Wahlin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+outer+segment-like+structures+in+long-term+3D+retinas+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells.</a> Science Reports. 7 (1), 766(2017).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+system+for+effective+derivation+of+three-dimensional+retinal+tissue+via+Wnt+signaling+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation.</a> Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).</li>
<li>Ovando-Roche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bioreactors+for+culturing+human+retinal+organoids+improves+photoreceptor+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+Therapy%22%5BJournal%5D)">Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields.</a> Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156(2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Variations du protocole de différenciation Depuis l’invention des cupules optiques autoformées par le groupe20 de Yoshiki Sasai, de nombreux laboratoires ont développé des protocoles pour générer des organoïdes rétiniens qui peuvent varier à presque chaque étape 5,18,19,21. Une liste exhaustive des protocoles peut être trouvée dans Capowski et <sup cl...

La modélisation des maladies humaines dans des cultures cellulaires et des modèles animaux a fourni des outils inestimables pour la découverte, la modification et la validation de thérapies pharmacologiques, leur permettant de passer d’un médicament candidat à un traitement approuvé. Bien qu’une combinaison de modèles in vitro et non humains in vivo soit depuis longtemps un élément essentiel du pipeline de développement de médicaments, ils échouent souvent à prédire les performances cliniques des nouveaux candidatsmédicaments 1. Il existe un besoin évident de développer des technologies qui comblent le fossé entre les monocultures cellulaires humaines simplistes et les essais cliniques. Les progrès technologiques récents dans les cultures tissulaires tridimensionnelles auto-organisées, les organoïdes, ont amélioré leur fidélité aux tissus qu’ils modélisent, ce qui en fait des outils prometteurs dans le pipeline de développement de médicaments précliniques2.
Un avantage majeur de la culture cellulaire humaine par rapport aux modèles in vivo non humains est la capacité de reproduire les subtilités spécifiques du métabolisme humain qui peuvent varier considérablement même entre des vertébrés d’ordre supérieur tels que les humains et les souris3. Cependant, cette spécificité peut être éclipsée par une perte de complexité tissulaire; C’est le cas du tissu rétinien où plusieurs types de cellules sont étroitement entrelacés et ont une interaction métabolique symbiotique unique entre les sous-types cellulaires qui ne peuvent pas être reproduits dans une monoculture4. Les organoïdes humains, qui fournissent un fac-similé de tissus humains complexes avec l’accessibilité et l’évolutivité de la culture cellulaire, ont le potentiel de surmonter les lacunes de ces plateformes de modélisation des maladies.
Les organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches se sont révélés particulièrement fidèles dans la modélisation du tissu complexe de la rétine neurale humaine5. Cela a fait du modèle organoïde rétinien une technologie prometteuse pour l’étude et le traitement des maladies rétiniennes 6,7. À ce jour, une grande partie de la modélisation de la maladie dans les organoïdes rétiniens s’est concentrée sur les maladies rétiniennes monogéniques où les organoïdes rétiniens sont dérivés de lignées iPSC avec des variantes génétiques causant la maladie7. Ce sont généralement des mutations très pénétrantes qui se manifestent par des phénotypes développementaux. Moins de travail a été fait efficacement sur les maladies du vieillissement où les mutations génétiques et les facteurs de stress environnementaux ont un impact sur les tissus qui se sont développés normalement. Les maladies neurodégénératives du vieillissement peuvent avoir un héritage génétique complexe et des contributions de facteurs de stress environnementaux qui sont intrinsèquement difficiles à modéliser à l’aide de cultures cellulaires à court terme. Cependant, dans de nombreux cas, ces maladies complexes peuvent fusionner sur des facteurs de stress cellulaires ou métaboliques communs qui, lorsqu’ils sont testés sur un tissu humain pleinement développé, peuvent fournir des informations puissantes sur les maladies neurodégénératives du vieillissement8.
La maladie dégénérative maculaire tardive, la télangiectasie maculaire de type II (MacTel), est un excellent exemple d’une maladie neurodégénérative génétiquement complexe qui fusionne sur un défaut métabolique commun. MacTel est une maladie dégénérative rétinienne rare du vieillissement qui entraîne une perte de photorécepteur et de glie de Müller dans la macula, entraînant une perte progressive de la vision centrale 9,10,11,12,13. Chez MacTel, un héritage génétique indéterminé, peut-être multifactoriel, entraîne une réduction commune de la sérine circulante chez les patients, ce qui entraîne une augmentation d’une espèce lipidique neurotoxique appelée désoxysphingolipides (deoxySL)14,15. Pour prouver que l’accumulation de deoxySL est toxique pour la rétine et pour valider les thérapies pharmaceutiques potentielles, nous avons développé ce protocole pour tester la toxicité des photorécepteurs dans les organoïdes rétiniens humains14.
Nous décrivons ici un protocole spécifique pour différencier les organoïdes rétiniens humains, établir un test de toxicité et de sauvetage à l’aide d’organoïdes et quantifier les résultats. Nous fournissons un exemple réussi où nous déterminons la toxicité spécifique aux tissus d’un agent pathogène soupçonné, le désoxySL, et validons l’utilisation d’un médicament générique sûr, le fénofibrate, pour le traitement potentiel de la toxicité rétinienne induite par le désoxySL. Des travaux antérieurs ont montré que le fénofibrate peut augmenter la dégradation du désoxySL et réduire le désoxySL circulant chez les patients, cependant, son efficacité dans la réduction de la toxicité rétinienne induite par le désoxySL n’a pas été testée16,17. Bien que nous présentions un exemple spécifique, ce protocole peut être utilisé pour évaluer l’effet d’un certain nombre de facteurs de stress métaboliques / environnementaux et de médicaments thérapeutiques potentiels sur le tissu rétinien.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>125 ml Erlenmeyer Flacons</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>1-désoxysphinganine</td><td>Avanti</td><td>860493</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplément, moins vitamine A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Beaver 6900 Mini-Blade</td><td>Beaver-Visitec</td><td>BEAVER6900</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Saccharose</td><td>VWR</td><td>97061-432</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo-fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, poudre</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose, pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>Âne anti-lapin Ig-G, Alexa Fluor plus 555</td><td>Thermo-fisher</td><td>A32794</td><td></td></tr><tr><td>sérum</td> <td>d’âneSigma</td><td>D9663-10ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, Corning</td><td></td><td>45001-108</td><td></td></tr><tr><td>Fénofibrate</td><td>Sigma</td><td>F6020</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>Kit de détection de mort cellulaire in situ, Fluorescin</td><td>Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, facteur de croissance réduit</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplément</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16 % Formaldéhyde</td><td>Thermo-fisher</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Recoverin pour lapin</td><td>Millipore</td><td>AB5585</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Sigma</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Unités de filtre à vide jetables stériles</td><td>MilliporeSigma</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus- Composé O.C.T.</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>EMS</td><td>62534-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Fixation ultra-basse Plaques 6 puits Corning</td><td></td><td>29443-030</td><td></td></tr><tr><td>Fixation ultra-basse 75cm2 U-Flask</td><td>Corning</td><td>3814</td><td></td></tr><tr><td>Système de filtration sous vide</td><td>VWR</td><td>10040-436</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield-mount</td><td>medium vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>stylo à cire-ImmEdge</td><td>vector Labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dichlorhydrate (inhibiteur de roche)</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td></td></tr></tbody></table>

criblages de toxicité dans les organoïdes rétiniens humains pour la découverte pharmaceutique

Toxicity Screens in Human Retinal Organoids for Pharmaceutical Discovery

Les organoïdes fournissent une plate-forme prometteuse pour étudier le mécanisme et les traitements de la maladie, directement dans le contexte des tissus humains avec la polyvalence et le débit de la culture cellulaire. Les organoïdes rétiniens humains matures sont utilisés pour dépister les traitements pharmaceutiques potentiels pour la maladie dégénérative rétinienne liée à l’âge télangiectasie maculaire de type 2 (MacTel).
Nous avons récemment montré que MacTel peut être causé par des niveaux élevés d’une espèce lipidique atypique, les désoxysphingolipides (deoxySLs). Ces lipides sont toxiques pour la rétine et peuvent entraîner la perte de photorécepteurs qui se produit chez les patients MacTel. Pour dépister la capacité des médicaments à prévenir la toxicité des photorécepteurs du désoxySL, nous avons généré des organoïdes rétiniens humains à partir d’une lignée de cellules souches pluripotentes non induites par MacTel (CSPi) et les avons mûris jusqu’à un âge post-mitotique où ils développent toutes les cellules dérivées de la lignée neuronale de la rétine, y compris les photorécepteurs fonctionnellement matures. Les organoïdes rétiniens ont été traités avec un métabolite deoxySL et l’apoptose a été mesurée dans la couche photoréceptrice par immunohistochimie. À l’aide de ce modèle de toxicité, des composés pharmacologiques qui empêchent la mort des photorécepteurs induite par le désoxySL ont été examinés. À l’aide d’une approche candidate ciblée, nous avons déterminé que le fénofibrate, un médicament couramment prescrit pour le traitement de l’hypercholestérolémie et des triglycérides, peut également prévenir la toxicité du désoxySL dans les cellules de la rétine.
L’écran de toxicité a permis d’identifier avec succès un médicament approuvé par la FDA qui peut prévenir la mort des photorécepteurs. Il s’agit d’une découverte directement exploitable en raison du modèle hautement pertinent pour la maladie testé. Cette plateforme peut être facilement modifiée pour tester un certain nombre de facteurs de stress métaboliques et d’interventions pharmacologiques potentielles pour la découverte de futurs traitements dans les maladies de la rétine.

Les organoïdes rétiniens ont été générés à partir d’une lignée iPSC non témoin MacTel. Après que les organoïdes aient atteint 26 semaines en culture, ils ont été sélectionnés et divisés en groupes expérimentaux. Les organoïdes ont été traités avec des concentrations variables de désoxySA pour déterminer si le désoxySA est toxique pour les photorécepteurs. Quatre concentrations de désoxySA ont été testées, de 0 à 1 μM (Figure 2) et les organoïdes ont été traités pendant 8 jours, avec des chan...

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour générer des organoïdes rétiniens humains matures et les utiliser dans un test de toxicité des photorécepteurs afin d’identifier des candidats pharmaceutiques pour la maladie dégénérative rétinienne liée à l’âge, la télangiectasie maculaire de type 2 (MacTel).

Criblages de toxicité dans les organoïdes rétiniens humains pour la découverte pharmaceutique

Organoids provide a promising platform to study disease mechanism and treatments, directly in the context of human tissue with the versatility and ...

Ce protocole fournit une approche préclinique pour découvrir et valider des traitements pharmaceutiques pour les maladies métaboliques de la rétine directement dans le tissu rétinien humain. Cette technique combine la complexité du métabolisme dans les tissus humains avec la polyvalence et le débit de la culture cellulaire. Nous avons utilisé ce test pour acquérir des données précliniques pour le traitement de la maladie dégénérative rétinienne, MacTel, en utilisant un médicament modifiant les lipides commun et sûr, le fénofibrate, qui fait actuellement l’objet d’essais cliniques d’innocuité.Cette approche peut être appliquée à un certain nombre de facteurs de stress rétiniens courants qui conduisent à la maladie, y compris la carence en nutriments, l’hypoxie, la toxicité de la lumière et d’autres lipides toxiques. À la semaine 24 de culture, vérifier la formation de segments rudimentaires sur les organoïdes sur les organoïdes. À la semaine 26 à 28, les segments extérieurs devraient avoir formé une couche épaisse.Lorsqu’un segment sceptique épaissi peut être observé, diluer une solution mère de désoxySA millimolaire à 0,51. Concentrations micromolaires d’un et deux micromolaires dans trois millilitres de milieu de différenciation rétinienne plus. À l’aide d’un microscope à dissection et d’une sonde stérile, sélectionner quatre groupes d’organoïdes de taille et de forme approximativement identiques avec un minimum de cinq organoïdes par groupe, et diviser les groupes en puits individuels d’une plaque à 6 puits à très faible attache.Lorsque tous les organoïdes ont été recueillis, retirer autant de milieu que possible de chaque puits et ajouter une concentration de la solution de désoxySA à chaque puits. Ajouter la commande du véhicule au quatrième groupe d’organoïdes. Après deux jours de culture, remplacer les surnageants de culture par la dilution de désoxySA fraîche ou de contrôle appropriée.Après quatre jours de culture, intégrer la section cryogénique et colorer les organoïdes selon les protocoles standard pour permettre l’évaluation de la mort cellulaire dans chaque culture. Après coloration, utilisez un grossissement de cinq à 10x pour localiser une région de la section organoïde tranchée qui est intacte, bien formée et dans un plan qui échantillonne une section efficace représentative de l’organoïde. La section devrait avoir une couche nucléaire externe distincte de photorécepteurs d’au moins quelques cellules d’épaisseur, et une couche séparée et distincte de noyaux qui n’ont pas de récupération et de coloration.Cadrez l’image et augmentez l’agrandissement à 20x. Ensuite, cadrez à nouveau la diapositive pour remplir l’image avec autant de couche photoréceptrice que possible. Définissez le plan Z et définissez les limites inférieures supérieures de la plage Z pour imager toute la profondeur de la tranche.Ensuite, imagez les trois canaux de fluorophore dans une acquisition Z-stack et enregistrez l’image dans un format de fichier qui préserve le rapport de surface par pixel. Pour quantifier le nombre de cellules mortes dans chaque échantillon, ouvrez les piles d’images aux Fidji. Dans la fenêtre des options d’importation du format bio, vérifiez qu’aucune case sous la section Diviser en fenêtres distinctes n’est cochée et sélectionnez Projet Image, Piles et Z pour créer une nouvelle image à quantifier.Sélectionnez le canal d’image qui montre la récupération et la coloration et utilisez l’outil de sélection de polygones pour définir une région continue de photorécepteurs dans l’image. Cliquez sur Analyser et définir les mesures, puis cochez la case Zone. Cliquez sur Analyser et mesurer pour mesurer la surface des photorécepteurs et compter les cellules mourantes.La mesure apparaîtra dans une fenêtre pop-up. Pour compter les noyaux positifs à l’apoptose dans la région photoréceptrice sélectionnée, cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’outil point pour sélectionner l’outil multipoint et sélectionner la coloration positive à l’apoptose qui chevauche un noyau positif DAPI et récupérer et colorer. Basculez entre les canaux pour valider les cellules positives.Divisez ensuite le nombre de cellules apoptoses positives par la zone pour obtenir une valeur normalisée de la mort cellulaire dans les photorécepteurs par organoïde. Après avoir déterminé la concentration de deoxySA qui induit la mort cellulaire cible, utilisez une sonde stérile pour sélectionner trois groupes d’organoïdes de taille et de forme approximativement identiques avec un minimum de cinq organoïdes par groupe. Et ajoutez les groupes aux puits individuels d’une plaque de 6 puits à attachement ultra-bas.Ajouter la concentration de mort cellulaire cible de la désoxySA, la concentration de mort cellulaire cible de la désoxySA complétée par le médicament d’intérêt ou le milieu témoin au puits ou aux organoïdes appropriés. Après deux jours, remplacer le surnageant dans chaque puits par la concentration appropriée de traitement frais ou de milieu témoin. Après quatre jours de culture, évaluer les cultures pour la mort cellulaire comme démontré.Dans cette analyse représentative, des organoïdes rétiniens générés à partir d’une lignée de cellules souches pluripotentes induites par télangiectasie non maculaire de type 2 ont été traités avec quatre concentrations de deoxySA. La mort cellulaire en réponse à la désoxySA dépendait de la concentration et était détectable dans aussi peu que 50 nanomolaires de désoxySA. La concentration la plus élevée testée a induit une mort cellulaire robuste tout en maintenant l’intégrité de l’organoïde rétinien.Le traitement par 20 micromolaires fénofibrate a empêché la toxicité induite par la désoxySA dans les photorécepteurs des organoïdes rétiniens, réduisant considérablement la mort cellulaire d’environ 80% après quatre jours de traitement. N’oubliez pas de sélectionner des organoïdes bien formés et sains pour vous assurer que le test est effectué dans les cellules rétiniennes. Les organoïdes peuvent être traités pour la collecte d’ARN afin de quantifier l’expression des gènes, ce qui permet l’évaluation des signaux de stress et la validation des effets toxiques et des sauvetages.En utilisant cette technique, nous avons pu tester le métabolisme en aval de plusieurs lipides différents dans les organoïdes, ouvrant ainsi l’étude du métabolisme des lipides dans les rétines humaines.

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Criblage de RNA inhibitrice petit haut débit est un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. Nous présentons ci-après, le développement et la validation des modèles d’exposition et des méthodes pour le criblage à haut débit de fluorure d’hydrogène et chloropicrine-cornée épithéliales lésion induite.

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Induction dirigée d’organoïdes rétiniens à partir de cellules souches pluripotentes humaines

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GENPLAT (Plateforme Enzyme GLBRC) est une plate-forme automatisée pour la découverte et l'optimisation des cocktails d'enzymes de dégradation de la biomasse. Il peut être adapté à plusieurs matières premières et des mélanges d'enzymes contenant de multiples composants.

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