Isolement des hépatocytes primaires de rat avec contrôle de perfusion multiparamétrique

Ce protocole d’isolement des hépatocytes de rat est basé sur la résection hépatique avant l’approche de digestion. Le protocole introduit un système de perfusion intégré compact et portable pour l’isolation cellulaire. Cette technique implique la recirculation de la collagénase qui réduit le volume d’utilisation de la collagénase et offre plus de flexibilité dans l’extension du temps de digestion tout en assurant un rendement gravitationnel élevé et une fonction spécifique aux hépatocytes.

Mettez le rat dans le capot. Après avoir coupé les muscles abdominaux, poussez les intestins vers la droite avec l’arrière de la pince incurvée. Cassez la membrane sous le canal biliaire avec la pointe de la pince incurvée pour boucler la suture autour de la veine porte et du canal biliaire.

Utilisez une suture chirurgicale en soie pour faire une ligature très lâche autour de la veine porte près du foie, juste avant que la veine ne se ramifie à gauche et à droite dans différents lobes du foie. Environ deux à trois centimètres en amont de la première ligature, juste avant que la veine gastrique ne se ramifie de la veine porte, créez un trou à travers le tissu sous la veine porte avec les extrémités de deux paires de pinces incurvées. Ensuite, étirez le trou pour soutenir la veine porte pendant la canulation.

Prévenir l’accumulation de pression dans le foie en réduisant la vitesse de la pompe à quatre tr / min pour un débit d’environ trois millilitres par minute. Et assurez-vous que l’écoulement du tampon sans calcium du cathéter intraveineux est réduit à un écoulement lent. Tout en soutenant doucement la veine porte avec une pince, tenez le cathéter intraveineux avec le biseau de l’aiguille vers le haut.

Et insérez l’aiguille dans la veine porte à un angle de 10 à 20 degrés. Avancez ensuite lentement jusqu’à ce que tout le biseau soit à l’intérieur de la veine. Une insertion correcte devrait entraîner un blanchiment de la couleur du foie.

Avancez la canule sur l’aiguille et rétractez l’aiguille derrière la canule en tirant l’aile vers l’arrière avec l’index tout en tenant le cathéter avec le pouce et le majeur. Fixez la veine porte sur le cathéter à l’aide d’un clip veineux et d’un clip sous la veine porte pour éviter toute perturbation du flux. Ensuite, coupez la veine cave inférieure infrahépatique pour empêcher l’accumulation de pression dans le foie et observez les impulsions de jaillissement de sang pour assurer la coupe correcte.

Augmentez la vitesse de la pompe à 38 tr/min pour un débit d’environ 33 millilitres par minute. Et rincez le foie trois fois en fermant la veine cave inférieure infrahépatique avec une pince pendant deux à trois secondes, puis en la rouvrant. Afin de perfuser tous les lobes du foie, ajustez la position de la pointe de la canule et assurez-vous qu’elle est placée avant que la veine porte ne se ramifie en différents lobes du foie.

Ensuite, resserrez la ligature lâche autour de la veine porte, légèrement en amont du point de ramification, et fixez la position de la canule dans la veine porte pour éviter le reflux du tampon en faisant trois nœuds au point où l’aiguille dure soutient la canule, entre le biseau et le trou latéral. Après la résection du foie, laissez le foie perfuser avec le tampon sans calcium pendant 12 minutes. Ensuite, serrez la pince à rouleaux du tampon sans calcium et desserrez la pince à rouleaux du tampon à collagénase pour changer le tampon de perfusion.

Une fois que le tampon de collagénase a atteint le foie, rincez le foie trois fois en fermant la veine cave inférieure suprahépatique pendant deux à trois secondes et en la rouvrant. Déplacez soigneusement le foie vers la scène située sur le dessus du bécher pour la recirculation du tampon de collagénase en tenant le diaphragme avec une pince tout en soutenant le cathéter, en prenant soin de ne pas tirer le cathéter pour éviter tout détachement accidentel. Digérez le foie pendant 12 minutes et arrêtez la perfusion lorsque le foie perd sa texture brune lisse et devient pâteux.

Prolongez le temps de digestion si nécessaire. Après la digestion du foie, coupez la veine porte, retirez soigneusement la canule. Et puis transférer le foie dans le DMEM froid pour isoler les hépatocytes.

Tapotez doucement le foie à l’aide de l’arrière de la pince incurvée pour casser et décoller la capsule scintillante. Et libérez les cellules du foie en balançant doucement le foie dans le DMEM jusqu’à ce que les cellules soient complètement dissociées dans le milieu. La viabilité des hépatocytes se situait entre 88 et 94,8 %, déterminée par le comptage des tripes et des bleus.

Le rendement en hépatocytes de rats pesant de 200 à 300 grammes était jusqu’à cinq fois 10 à la huitième cellule par isolement. Les images représentatives montrent une suspension de cellules hépatiques non purifiée et une suspension d’hépatocytes purifiée. La pureté des hépatocytes isolés était d’environ 96,8%, ce qui a été quantifié en comptant les cellules colorées fluorescentes positives à l’albumine par rapport au nombre total de noyaux cellulaires.

Dans les images représentatives montrées en fausse couleur, le vert représente l’albumine et le bleu indique les noyaux cellulaires avec l’albumine. Les noyaux cellulaires sans albumine sont surlignés en rouge. Les hépatocytes en culture sandwich formaient des canalicules biliaires distincts et avaient un bon contact cellulaire.

Comme le montrent les essais d’albumine, d’urée et de cytochrome P450, les hépatocytes présentaient une sécrétion élevée d’urée et d’albumine. Le troisième jour, les hépatocytes présentaient des activités enzymatiques élevées pour le CYP1A2, le CYP2B1/2 et le CYP3B2. Soyez mentalement préparé avant d’insérer l’aiguille dans la veine porte.

Lors de l’insertion, un chirurgien devra continuer sans impulsion jusqu’à ce que la vitesse de la pompe soit augmentée après avoir coupé la CIV.