Name: Production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Découvrez la production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR-Cas9 pour l'immunothérapie anticancéreuse. Ce protocole permet une édition génique multiplex efficace et la traduction clinique.

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Nous reconnaissons le noyau d’immunologie humaine pour la fourniture de cellules T de donneurs normaux et le noyau de cytométrie en flux à l’Université de Pennsylvanie.

Les lymphocytes T humains ont été obtenus par l’intermédiaire du noyau d’immunologie humaine de l’Université de Pennsylvanie, qui fonctionne selon les principes des bonnes pratiques de laboratoire avec des procédures opérationnelles standard établies et / ou des protocoles pour la réception, le traitement, la congélation et l’analyse des échantillons conformément aux directives éthiques de la MIATA et de l’Université de Pennsylvanie.
1. Production de vecteurs lentiviraux
REMARQUE: Les produits viraux ont été rendus défectueux de réplication par séparation des constructions d’emballage (Rev, gag / pol / RRE, VSVg et plasmide de transfert) en quatre plasmides distincts, réduisant considérablement la probabilité d’événements de recombinaison pouvant entraîner un virus capable de réplication.
<ol><li>Préparez les cellules HEK293T un jour avant la transfection. Plaquer environ 6 x 106 cellules dans des récipients de culture T150 dans 30 mL de milieux de culture standard (appelés R10:RPMI 1640 complétés par 10 % de sérum de veau fœtal, 10 mM HEPES, 1 % de stylo/streptocoque, 1 % de L-glutamine) et incuber pendant la nuit à 37 °C. 18-24 h plus tard, les cellules doivent être confluentes à 60-70 % et avoir l’air saines (projections dendritiques et distribution uniforme à travers la fiole). Si les cellules semblent saines, passez à l’étape 1.2.</li>
	<li>Préparer le mélange de transfection contenant le réactif de lipofection (96 μL), le pTRP gag/pol (lot# RR13SEP19A) (18 μg), pTRP RSV-Rev (lot# RR13SEP19B-3) (18 μg), pTRP VSVG (lot# RR13SEP19C) (7 μg) emballage plasmides et 15 μg de plasmide d’expression (CD19bbz scFv cloné dans pTRPE).<ol>
<li>Pour chaque réaction de transfection, préparer un tube contenant 1 mL de milieu essentiel minimal à sérum réduit plus les quatre plasmides décrits à l’étape 1.2 ainsi qu’un tube contenant 2 mL de milieu essentiel minimal à sérum réduit plus 90 μL de réactif de lipofection. Combiner ces deux solutions en ajoutant goutte à goutte le mélange de plasmides de 1 mL au mélange de réactifs de lipofection de 2 mL. Assurez-vous de mélanger vigoureusement la solution en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Incuber la solution pendant 15 min à température ambiante.</li>
		<li>Entre-temps, aspirer le milieu de la fiole cellulaire HEK293T et laver doucement les cellules avec 10 mL de milieux essentiels minimaux à sérum réduit et aspirer à nouveau.</li>
		<li>Ajouter doucement le mélange de transfection (3 mL) de l’étape 1.2.1 au coin inférieur de la fiole de culture cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL. Inclinez doucement la fiole pour répartir uniformément le mélange de transfection dans la fiole de culture cellulaire et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Assurez-vous de ne pas déranger la monocouche cellulaire. Après une incubation de 10 min, ajouter 35 mL de milieu R10 et remettre la fiole dans l’incubateur pendant 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après 24 h, prélever le surnageant dans les flacons de culture cellulaire HEK293T et le transférer dans des tubes coniques de 50 mL. Ajoutez du R10 frais aux cellules HEK29T et remettez les cellules dans l’incubateur pendant encore 24 heures. Faites tourner le surnageant (300 x g) pour éliminer les débris cellulaires et filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,45 μm.</li>
	<li>Concentrer le filtrat de l’étape 1.3 par ultracentrifugation à grande vitesse (25 000 x g pendant 2,5 h ou 8000 x g pendant la nuit (O/N)). Conserver la pastille virale 24 h à 4 °C tout en mettant en commun le virus 48 h.</li>
	<li>Répétez les étapes 1.3 à 1.4 pour la collecte de 48 heures et combinez les collectes de virus de 24 h et de 48 h. Les granulés de la collecte de 48 h contiendront une récolte combinée du lentivirus.</li>
	<li>Remettre en vie la pastille virale dans environ 1 mL de R10 froid et aliquote dans des flacons de 100 μL. Congelez immédiatement les aliquotes à l’aide de glace carbonique et conservez-les à -80 °C.</li>
	<li>Calculer le titre viral fonctionnel dans les unités de transduction/mL en transduisant une quantité fixe de lymphocytes T humains primaires activés par des billes CD3/CD28 avec des dilutions en série du surnageant lentiviral. Mesurer la transduction CAR après 72 h par cytométrie en flux.<ol>
<li>Coloration pour le CAR dirigé par CD19 avec un anticorps anti-FCM63 scFv. Pour les autres récepteurs de l’antigène chimérique, colorez à l’aide d’une protéine recombinante fluorophore étiquetée qui est spécifique au CAR scFv. La dilution virale qui génère moins de 20% de cellules CAR positives par cytométrie en flux est la dilution la plus précise pour calculer le titre viral. Au-dessus de 20% de cellules CAR-positives, la probabilité que chaque cellule positive soit transduite deux fois augmente, ce qui entraîne une sous-estimation du nombre de particules transductrices. Calculer les unités de transduction par mL (TU/mL ) = (nombre de cellules transduies x pourcentage de cellules CAR positives x facteur de dilution)/(volume de transduction en mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Conception des sgRNA et perturbation des gènes dans les cellules T humaines primaires
<ol><li>Conception des sgRNA CRISPR REMARQUE: Plusieurs serveurs et programmes facilitent la conception d’ARNg spécifiques à la cible. Dans ce protocole, les sgRNA CRISPR ont été conçus à l’aide de CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no) et du portail de conception d’ARNg de l’institut Broad (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).<ol>
<li>Pour chaque gène cible, concevez six à dix séquences d’ARNs sgRNA pour cibler les séquences d’exons codantes précoces. REMARQUE: L’ARNg doit avoir une efficacité élevée sur la cible et une faible efficacité hors cible. Chaque algorithme d’apprentissage automatique pour déterminer l’efficacité de l’ARNg fonctionne légèrement différemment. Par conséquent, il est recommandé de comparer plusieurs outils de conception d’ARNg et d’organiser une liste de six à dix ARNs pour le dépistage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Perturbation des gènes dans les lymphocytes T humains primaires<ol>
<li>Obtenir des cellules mononucléaires autologues du sang périphérique (PBMC) auprès de donneurs volontaires sains. Une chronologie schématique du protocole est décrite à la figure 2A et décrite ci-dessous.</li>
		<li>Isolez leslymphocytes T CD4 + et CD8+ à l’aide de kits de sélection CD4 et CD8 disponibles dans le commerce.</li>
		<li>Combiner les lymphocytes T CD4+ et CD8+ à un rapport de 1:1 et incuber pendant la nuit à 3x106 cellules / mL dans R10 complété par 5 ng / mL huIL-7 et huIL-15 chacun. L’ajout d’IL-7 et d’IL-15 est recommandé car ils sont connus pour favoriser un phénotype de mémoire centrale et les cellules CAR-T élargies avec IL-7 et IL-15 ont une efficacité antitumorale supérieure à celle des cellules CAR-T expanséesIL-2 22,23,24.</li>
		<li>Le lendemain, comptez les lymphocytes T et centrifugez 5-10 x 106 cellules à 300 x g pendant 5 min. Jetez tout le surnageant et lavez la pastille cellulaire dans un milieu essentiel minimal à sérum réduit. Resuspendez la pastille dans 100 μL de solution de nucléofection conformément aux instructions du fabricant (Table des matériaux).</li>
		<li>Tout en lavant les cellules, préparez le complexe ribonucléoprotéique (RNP) avec Cas9 et aRNg en incubant 10 μg de nucléase Cas9 avec 5 μg d’ARNng pendant 10 min à température ambiante (RT). Le rapport molaire de Cas9 à l’ARNs sg est de 1:2,4. Un contrôle fictif contenant du Cas9 et un amplificateur d’électroporation, mais pas d’ARNg, est recommandé. REMARQUE: L’édition de gènes multiplex peut être effectuée à cette étape en fabriquant des complexes RNP pour chaque cible séparément et en les combinant avec des cellules au moment de la nucléofection, comme décrit à l’étape suivante. Le choix des réactifs pour assembler le complexe RNP est la clé pour obtenir une efficacité KO élevée. Par exemple, les nucléases Cas9 de différents fournisseurs ont des effets hors cible variables et l’ARNg modifié chimiquement diminue la toxicité pour les lymphocytes T, augmentant ainsi l’efficacité du KO.</li>
		<li>Combiner les cellules remises en suspension de l’étape 2.2.4 avec le complexe RNP de l’étape 2.2.5 et ajouter 4,2 μL d’amplificateur d’électroporation de 4 μM (oligonucléotide d’ADNSs qui n’est pas homologue au génome humain). Bien mélanger et transférer dans des cuvettes d’électroporation. Évitez les bulles car elles nuisent à l’efficacité de l’électroporation.</li>
		<li>Cellules électroporates utilisant le code d’impulsion EH111. Après électroporation, incuber les cellules en R10 complétées par 5 ng/mL huIL-7 et huIL-15 à 5x106 cellules/mL à 30 °C pendant 48 h dans des plaques à 12 puits. Après 48 h, procéder à l’activation et à l’expansion des lymphocytes T.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Activation des lymphocytes T, transduction et expansion lentivirales
REMARQUE: Pour le dépistage des ARNg, la transduction lentivirale (étape 3.2) de la construction CAR n’est pas nécessaire.
<ol><li>Compter les lymphocytes T électroporés et diluer à une concentration de 1 x 106 cellules/mL en utilisant du R10 chaud complété par 5 ng/mL huIL-7 et huIL-15. Activer les cellules en ajoutant des billes magnétiques recouvertes d’anticorps monoclonaux anti-CD3/anti-CD28 dans un rapport de 3 perles par cellule T vivante. REMARQUE: L’électroporation provoque une mort cellulaire importante entraînant environ 60% ± 15% de cellules viables par rapport aux cellules non électroporées. Utilisez un nombre de cellules vivantes/mortes pour déterminer la quantité appropriée de perles. Transférer les cellules à 37 °C et incuber pendant la nuit.</li>
	<li>Après une stimulation nocturne, transduire les lymphocytes T conçus par CRISPR avec un surnageant lentiviral à partir de l’étape 1. Ajouter le volume approprié en fonction du titre viral calculé à l’étape 1.7 pour obtenir une multiplicité d’infection (MOI) de 3 et incuber les cellules pendant 72 h à 37 °C. REMARQUE: La pastille de virus ressuspendée dans R10 est simplement ajoutée sur le dessus des cellules en fonction de la concentration cellulaire, du titre viral et de la MOI souhaitée.</li>
	<li>Après 72 h, les cellules d’alimentation avec 50% du volume de culture actuel R10 contenant 10 ng / mL huIL-7 et huIL-15 et les renvoyer à l’incubateur pendant encore 48 h. Ne pas déranger les amas qui se sont formés entre les lymphocytes T et les perles.</li>
	<li>Après 48 h, retirer les billes des cellules en resusmettant doucement le mélange cellule-bille suivi d’une séparation magnétique. Compter les cellules après l’enlèvement des billes et porter à une concentration de 0,8 x 106 cellules/mL en utilisant R10 complété par 5 ng/mL huIL-7 et huIL-15. Après le décrlage, le nombre de cellules doit être similaire au nombre de cellules du jour 1 avant l’électroporation(figure 2B).</li>
	<li>Après 24 h, compter les cellules et nourrir à une concentration de 1 x 106 cellules/mL avec R10 + 5 ng/mL huIL-7 et huIL-15. Répétez cette opération toutes les 24 heures jusqu’à ce que la cinétique de croissance et la taille des cellules démontrent que les cellules se sont reposées de la stimulation. REMARQUE: À partir de ce point, les lymphocytes T doublent environ toutes les 24h. Les lymphocytes T subissent généralement 5 à 7 doublements de population et ont un volume cellulaire d’environ 300 ± 50 fL au repos.</li>
	<li>Une fois reposés, faites tourner les cellules CAR-T conçues par CRISPR et ressuspendez-les dans des produits de congélation (1:1 X-Vivo et FBS plus 10% de DMSO) pour la cryoconservation. Les cellules CAR-T utilisées doivent être décongelées et reposées à 37 °C pendant 16 heures avant une expérience. REMARQUE: Conservez environ 10x106 cellules réservées à la mesure de l’efficacité knockout et de l’intégration CAR. Les doublons de population prévus et les changements de volume au cours de l’expansion ont été montrés à la figure 2B,2C. De plus, la figure 2D montre les niveaux d’expression de la CAR sur les cellules CAR-T simulées et modifiées par les gènes.</li>
</ol>4. Efficacité CRISPR
<ol><li>Extraction génomique de l’ADN et amplification des gènes cibles<ol>
<li>À partir de chaque culture de dépistage, faites tourner 3 à 5 x 106 lymphocytes T. Les cellules peuvent être congelées sous forme de granulés secs ou on peut procéder à l’extraction de l’ADN génomique. Au moment de l’extraction de l’ADN, resuspendez les granulés dans 200 μL de solution saline tampon de phosphate (PBS) et extrayez l’ADN génomique des cellules électroporées à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN standard conformément aux instructions du fabricant.<ol>
<li>En bref, lysez les cellules avec la protéinase K et chargez le lysate sur une colonne de liaison à l’ADN. Pendant la centrifugation, l’ADN se lie à la membrane tandis que les contaminants passent à travers. Après deux étapes de lavage pour éliminer les contaminants restants et les inhibiteurs enzymatiques, éluez l’ADN dans l’eau.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Amplifier 200 à 300 ng d’ADN génomique à l’aide d’un mélange PCR standard contenant de l’ADN polymérase, des protéines accessoires, des sels et des dNTP et des amorces avant et arrière de 10 μM flanquant la région de la rupture double brin prévue. REMARQUE: Pour la conception de l’amorce par PCR, la séquence génomique de référence (peut être trouvée à l’aide de http://www.ensemble.org) flanquant le site de coupe de l’ARNg est entrée dans l’outil de sablage de l’amorce NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). Les amorces de PCR doivent être conçues de manière à ce que l’amplicon ait une taille cible de 600 à 700 pb. Cette longueur permet de concevoir des amorces de séquençage qui se lient à l’intérieur de l’amplicon à une distance suffisante du site de coupe de l’ARNg (au moins 150 pb) pour assurer une bonne qualité de séquençage autour des indels induits par Cas9 (voir 4.2.1). Chaque ARNg nécessite une paire d’amorces unique, sauf si les sites de coupe de l’ARNg sont à proximité.</li>
		<li>Exécutez l’ensemble du produit PCR sur un gel d’agarose à 1% et purifiez l’amplicon à l’aide d’un kit de purification de gel d’agarose standard. REMARQUE: Le processus de détermination de la Tm optimale pour la PCR peut prendre plusieurs tours de dépannage. En effet, la séquence KO a des indels et le gène cible doit être amorcé pour le séquençage où il n’y aurait pas d’indels généralement à 100 pb en amont ou en aval du site de coupe. Cela peut varier considérablement en raison des indels résultant de l’assemblage final non homologue. La conception d’amorces de séquençage imbriquées aux amorces de PCR et l’augmentation de la concentration de produits séquencés peuvent éliminer les problèmes de séquençage.</li>
	</ol></li>
	<li>Séquençage et détection d’indel<ol>
<li>Concevez des amorces de séquençage qui se lient à l’amplicon purifié en gel et envoient des amplicons simulés et knockout pour le séquençage sanger. Une fois le séquençage terminé, téléchargez les fichiers de trace dans le logiciel Desktop Genetics (tide.deskgen.com, Desktop Genetics) pour l’analyse TIDE.<ol>
<li>Pour la conception de l’amorce de séquençage, entrez la séquence de l’amplicon PCR dans un logiciel de conception d’amorce standard (NCBI, Eurofins ou autres outils accessibles au public). Le logiciel de conception suggérera plusieurs séquences d’amorce adaptées au séquençage de sanger.</li>
			<li>Choisissez des amorces avant et arrière qui se lient dans l’amplicon au moins 150 pb en amont ou en aval du site de coupe de l’ARNg pour assurer une bonne qualité de séquençage autour des indels. Le chromatogramme de séquençage sera utilisé dans la section 4.2 pour l’analyse TIDE, il est donc important que la qualité du séquençage soit bonne pour une décomposition précise de l’indel (voir Hultquist et al.) 25.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utiliser l’analyse TIDE (Tracking of Indels by DEcomposition) pour détecter l’efficacité knock out (KO) au niveaugénomique 26. L’algorithme reconstruit avec précision le spectre des indels à partir des traces de séquence et calcule les valeurs R2, reflétant la qualité de l’ajustement après une modélisation linéaire non négative par le logiciel TIDE.</li>
	</ol></li>
	<li>Détection des protéines cibles<ol>
<li>Pour les gènes cibles dont le produit génétique est exprimé à la surface des lymphocytes T, colorez environ 1 x 10 5 cellules dechaque culture de dépistage avec un anticorps fluorochrome spécifique à la protéine cible. Comparer les niveaux d’expression de la protéine cible entre les groupes témoins simulés et knockout par cytométrie en flux comme le montre la figure 3A,3B.</li>
		<li>Pour les gènes cibles dont le produit génique est exprimé intracellulairement, lyser environ 3 x 106 millions de cellules par groupe de dépistage dans le tampon de lyse et suivre les protocoles standard pour SDS-PAGE et Western blotting. Alternativement, la cytométrie en flux de surface ou intracellulaire peut être utilisée pour sonder la protéine cible.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Surveillance des effets hors cible à l’aide d’iGUIDE - Préparation de la bibliothèque, séquençage et analyse de l’ADN
REMARQUE: La technique iGUIDE permet de détecter les emplacements du clivage guidé Par Cas9 et de quantifier les distributions de ces cassures double brin d’ADN.
<ol><li>Effectuer iGUIDE comme décrit par Nobles et al.21. Les effets hors cible de l’ARNg ciblant le locus du TRAC à l’aide de la technique iGUIDE ont été démontrés dans Stadtmauer et al, 202013.</li>
</ol>

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<li>Prlic, M., Lefrancois, L., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+choices%3A+regulation+of+memory+CD8+T+cell+generation+and+homeostasis+by+interleukin+%28IL%29-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple choices: regulation of memory CD8 T cell generation and homeostasis by interleukin (IL)-7 and IL-15.</a> The Journal of Experimental Medicine. 195 (12), 49-52 (2002).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+%28CAR-T%29+cells+expanded+with+IL-7%2FIL-15+mediate+superior+antitumor+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15 mediate superior antitumor effects.</a> Protein & Cell. 10 (10), 764-769 (2019).</li>
<li>Hultquist, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+genome+engineering+of+primary+CD4%2B+T+cells+for+the+interrogation+of+HIV-host+factor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4+ T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.</a> Nature Protocols. 14 (1), 1-27 (2019).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucune divulgation.

Nous décrivons ici des approches pour modifier les gènes des cellules CAR-T à l’aide de la technologie CRISPR Cas9 et fabriquons des produits pour tester davantage la fonction et l’efficacité. Le protocole ci-dessus a été optimisé pour effectuer l’édition de gènes CRIPSR dans des cellules T humaines primaires combinées à des cellules T d’ingénierie avec des récepteurs d’antigènes chimériques. Ce protocole permet une efficacité élevée de knockout avec une variabilité minimale de donneur à donneur. La modification à l’aide...

La thérapie cellulaire par récepteur de l’antigène chimérique (CAR)-T a révolutionné le domaine des thérapies cellulaires adoptives et de l’immunothérapie du cancer. Les cellules CAR-T sont des cellules T modifiées exprimant un récepteur immunitaire synthétique qui combine un fragment d’anticorps à chaîne unique spécifique à l’antigène avec des domaines de signalisation dérivés de la chaîne TCRzeta et des domaines costimulatoires nécessaires et suffisants pour l’activation et la co-stimulation des lymphocytes T1,2,3,4 . La fabrication de cellules CAR-T commence par l’extraction des propres cellules T du patient, suivie de la transduction virale ex vivo du module CAR et de l’expansion du produit des cellules CAR-T avec des billes magnétiques qui fonctionnent comme des cellules présentatrices d’antigènes artificiels5. Les cellules CAR-T expansées sont réinfusées dans le patient où elles peuvent se greffer, éliminer les cellules tumorales cibles et même persister pendant plusieurs années après la perfusion6,7,8. Bien que la thérapie par cellules CAR-T ait entraîné des taux de réponse remarquables dans les tumeurs malignes à cellules B, le succès clinique des tumeurs solides a été remis en question par de multiples facteurs, notamment une mauvaise infiltration des cellules T9,un microenvironnement tumoral immunosuppresseur10,la couverture et la spécificité de l’antigène et le dysfonctionnement des cellules CAR-T11,12 . Une autre limitation de la thérapie cellulaire CAR-T actuelle comprend l’utilisation de cellules T autologues. Après plusieurs cycles de chimiothérapie et une charge tumorale élevée, les cellules CAR-T peuvent être de mauvaise qualité par rapport aux produits CAR-T allogéniques de donneurs sains, en plus du temps et des dépenses associés à la fabrication de cellules CAR-T autologues. L’édition génétique du produit de cellules CAR-T par CRISPR/Cas9 représente une nouvelle stratégie pour surmonter les limites actuelles des cellules CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 est un système à deux composants qui peut être utilisé pour l’édition ciblée du génome dans les cellules de mammifères18,19. L’endonucléase Cas9 associée à CRISPR peut induire des cassures double brin spécifiques au site guidées par de petits ARN grâce à l’appariement de bases avec la séquence d’ADN cible20. En l’absence d’un gabarit de réparation, les ruptures double brin sont réparées par la voie d’assemblage d’extrémité non homologique (NHEJ) sujette aux erreurs, entraînant des mutations de décalage de trame ou des codons d’arrêt prématurés par des mutations d’insertion et de délétion (INDELs)19,20,21. L’efficacité, la facilité d’utilisation, la rentabilité et la capacité d’édition du génome multiplex font de CRISPR/Cas9 un outil puissant pour améliorer l’efficacité et la sécurité des cellules CAR-T autologues et allogéniques. Cette approche peut également être utilisée pour modifier les cellules T dirigées par TCR en remplaçant la construction CAR par un TCR. De plus, les cellules CAR-T allogéniques qui ont un potentiel limité de causer la maladie du greffon contre l’hôte peuvent également être générées par l’édition génique du locus TCR, b2m et HLA.
Dans ce protocole, nous montrons comment l’ingénierie CRISPR des lymphocytes T peut être combinée avec l’administration médiée par un vecteur viral du CAR-Transgene pour générer des produits de cellules CAR-T modifiés par le génome avec une efficacité et une sécurité accrues. Un diagramme schématique de l’ensemble du processus est illustré à la figure 1. En utilisant cette approche, nous avons démontré l’élimination de gènes à haute efficacité dans les cellules CAR-T humaines primaires. La figure 2A décrit en détail la chronologie de chaque étape de l’édition et de la fabrication des lymphocytes T. Des stratégies pour la conception d’ARN guide et la validation de l’élimination sont également discutées pour appliquer cette approche à divers gènes cibles.

<table><tbody><tr><td>Unité centrale de nucléofacteur 4D</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Unité X-Nucleofactor 4D</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Accuprime Pfx Supermix</td><td>ThermoFisher</td><td>12344040</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Optima XPN ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anticorps CD3 anti-humain</td><td>Biolegend</td><td>317322</td><td>Clone OKT3</td></tr><tr><td>BV711 Anti-humain PD1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Clone EH12.2H7</td></tr><tr><td>Cas9-Amplificateurs d’électroporation</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>CD3/CD28 Dynabeads</td><td>ThermoFisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>CD4+</td><td>T cell technologies</td><td>15062</td><td></td></tr><tr><td>CD8+ Kit d’isolement de cellules T StemCell</td><td>technologies</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>Corning 0,45 micron filtre/bouteille sous vide</td><td>Corning</td><td>430768</td><td></td></tr><tr><td>Corning T150 flacon de culture cellulaire</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS430825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Millipore Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNAeasy Blood and Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag</td><td>Magnet ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Supplément</td> <td>GlutamaxThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellules</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>huIL-15</td><td>PeproTech</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>huIL-7</td><td>PeproTech</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>ThermoFisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Nettoyage en gel de nucléospin et PCR</td><td>Takara</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>P3 Cellule primaire 4D-nucléofactor X Kit L</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3024</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline-Streptomycine-Glutamine</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>expression de pTRPE Plasmide</td><td>dans la maison</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lapin Anti-souris FMC63 scFv Anticorps monoclonal, (R19M), PE</td><td>CytoArt</td><td>200105</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>ThermoFisher</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spy Fi Cas9</td><td>Aldevron</td><td>9214</td><td></td></tr><tr><td>Tubes ultracentrifuges</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>Viral packaging mix</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-Vivo-15 Media</td><td>Lonza</td><td>BE02-060F</td><td></td></tr></tbody></table>

production de cellules car-t humaines conçues par crispr

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Les thérapies cellulaires adoptives utilisant des cellules T réceptrices de l’antigène chimérique (cellules CAR-T) ont démontré une efficacité clinique remarquable chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques et sont actuellement à l’étude pour diverses tumeurs solides. Les cellules CAR-T sont générées en retirant les cellules T du sang d’un patient et en les modifiant pour exprimer un récepteur immunitaire synthétique qui redirige les cellules T pour reconnaître et éliminer les cellules tumorales cibles. L’édition génique des cellules CAR-T a le potentiel d’améliorer l’innocuité des thérapies cellulaires CAR-T actuelles et d’augmenter encore l’efficacité des cellules CAR-T. Ici, nous décrivons les méthodes d’activation, d’expansion et de caractérisation des cellules CAR-T dirigées CD19 conçues par CRISPR chez l’homme. Cela comprend la transduction du vecteur lentiviral CAR et l’utilisation de l’ARN guide unique (SGRNA) et de l’endonucléase Cas9 pour cibler les gènes d’intérêt dans les cellules T. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être universellement appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles au-delà de ceux utilisés pour cette étude. En outre, ce protocole traite des stratégies de conception de l’ARNg, de la sélection de l’ARNg principal et de la validation de l’élimination du gène cible afin d’obtenir de manière reproductible une ingénierie CRISPR-Cas9 multiplexe à haute efficacité de cellules T humaines de qualité clinique.

Nous décrivons ici un protocole de génie génétique des lymphocytes T, qui peut être utilisé pour générer à la fois des cellules CAR-T autologues et allogéniques, ainsi que des cellules T redirigées par TCR.
La figure 1 fournit une description détaillée des étapes impliquées dans le processus de fabrication des lymphocytes T édités par CRISPR. Le processus commence par la conception de l’ARNg pour le gène d’intérêt. Une fois que les sgRNA sont conçus et synthétisés...

Nous présentons ici un protocole d’édition de gènes dans les cellules T humaines primaires utilisant la technologie CRISPR Cas pour modifier les cellules CAR-T.

Production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

Notre protocole de laboratoire permet de combiner l’édition du génome humain avec la thérapie cellulaire CAR-T. La procédure de laboratoire est l’approche avec CRISPR-Cas9 pour cibler jusqu’à trois gènes avec une grande efficacité. Enfin, notre approche peut se traduire par des essais cliniques sur l’homme.Les méthodes décrites peuvent être appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles. La base des techniques est suffisamment robuste pour être traduite à plus grande échelle et à des collaborateurs universitaires et industriels pour un développement ultérieur. Lorsque vous tentez ce protocole pour la première fois, limitez le nombre de groupes dans le criblage d’ARN guide pour permettre des temps d’incubation précis.Le respect des conditions de culture et de la densité d’ensemencement décrites s’est avéré essentiel dans notre expérience. Pour commencer, obtenez des cellules mononucléaires autologues du sang périphérique, ou PBMC, auprès de donneurs volontaires sains et isolez les lymphocytes T CD4 et CD8 positifs à l’aide de trousses de sélection CD4 et CD8 disponibles dans le commerce. Combinez les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs dans un rapport de un à un et incubez 3 millions de cellules par millilitre dans R10, complétées par 5 nanogrammes par millilitre de chaque IL7 humain et de l’IL15 humain pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Le lendemain, comptez les lymphocytes T et centrifugez 5 à 10 millions de cellules à 300 fois G pendant cinq minutes. Jetez tout surnageant et lavez la pastille cellulaire dans un milieu essentiel minimal de sérum réduit. Re-suspendre la pastille dans 100 microlitres de solution d’affection nucléaire selon les instructions du fabricant.Tout en lavant les cellules, préparez une ribonucléoprotéine, ou complexe RNP, en incubant 10 microgrammes de nucléase Cas9 avec 5 microgrammes d’ARN guide unique pendant 10 minutes à température ambiante. Incluez un contrôle fictif sans ARN guide unique. Combinez les cellules en suspension avec le complexe RNP et ajoutez 4,2 microlitres de quatre amplificateurs d’électroporation micromolaires.Bien mélanger et transférer dans des cuvettes d’électroporation. Électroporater les cellules en utilisant le code d’impulsion EH111, puis incuber 5 millions de cellules par millilitre en R10, complétées par 5 nanogrammes par millilitre d’IL7 humain et d’IL15 humain à 30 degrés Celsius pendant 48 heures dans 12 plaques de puits. Après l’incubation, procéder à l’activation et à l’expansion des lymphocytes T.Concevez les amorces de séquençage en entrant la séquence de l’amplicon PCR dans un logiciel de conception d’amorce standard. Le logiciel de conception suggérera plusieurs séquences d’amorces adaptées au séquençage sanger. Choisissez des amorces avant et arrière qui se lient avec l’amplicon au moins 150 paires de bases en amont ou en aval du site de coupe de l’ARNg pour assurer une bonne qualité de séquençage autour des indels.Utilisez l’analyse TIDE pour détecter l’efficacité de l’élimination au niveau génomique. L’algorithme reconstruit avec précision le spectre des indels à partir des traces de séquence et calcule les valeurs carrées R. Après activation, les lymphocytes T sont développés en culture et cryoconservés pour de futures études.Au cours de l’expansion, le doublement de la population et les changements de volume sont suivis tout au long du protocole pour les cellules CAR T simulées et modifiées. Aucun changement significatif n’a été détecté dans la prolifération et l’activation pendant l’expansion. Une fois les cellules cryoconservées, les niveaux d’expression de la CAR ont été déterminés pour d’autres études fonctionnelles pour les cellules CAR T simulées et knockout.Aucun changement significatif n’a été observé. L’efficacité du knockout peut être déterminée à l’aide de plusieurs techniques. Dans ces diagrammes représentatifs de cytométrie en flux, les loci PDCD1 et TRAC ont été ciblés à l’aide d’un ARN guide unique, montrant une efficacité de 90 % pour l’ARN guide unique PDCD1 et de 98 % pour l’ARN guide unique TRAC chez plusieurs donneurs sains.Il est important de s’assurer que les rapports molaires de Cas9 et des ARN guides sont exacts. Pendant la procédure, les cellules doivent toujours être maintenues à quatre degrés Celsius et ne pas être laissées dans la solution d’électroporation pendant de longues périodes. Après préservation de la CAR, les cellules CAR T conçues par CRISPR peuvent être utilisées pour des tests fonctionnels in vitro et in vivo, tels que des tests de cytotoxicité, la production de cytokines et des modèles murins de tumeurs syngénétiques ou xénographiques.Notre approche utilisant la technologie CRISPR Cas9 est maintenant appliquée aux essais cliniques. L’approche peut être utilisée à la fois pour le cancer, ainsi que pour les troubles génétiques non malins, tels que les hémoglobinohaties, qui affectent des millions d’enfants et d’adultes dans le monde.

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

La vidéo décrit un processus de création de cellules CAR-T génétiquement modifiées par le biais du système CRISPR-Cas9. L’infection des lymphocytes T par des lentivirus CRISPR et CAR entraîne des modifications du gène cible et la synthèse d’un récepteur antigénique chimérique ou CAR, conduisant finalement à la formation de cellules CAR-T génétiquement modifiées.

Modification génétique des cellules CAR-T à l’aide d’un système CRISPR-Cas9

Cette vidéo présente un test permettant d’effectuer l’édition de gènes dans des cellules T humaines à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un mélange de lymphocytes T CD4+ et CD8+ primaires est associé à un complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9, ciblant des gènes spécifiques pour l’inactivation. Lors de l’électroporation, l’ARNsg guide Cas9 vers la séquence d’ADN cible, créant ainsi des coupes précises. Ces coupures sont ensuite réparées par le mécanisme d'assemblage non homologue de la...

Une technique CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes dans les lymphocytes T

Cette vidéo présente une technique permettant de générer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifiques de l’antigène par transduction rétrovirale. Des lymphocytes T CD8+ murins activés sont ajoutés à une plaque de micropuits recouverte de fragments de fibronectine recombinante. Des vecteurs rétroviraux contenant de l’ARN transgénique codant pour un récepteur d’antigène chimérique (CAR) spécifique de l’antigène sont ensuite introduits, et la plaque est centrifugée pour...

Technique de génération de cellules CAR-T spécifiques de l’antigène

Lymphocytes T exprimant un récepteur CD19 chimérique antigène spécifique (RCA) sont infusés comme traitement expérimental des cellules B malignes dans nos first-in-humains essais de thérapie génique. Nous décrivons la modification génétique des cellules T en utilisant...

Application clinique de<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Et artificielle cellules présentatrices d&#39;antigènes pour modifier génétiquement des cellules T du sang de cordon ombilical et périphériques

Les effets lymphodéplétifs et immunomodulateurs de la chimiothérapie et de la radiothérapie standard peuvent être exploités pour améliorer l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie par lymphocytes T. Nous décrivons une méthode pour générer des lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) spécifiques de l’EGFRvIII et les administrer dans le contexte de la norme de soins du glioblastome.

Génération de la RCA cellules T pour la thérapie adoptive dans le contexte de glioblastome norme de diligence

Ici, nous présentons un protocole pour modifier génétiquement les cellules CAR-T via un système CRISPR/Cas9.

Utilisation de CRISPR/Cas9 pour éliminer gm-CSF dans les cellules CAR-T

Ce protocole rationalise la production de vecteurs rétroviraux et la transduction des lymphocytes T murins, facilitant ainsi la génération efficace de cellules CAR-T chez la souris.

Génération efficace de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) murin

Ce protocole fournit un flux de travail rationalisé pour générer et tester des cellules T régulatrices du récepteur antigénique chimérique humain (CAR Tregs).

Génération de lymphocytes T régulateurs du récepteur de l’antigène chimérique humain

Un protocole détaillé est fourni pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 afin d’obtenir un knock-in ciblé très efficace de grandes constructions multicistroniques dans les cellules T humaines primaires via la voie de réparation de l’ADN HMEJ (Homology-Mediated End Joindre). Les lymphocytes T conçus avec ce protocole adaptable à la GMPc maintiennent une excellente expansion cellulaire, une cytotoxicité et une production de cytokines.

Ingénierie non virale de lymphocytes T humains primaires via l’intégration ciblée de grandes matrices d’ADN

Ce protocole décrit les étapes essentielles pour la culture des lymphocytes T primaires, y compris leur isolement, leur activation, leur expansion et leur transfection transitoire par électroporation d’ARNm. De plus, un flux de travail et un panel d’anticorps pour l’analyse cytométrique en flux du phénotype, des marqueurs d’activation, de la viabilité et de l’expression du récepteur antigénique chimérique (CAR) sont proposés.

Isolement, culture et transfection transitoire des lymphocytes T humains primaires pour générer les lymphocytes T du récepteur chimérique de l’antigène (CAR)

Découvrez la production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR-Cas9 pour l'immunothérapie anticancéreuse. Ce protocole permet une édition génique multiplex efficace et la traduction clinique.

Production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR

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