Préparation de grille cryo-microscopique électronique pour des études résolues dans le temps à l’aide d’un nouveau système robotique, Spotiton

En utilisant le système robotique Spotiton, on peut mélanger et vitrifier une protéine d’intérêt avec un partenaire en interaction sur une grille de microscope électronique en aussi peu que 90 millisecondes. Ce protocole permet la capture de confirmations de protéines intermédiaires qui sont trop transitoires pour être capturées par des techniques standard de préparation de grille. Spotiton à résolution temporelle peut informer des systèmes biologiques ou biochimiques inférieurs à la seconde tels que l’activation des canaux membranaires, la synthèse de l’ADN ou de l’ARN, ou l’interaction précoce d’un médicament ou d’un anticorps avec sa protéine cible.

L’utilisateur doit gérer simultanément plusieurs composants qui ont un impact direct sur la qualité d’une grille. Il est important de comprendre le système avant de l’utiliser et d’avoir de la patience lors de la préparation des grilles. Pour commencer, ouvrez la vanne principale du réservoir d’alimentation en azote et assurez-vous que le réservoir du système est rempli d’eau ultrapure dégantée.

Allumez l’ordinateur et le système Spotiton au niveau de la multiprise multiprise. Cliquez sur l’icône du bureau pour ouvrir l’interface utilisateur du logiciel Spotiton. Dans le menu Outils, sélectionnez Initialiser les étapes pour initialiser et accueillir les robots à trois axes et l’assemblage rotatif de la tête du distributeur, en vous assurant que les extrémités du distributeur pointent vers le bas avant l’initialisation et le repérage.

Dans le menu principal, cliquez sur Aller en position de sécurité pour envoyer les robots en position de sécurité. Sous l’onglet Aspirer, sélectionnez Prime pour rincer les têtes du distributeur plusieurs fois avec de l’eau du réservoir. Continuez jusqu’à ce que deux courants d’eau ininterrompus puissent être vus émergeant des pointes.

Sous l’onglet Inspecter, envoyez la pointe un à la caméra d’inspection et testez l’eau de feu, en ajustant l’amplitude jusqu’à ce que des gouttelettes discrètes soient produites. Appuyez sur le bouton Enregistrer du moniteur supérieur de la caméra pour enregistrer une vidéo de tir de la pointe un. Envoyez le deuxième conseil à la caméra d’inspection.

Lisez la vidéo de la pointe un tirant dans le moniteur latéral droit en même temps que la pointe deux est allumée dans le moniteur supérieur de la caméra, correspondant au modèle de production de gouttelettes des deux distributeurs. Retirez la pince à épilez du support du robot de grille à l’aide de la clé Allen fournie. Sur une paillasse à proximité, positionnez un nanofil de grille d’essai côté vers le haut sur le bord du bloc de grille.

Saisissez soigneusement le bord de la grille et positionnez-le correctement dans la pince à épiler. Remontez ensuite la pince à épier. Dans l’onglet Cryo, cliquez sur Tip to Camera pour déplacer la pointe un dans le champ de vision de la caméra à chemin de plongée supérieur, en veillant à ce que Live soit sélectionné dans le moniteur supérieur de la caméra.

Allumez et réglez la lumière supérieure de la caméra. Positionnez l’embout un visible dans le moniteur supérieur de la caméra, en cliquant sur la souris dans le moniteur. Cliquez sur Grille à caméra pour positionner la grille devant la caméra supérieure, puis ajustez à nouveau la pointe d’une position si nécessaire.

Dans l’onglet Cryo, assurez-vous que Vitrified Grid n’est pas sélectionné, cliquez sur Queue Target, puis sur Plunge. Évaluez les images supérieures et inférieures pour confirmer que les distributeurs fonctionnent normalement. Diluer deux échantillons aux concentrations souhaitées avec un tampon approprié, idéalement en utilisant le même pour les deux, et remplir le bol de cryogène avec de l’azote liquide.

Plasma nettoyer trois à quatre grilles de nanofils en utilisant cinq watts d’hydrogène et d’oxygène, et 1,5 minute comme point de départ. Branchez le nébuliseur et observez la vapeur sortir de l’orifice central du bouchon du nébuliseur. Observez le moniteur d’humidité en direct dans la fenêtre principale ou ouvrez le suivi de l’humidité ambiante sous Rapports et Ambiant.

Vérifiez les niveaux d’humidité dans les zones de la chambre et du linceul. Ajouter cinq microlitres de chaque échantillon dans les gobelets d’échantillon. Chargez les gobelets d’échantillon dans le plateau de maintien avec un échantillon pour la pointe un à gauche et pour la pointe deux à droite.

Repoussez ensuite le plateau dans la machine jusqu’à ce qu’il s’épuise. Sous l’onglet Aspirer, sélectionnez trois microlitres pour le volume à aspirer par chaque embout. Assurez-vous que le plateau d’échantillonnage est bien installé, cliquez sur Aspirer et observez l’étage de la pipette déplacer les têtes du distributeur dans les gobelets d’échantillonnage.

Vérifier l’aspiration réussie des deux échantillons en retirant les gobelets d’échantillon et en observant une baisse des niveaux de liquide. Sous l’onglet Inspecter, envoyez chaque embout à la caméra d’inspection pour confirmer la distribution sans obstruction. Ajustez l’amplitude au besoin pour correspondre à la formation de gouttelettes à partir de chaque pointe.

Chargez une grille fraîchement nettoyée au plasma dans la pince à épiler, mais ne montez pas encore la pince à épiler. Assurez-vous que le niveau d’humidité est élevé à environ 90 à 95 % Remplissez la tasse d’éthane et effectuez un feu d’essai final des deux extrémités devant la caméra d’inspection, en confirmant l’absence d’obstruction. Dans l’onglet Cryo, cliquez sur Tip to Camera.

Vérifiez la tasse d’éthane. Si de la glace d’éthane s’est formée, fondez au besoin avec du gaz éthane supplémentaire. Montez la pince à épilez avec la grille sur la scène de la grille.

Dans l’onglet Cryo, cliquez sur Grille à caméra, en vous assurant que la pointe un est correctement positionnée dans le moniteur supérieur de la caméra. Cliquez sur Grille vitrifiée, Cible de la file d’attente, puis Plonger. Cliquez sur OK lorsque vous êtes invité à commander au robot de grille de sauter la grille de l’éthane dans l’azote liquide et de la libérer sur l’étagère immergée.

Examinez les images de la grille pour décider si elle doit être conservée ou jetée. Si vous gardez la grille, pré-refroidissez les pinces à pointe fine, saisissez doucement la grille par le bord et placez-la dans une fente de boîte à grille, en commençant par la première fente à gauche de l’encoche et dans le sens des aiguilles d’une montre. Utilisez la visionneuse d’expériences pour examiner et comparer les images de grille des caméras supérieure et inférieure, ainsi que les paramètres de la machine et les mesures d’humidité au moment du plongeon en sélectionnant Rapports et expérience.

Des images de grilles préparées au cours d’une seule session Spotiton résolue dans le temps en mélangeant de l’ARN polymérase dans un oligomère d’ADN de 105 paires de bases portant une séquence promotrice pendant 150 millisecondes avant la vitrification sont montrées ici. Sur les six grilles, une seule montre une mèche sous-optimale. Le motif de dépôt de glace sur une grille vitrifiée correspond étroitement au motif du liquide déposé vu dans l’image supérieure de la caméra.

L’évacuation efficace des échantillons mélangés se produit le long des barres de grille recouvertes de nanofils où l’échantillon déborde rarement en carrés adjacents à ceux dans lesquels il a atterri. Dans les carrés remplis de glace, la glace est généralement plus épaisse dans les trous au centre du carré et devient plus mince dans les trous plus proches des barres de grille. Les trous immédiatement adjacents aux barres de grille sont souvent vides, en raison de la proximité des nanofils.

Une préparation et une manipulation appropriées des grilles de nanofils assureront une bonne épaisseur de glace sur des grilles d’échantillons mixtes. Le système Spotiton permet également à l’utilisateur de déposer les deux échantillons séparément sur une seule grille, ce qui permet de préséancer un contrôle non mélangé au cours de la même session de maintenance du réseau. Spotiton a permis la capture des premiers intermédiaires dans l’expression des gènes bactériens en temps réel.

Parce qu’ils se forment sur une échelle de temps inférieure à la seconde, leurs structures étaient inconnues jusqu’à présent.