Name: Sondes de tension de l’ADN pour cartographier les forces transitoires du récepteur Piconewton par les cellules immunitaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Découvrez comment cartographier les forces moléculaires transitoires générées par les cellules immunitaires à l'aide de sondes de tension à base d'ADN. Cette méthode utilise un mécanisme de verrouillage pour stocker les signaux mécaniques et permet leur analyse par microscopie à fluorescence conventionnelle.

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Ce travail a été soutenu par les subventions NIH R01GM131099, NIH R01GM124472 et NSF CAREER 1350829. Nous remercions le NIH Tetramer Facility pour les ligands pMHC. Cette étude a été appuyée, en partie, par le Emory Comprehensive Glycomics Core.

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<li>Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-based+digital+tension+probes+reveal+integrin+forces+during+early+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion.</a> Nature Communications. 5, 5167(2014).</li>
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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+integrins+exhibit+anisotropic+mechanosensing+and+harness+piconewton+forces+to+mediate+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+probes+that+store+mechanical+information+reveal+transient+piconewton+forces+applied+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).</li>
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<li>Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elasticity+of+the+transition+state+for+oligonucleotide+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization.</a> Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).</li>
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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Avec les procédures détaillées fournies ici, on peut préparer des substrats de sonde de tension en épingle à cheveux ADN pour cartographier et quantifier la tension du récepteur produite par les cellules immunitaires. Lorsque les cellules sont plaquées sur le substrat de la sonde de tension en épingle à cheveux de l’ADN, elles atterrissent, se fixent et se propagent lorsque les récepteurs détectent les ligands à la fois chimiquement et mécaniquement, ce dernier étant détecté par nos sondes. Cependant, dans certains cas, ...

Les cellules immunitaires se défendent contre les agents pathogènes et les cellules cancéreuses en rampant et en balayant continuellement les surfaces des cellules cibles à la recherche d’antigènes, en cloutant leur surface 1,2. La reconnaissance de l’antigène est initiée lors de la liaison entre le récepteur des lymphocytes T (TCR) et le complexe peptide-majeur d’histocompatibilité CMH (pMHC) exprimé à la surface des cellules cibles. Parce que la reconnaissance TCR-pMHC se produit à la jonction entre deux cellules mobiles, il a longtemps été soupçonné de subir des forces mécaniques. De plus, cela a conduit au modèle mécanocapteur d’activation TCR, qui suggère que les forces TCR contribuent à sa fonction 3,4. Pour comprendre quand, où et comment les forces mécaniques contribuent au fonctionnement des lymphocytes T, il est impératif de développer des outils pour visualiser les forces moléculaires transmises par les lymphocytes T. Traditionnellement, des méthodes telles que la microscopie à force de traction (TFM) et les réseaux de micropiliers sont utilisés pour étudier les forces cellulaires 5,6. Cependant, la sensibilité aux forces de la TFM et des réseaux de micropiliers est à l’échelle du nanonewton (nN) et est donc souvent insuffisante pour étudier les forces moléculaires du piconewton (pN) transmises par les récepteurs cellulaires7. Pour améliorer la force et la résolution spatiale de la détection, notre laboratoire a été le pionnier du développement de sondes de tension moléculaire, qui ont été initialement synthétisées à l’aide de polymères de polyéthylèneglycol (PEG)7. Les sondes de tension moléculaire sont composées d’un « ressort » moléculaire extensible (PEG, protéine, ADN) flanqué d’un fluorophore et d’un quencher et sont ancrées sur une surface. Les forces appliquées à l’extrémité de la sonde conduisent à son extension, séparant le fluorophore et l’anti-quenceur, et générant ainsi un fort signal de fluorescence (Figure 1A)8,9,10.
Au cours de la dernière décennie, nous avons développé une bibliothèque de différentes classes de sondes de tension moléculaire avec des éléments à ressort fabriqués à partir d’acides nucléiques11, de protéines10 et de polymères8. Parmi celles-ci, les sondes de tension basées sur l’ADN fournissent le rapport signal sur bruit le plus élevé et la plus grande sensibilité à la force, qui est facilement réglée de quelques pN à ~20 pN11. Nous avons utilisé ces sondes de tension d’ADN en temps réel pour étudier les forces moléculaires générées par de nombreux types de cellules, y compris les fibroblastes, les cellules cancéreuses, les plaquettes et les cellules immunitaires11,12,13. Ce manuscrit décrira des protocoles pour synthétiser et assembler des sondes de tension d’ADN sur une surface afin de cartographier les forces des récepteurs moléculaires avec une résolution de force pN à l’aide d’un microscope à fluorescence conventionnel. Bien que la procédure actuelle comprenne des modifications chimiques de l’acide nucléique pour introduire le rapporteur fluorescent (figure 1B), il est important de noter que de nombreuses étapes de modification et de purification peuvent être sous-traitées à des entreprises de synthèse d’ADN personnalisées. Par conséquent, la technologie des sondes de tension de l’ADN est facile et accessible aux communautés plus larges de la biologie cellulaire et de la mécanobiologie.
Brièvement, pour assembler des capteurs de tension d’ADN, une épingle à cheveux à ADN est hybridée à un brin de ligand fluorescent sur un bras et à un brin d’ancrage de quencher sur l’autre bras, puis immobilisée sur un substrat de verre (Figure 1C, tension en temps réel). En l’absence de force mécanique, l’épingle à cheveux est fermée et la fluorescence est donc éteinte. Cependant, lorsque la force mécanique appliquée est supérieure à la F1/2 (la force à l’équilibre qui conduit à une probabilité de 50% de se déplier), l’épingle à cheveux fond mécaniquement et un signal fluorescent est généré.
En nous appuyant sur le capteur de tension de l’ADN en temps réel, nous décrivons également des protocoles pour cartographier les forces accumulées, ce qui est particulièrement utile pour étudier les interactions entre les récepteurs des cellules immunitaires et leur ligand naturel. En effet, les récepteurs immunitaires présentent souvent des liaisons de courte durée 3,14. Les forces accumulées sont imagées à l’aide d’un brin de « verrouillage » qui se lie préférentiellement aux épingles à cheveux d’ADN ouvertes et permet le stockage des signaux de fluorescence associés aux événements de traction mécanique (Figure 1C, tension verrouillée). Le brin de verrouillage est conçu pour lier un site de liaison cryptique qui est exposé lors de la fusion induite mécaniquement de l’épingle à cheveux et verrouiller l’épingle à cheveux à l’état ouvert en bloquant le repliement de l’épingle à cheveux, stockant ainsi le signal de tension et générant une carte de tension accumulée. De plus, le brin de verrouillage est conçu avec un toehold à huit nucléotides, ce qui permet une réaction de déplacement du brin médiée par le teil avec son complément complet, le brin de « déverrouillage ». Avec l’ajout du brin de déverrouillage, le brin de verrouillage lié est retiré de la construction en épingle à cheveux, effaçant le signal de tension stocké et réinitialisant l’épingle à cheveux à l’état temps réel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62348/62348fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma des sondes de tension moléculaire de pointe. (A) Conception générale de sonde de tension moléculaire en temps réel, (B) Brins pour la construction de sonde de tension basée sur l’ADN, et (C) sondes de tension basées sur l’ADN et leur basculement entre l’état en temps réel et l’état verrouillé. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62348/62348fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le protocole principal comprend quatre sections principales: préparation des oligonucléotides, préparation de surface, imagerie et analyse des données. Ce protocole a été démontré avec succès par notre laboratoire et d’autres dans des lymphocytes T CD8+ OT-1 naïfs et activés, des cellules CD4+ OT-II, ainsi que des hybridomes, et peut être appliqué pour interroger différents récepteurs de cellules immunitaires, y compris le récepteur des cellules T, le récepteur de mort cellulaire programmée (PD1) et les forces de l’antigène 1 associé à la fonction lymphocytaire (LFA-1). Les lymphocytes T naïfs de CD8+ OT-1 sont utilisés comme exemple de lignée cellulaire dans cet article.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; Acide 3-hydroxypicolinique (3-HPA)</td><td>Sigma</td><td>56197</td><td>matrice maldi-TOF-MS</td></tr><tr><td>&nbsp ; mPEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>MF001023-2K préparation de</td><td>surface</td></tr> (<tr><td>3-Aminopropyl)triéthoxysilane</td><td>Acros</td><td>AC430941000</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td>10x tampon de lyse des globules rouges</td><td>Biolegend</td><td>00-4333-57</td><td>tampon</td></tr><tr><td>8,8 nm nanoparticules d’or, acide tannique</td><td>Nanocomposix</td><td>commande personnalisée</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td>Atto647N NHS ester</td><td>Sigma</td><td>18373-1MG-F</td><td>fluorophore, oligo prep</td></tr><tr><td>Chambre cellulaire Attofluor, pour la microscopie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>imagerie</td></tr><tr><td>BD Seringues uniquement avec Luer-Lok</td><td>BD bioscience</td><td>309657</td><td>cellules</td></tr><tr><td>biotinylées anti-souris CD3e</td><td>ebioscience</td><td>13-0031-82</td><td>anticorps/ligand</td></tr><tr><td>biotinylé pMHC ovalbumine (SIINFEKL)</td><td>NIH Tetramer Core Facility à l’Université Emory</td><td>NA</td><td>anticorps/ligand</td></tr><tr><td>sérum bovin albumine</td><td>Sigma</td><td>735078001</td><td>bloquer les interactions non spécifiques</td></tr><tr><td>Passoires cellulaires</td><td>Biologix</td><td>15-1100</td><td>cellules</td></tr><tr><td>Coverslip Mini-Rack, téflon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C14784</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td>Cy3B NHS ester</td><td>GE Healthcare</td><td>PA63101</td><td>fluorophore, oligo prep</td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>tampon</td></tr><tr><td>éthanol</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td>Hank' sels équilibrés (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td>tampon</td></tr><tr><td>peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td>LA-PEG-SC</td><td>Biochempeg</td><td>HE039023-3.4K</td><td>préparation</td></tr><tr><td>de surface Midi MACS (LS) kit de démarrage</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-301</td><td>cellules</td></tr><tr><td>souris CD8+ Kit d’isolement des cellules T</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td>cellules</td></tr><tr><td>Nanosep MF dispositifs centrifuges</td><td>Pall laboratory</td><td>ODM02C35</td><td>oligo prep</td></tr><tr><td>No. 2 lamelles en verre rond</td><td>VWR</td><td>48382-085</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td>NTA-SAM</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>N475-10</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td>P2 gel</td><td>Bio-rad</td><td>1504118</td><td>préparation d’oligo</td></tr><tr><td>acide sufurique</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>SX1244-6</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td>Acétate Sulfo-NHS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26777</td><td>préparation de surface</td></tr><tr><td><fort>Équipement</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent AdvanceBio Oligonucléotide C18 colonne, 4,6 x 150 mm, 2,7 &mu ; m</td><td>653950-702</td><td></td><td>préparation d’oligonucléotides</td></tr><tr><td>Barnstead Système de purification d’eau nanopure</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>eau</td></tr><tr><td>CFI Apo 100&times ; Objectif NA 1.49</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>Cy5 cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>evolve electron multipliction de charge coupled device (EMCCD)</td><td>Photométrie</td><td></td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>Chromatographie liquide haute performance</td><td>Agilent 1100</td><td></td><td>Préparation d’oligonucléotides</td></tr><tr><td>Source d’épifluorescence Intensilight</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse à temps de vol par désorption/ionisation laser assisté par matrice (MALDI-TOF-MS)Préparation</td> <td>d’oligonucléotides</td> <td>Voyager STR</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis Nanodrop 2000</td><td>Préparation d’oligonucléotides</td><td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td></td> Microscope <td></td><td>inversé Nikon Eclipse Ti</td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>Nikon Perfect Focus System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>Logiciel NIS Elements Nikon</td><td></td><td></td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>quadribande TIRF 405/488/561/647 cube</td><td>Microscopie</td><td>CHROMA</td><td></td></tr><tr><td>Cube RICM</td><td>Microscopie</td><td>CHROMA</td><td></td></tr><tr><td>Lanceur TIRF avec 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) et 640 nm</td><td>Microscopie</td><td>cohérente</td><td></td></tr><tr><td>TRITC cube</td><td>CHROMA</td><td></td><td>Microscopie</td></tr><tr><td>nom oligonom</td><td>5' modification / modification 3'</td><td>sequence (5' à 3')</strong</td><td>>Use</td></tr><tr><td>15mer amine locking strand</td><td>5' modification : aucune modification 3' modification : /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC</td><td>TA verrouillage signal de tension en temps réel</td></tr><tr><td>15mer Atto647N brin de verrouillage</td><td>5' modification : Atto647N 3' modification : /3AmMO/</td><td>AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA</td><td>verrouillage signal de tension en temps réel</td></tr><tr><td>15mer non fluorescent brin</td> <td>de verrouillage5' Modification : no Modification 3' Modification : no modification</td><td>A AAA AAC ATT TAT AC</td><td>verrouillage du signal de tension en temps réel pour l’analyse quantitative</td></tr><tr><td>4.7 pN hairpin strand</td><td>5' modification : no modification 3' modification : aucune modification</td><td>GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC</td><td>sonde en épingle à cheveux</td></tr><tr><td>amine ligand strand</td><td>5' modification : /5AmMC6/ 3' modification : /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>sonde en épingle à cheveux</td></tr><tr><td>BHQ2 brin d’ancrage</td><td>5' modification : /5ThiolMC6-D/ 3' modification : /3BHQ_2/</td><td>TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT</td><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; sonde en épingle à cheveux</td></tr><tr><td>Cy3B ligand strand</td><td>5' modification : Cy3B 3' modification : /3Bio/</td><td>CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT</td><td>sonde en épingle</td></tr><tr><td>à cheveux déverrouillage</td> strand<td>5' modification : aucune modification 3' modification : aucune modification</td><td>TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C</td><td>déverrouillage du signal de tension accumulé</td></tr></tbody></table>

sondes de tension de l’adn pour cartographier les forces transitoires du récepteur piconewton par les cellules immunitaires

DNA Tension Probes to Map the Transient Piconewton Receptor Forces by Immune Cells

Les forces mécaniques transmises à la jonction entre deux cellules voisines et à la jonction entre les cellules et la matrice extracellulaire sont essentielles pour réguler de nombreux processus allant du développement à l’immunologie. Par conséquent, le développement des outils pour étudier ces forces à l’échelle moléculaire est essentiel. Notre groupe a développé une suite de capteurs de tension moléculaire pour quantifier et visualiser les forces générées par les cellules et transmises à des ligands spécifiques. La classe la plus sensible des capteurs de tension moléculaire est composée d’épingles à cheveux à boucle tige d’acide nucléique. Ces capteurs utilisent des paires fluorophore-quencher pour rendre compte de l’extension mécanique et du dépliage des épingles à cheveux ADN sous force. L’un des défis des capteurs de tension en épingle à cheveux à ADN est qu’ils sont réversibles avec un repliement rapide en épingle à cheveux à la fin de la tension et que les forces transitoires sont donc difficiles à enregistrer. Dans cet article, nous décrivons les protocoles de préparation des capteurs de tension de l’ADN qui peuvent être « verrouillés » et empêchés de se replier pour permettre le « stockage » des informations mécaniques. Cela permet d’enregistrer des forces de piconewton hautement transitoires, qui peuvent ensuite être « effacées » par l’ajout d’acides nucléiques complémentaires qui suppriment le verrou. Cette capacité à basculer entre la cartographie de tension en temps réel et le stockage d’informations mécaniques révèle des forces faibles, de courte durée et moins abondantes, qui sont couramment utilisées par les cellules T dans le cadre de leurs fonctions immunitaires.

Nous montrons ici des images représentatives du contrôle de la qualité de surface (Figure 4). Une surface de haute qualité doit avoir un fond propre dans le canal RICM (Figure 4B) et une intensité de fluorescence uniforme dans le canal Cy3B (Figure 4C). Avec le même équipement d’imagerie et des conditions d’acquisition d’imagerie par fluorescence identiques, l’intensité de fluorescence de fond doit être constante et reproductible à ...

Cet article décrit un protocole détaillé pour l’utilisation de sondes de tension basées sur l’ADN pour imager les forces réceptrices appliquées par les cellules immunitaires. Cette approche permet de cartographier les forces du récepteur >4,7pN en temps réel et d’intégrer les forces au fil du temps.

Sondes de tension de l’ADN pour cartographier les forces transitoires du récepteur Piconewton par les cellules immunitaires

Mechanical forces transmitted at the junction between two neighboring cells and at the junction between cells and the extracellular matrix are critical ...

Ce protocole offre une méthode pour cartographier les forces moléculaires générées par les cellules et en particulier les cellules immunitaires. Le protocole est essentiel pour les laboratoires intéressés par l’étude de la mécanotransduction en mécanobiologie. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est super facile et permet d’utiliser la microscopie à fluorescence conventionnelle pour quantifier la transmission de la force dans les cellules immortalisées et primaires.Pour commencer, placez des lamelles de couverture de 25 millimètres sur une grille en polytétrafluoroéthylène dans un bécher de 50 millilitres et rincez les lamelles trois fois en les immergeant dans l’eau. Mélanger des volumes égaux d’éthanol et d’eau et ajouter 40 millilitres de cette solution au bécher contenant la grille et les lames de couverture. Ensuite, scellez le bécher à l’aide de ruban adhésif parafilm.Nettoyez les lamelles de couverture en sonicant le bécher pendant 15 minutes dans un nettoyeur à ultrasons et jetez le liquide après la sonication. Ensuite, rincez le bécher contenant la grille et les lamelles de couverture avec de l’eau au moins six fois pour éliminer tout solvant organique restant. Pour préparer une solution fraîche de piranha, ajoutez 30 millilitres d’acide sulfurique à un bécher de 50 millilitres et ajoutez lentement 10 millilitres de peroxyde d’hydrogène.Mélanger délicatement la solution de piranha à l’aide de l’extrémité d’une pipette en verre. Pour lancer la gravure, transférer la grille contenant les lamelles de couverture dans le bécher contenant la solution de piranha et incuber pendant 30 minutes à température ambiante pour nettoyer et hydroxyler les lamelles de couverture. Ensuite, transférez la grille à l’aide d’une pince à épiler en acier ou en polytétrafluoroéthylène dans un bécher propre de 50 millilitres et rincez à l’eau six fois.Afin d’éliminer complètement l’eau, immergez la grille contenant les lamelles de couverture dans un bécher de 50 millilitres avec 40 millilitres d’éthanol. Ensuite, jetez l’éthanol. Ensuite, immergez la grille dans 40 millilitres d’éthanol contenant 3% d’aminopropyltriéthoxysilane pendant une heure à température ambiante pour initier la réaction avec le groupe hydroxyle sur les lamelles de couverture.Rincez six fois la surface des lamelles de couverture en les immergeant dans 40 millilitres d’éthanol et séchez-les dans un four à 80 degrés Celsius pendant 20 minutes. Couvrir le fond intérieur de la boîte de Petri avec un ruban de parafilm pour empêcher les lamelles de couvercle de glisser à l’intérieur de la boîte de Pétri. Ensuite, placez les lamelles de couverture recouvertes d’amine avec le côté à fonctionnaliser avec les sondes de tension de l’ADN tournées vers le haut.Couvrez les lamelles à 20 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Pour modifier les groupes amines sur les lames de couverture, ajouter de l’acide lipoïque PEG NHS et mPEG NHS et incuber la boîte de Petri à température ambiante pendant une heure. À la fin de l’incubation, rincez la surface trois fois avec de l’eau.Après cela, ajoutez 100 microlitres de bicarbonate de sodium 0,1 molaire contenant un milligramme par millilitre de sulfo-NHS-acétate à un ensemble de lamelles de couverture sandwich et incuber pendant 30 minutes pour que la passivation se produise. Ajouter 0,5 millilitre de nanoparticules d’or à chaque lamelle de couverture et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, rincez les lamelles de couverture avec de l’eau trois fois.Après avoir ajouté Black Hole Quencher 2 brins à la sonde de tension d’ADN recuite dans un rapport de dix pour un, ajoutez 100 microlitres du mélange par deux lamelles de couverture pour faire le sandwich. Placez soigneusement une boule de mouchoir humide dans la boîte de Pétri, loin des lamelles de couverture, et scellez la capsule avec du ruban adhésif pour empêcher la solution de sécher. Après cela, couvrez le plat avec une feuille d’aluminium et incuberez-le à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, assemblez la chambre d’imagerie en prenant soin d’éviter les fissures de surface lors du serrage de la chambre. Ensuite, ajoutez 0,5 à un millilitre de solution saline équilibrée de Hank dans la chambre d’imagerie. Utilisez le canal Cy3B avec un objectif 100X pour capturer les signaux fluorescents des cellules plaquées sur les sondes de tension en épingle à cheveux de l’ADN lorsqu’elles commencent à se propager.Après avoir préparé 100 microMolaires de brins de verrouillage non fluorescents, au point de temps souhaité, ajoutez-le aux cellules à une concentration finale d’un microMolaire dans la chambre d’imagerie pour stocker le signal de tension et le mélanger avec les cellules par pipetage. Après environ 10 minutes de verrouillage, acquérir des films accélérés ou des images de point final en épifluorescence pour la cartographie qualitative de la tension et l’analyse quantitative. Une surface réussie avait une couleur rose pâle.La haute qualité de la surface a été démontrée avec un fond propre et la microscopie de contraste d’interférence de réflexion ou le canal RICM et une intensité de fluorescence uniforme dans le canal Cy3B. Les images accélérées du verrouillage de tension ont indiqué que les signaux de tension TCR anti-CD3 epsilon et TCR-peptide-MHC étaient amplifiés en raison du verrouillage en épingle à cheveux et de l’accumulation de signal. Le brin de verrouillage a enregistré des événements de traction mécanique de courte durée du peptide TCR MHCN4 à partir de zéro minute, ce qui a facilité l’analyse quantitative et révélé le modèle distinct de la force MHC du peptide TCR qui ressemblait au motif bullseye des synapses immunitaires.Chaque étape, la préparation du substrat de votre sonde d’intention nécessite une attention aux détails et une manipulation minutieuse des matériaux. Cette technologie permet de visualiser les forces moléculaires transitoires qui se produisent à la surface de la cellule lorsqu’elle interagit avec l’environnement, en particulier dans les cellules immunitaires à la recherche d’antigènes.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioingénierie

Nous présentons deux indépendantes, basées sur le microscope des outils pour mesurer les déformations induites nucléaire et du cytosquelette dans la seule, vivant des cellules adhérentes en réponse à l'application de déformation globale ou localisée. Ces techniques sont utilisées pour déterminer la rigidité nucléaire (ie, déformabilité) et de transmission de la force de sonde intracellulaire entre le noyau et le cytosquelette.

Tests biophysiques pour sonder les propriétés mécaniques du noyau cellulaire interphase: Application Strain Substrat et manipulation Microneedle

Dans cette vidéo, les sondes de force biomembranaire (BFP) sont utilisées pour mesurer les forces entre les récepteurs et les ligands. Cette technique permet de détecter les interactions en surveillant la pression nécessaire pour rompre les liaisons entre le pMHC conjugué sur les billes de la sonde et les TCR sur les cellules cibles.

Sonde de force biomembranaire pour quantifier les interactions récepteur-ligand

La vidéo présente une méthode d’évaluation des forces réceptrices appliquées par les cellules immunitaires à l’aide de nanoparticules d’or ancrées au polyéthylène glycol et de sondes de tension en épingle à cheveux d’ADN. Les interactions des lymphocytes T CD8-positifs déclenchent le dépliage de la sonde, émettant une fluorescence tandis que les brins verrouillables maintiennent le signal pour quantifier les forces appliquées par les cellules immunitaires.

Utilisation de sondes de tension basées sur l’ADN pour évaluer les forces des récepteurs appliquées par les cellules immunitaires

Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l'axone. Le protocole expérimental développé évalue l'adhérence des axones au substrat de culture.

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Nous décrivons une technique permettant de mesurer simultanément la cinétique de liaison du récepteur unique et du ligand régulée par la force et l’imagerie en temps réel de la signalisation calcique dans un seul lymphocyte T.

Fluorescence Biomembrane la Force Probe: quantification simultanée de Kinetics récepteur-ligand et induits Reliure-signalisation intracellulaire sur une cellule unique

Un certain nombre de biocapteurs de force basés sur FRET ont récemment été développés, permettant la résolution spécifique des protéines de la force intracellulaire. Dans ce protocole, nous démontrons comment l’un de ces capteurs, conçu pour l’agent de liaison de la protéine du complexe nucléosquelette-cytosquelette (LINC) Nesprin-2G, peut être utilisé pour mesurer les forces de l’actomyosine sur le complexe nucléaire LINC.

Un protocole pour l&#39;utilisation Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force biocapteurs pour mesurer les forces mécaniques à travers le complexe nucléaire LINC

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Une sonde de Force directe permettant de mesurer l’intégration mécanique entre le noyau et le cytosquelette

Nous présentons ici un protocole pour l’utilisation simultanée de Förster resonance capteurs tension axée sur le transfert de l’énergie pour mesurer la récupération de charge et de fluorescence de protéine après photoblanchiment pour mesurer la dynamique des protéines permettant la mesure de force-sensibles dynamique des protéines dans des cellules vivantes.

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Intégrine tension joue un rôle important dans diverses fonctions cellulaires. Avec un capteur de tension intégrative, tension intégrine est calibrée avec une sensibilité de picoNewton (pN) et image à résolution submicronique.

D’imagerie intégrine Tension et Force cellulaire à résolution submicronique avec un capteur de Tension intégrative

Ce protocole définit une approche de microscopie à haut débit en temps réel pour visualiser et quantifier la libération de pièges extracellulaires (TNE) de neutrophiles humains in vitro. La méthode reproductible permet d’étudier les caractéristiques et la cinétique de la libération de TNE lors de la stimulation avec des inducteurs de NETosis distincts et permet d’évaluer la pharmacologie des antagonistes de NETosis.

Quantification microscopique en temps réel et à haut débit de la libération de pièges extracellulaires de neutrophiles humains et évaluation de la pharmacologie des antagonistes

Cette méthode mesure la propension d’une cellule à rompre des ligands présentant des duplex d’ADN immobilisés pour signaler les forces de traction cellulaires relatives. Les oligonucléotides fluorescents rompus sont délivrés dans la cellule et analysés par cytométrie en flux, enregistrant l’histoire mécanique de la cellule. Cela permet de mesurer à haut débit la génération de force cellulaire dans le contexte du mécanophénotypage cellulaire.

Mesure par cytométrie en flux à haut débit du mécanotype cellulaire basée sur la rupture et l’administration de sondes de tension d’ADN dans les cellules

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Sondes de tension de l’ADN pour cartographier les forces transitoires du récepteur Piconewton par les cellules immunitaires

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