Name: Hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Découvrez une méthode d'hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte pour étudier la régénération hépatique. Ce protocole permet d'analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la repousse du foie avec une grande reproductibilité.

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I.M.O. est pris en charge par la NIAAA (F32AA027135). W.G. est soutenu par R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 et le Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. est boursier Pew en sciences biomédicales.

Les poissons zèbres ont été élevés et élevés selon les procédures standard. Les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Brigham and Women’s Hospital (2016N000405). Les poissons zèbres adultes ont été jeûnés pendant 24 h avant le début du protocole. L’eau du système fait référence à l’eau dans les réservoirs abritant des poissons zèbres dans l’installation aquatique.
1. Préparation et anesthésie
<ol><li>Préparer une solution de tricaine à 0,016% dans l’eau du système. ATTENTION: La tricaine est un irritant si elle entre en contact avec les yeux, la peau ou les voies respiratoires.</li>
	<li>Préparez une éponge pour contenir le poisson zèbre anesthésié pendant le protocole de dissection. Couper une éponge complète en quartiers. À l’aide d’une lame de rasoir, retirez un mince coin d’éponge qui est parallèle au long axe du quart de l’éponge.<ol>
<li>La fente doit être assez longue pour accueillir un poisson adulte (cela variera selon les tailles de poisson). Par exemple, pour un poisson adulte de 35 mm de longueur, la longueur de la fente doit être de 20 mm. La tête et le corps sont bien maintenus dans l’éponge, mais la queue passe devant le bord de l’éponge(figure 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faire tremper l’éponge dans une solution de tricaine à 0,016%.</li>
	<li>Placer le poisson zèbre adulte (mâle ou femelle) dans 625 mL de solution de tricaine à 0,016 %.</li>
	<li>Incuber pendant 6 min ou jusqu’à ce que le poisson ne réponde pas au toucher.</li>
	<li>À l’aide d’une pince, retirez soigneusement le poisson du réservoir de Tricaine et placez la face ventrale du poisson dans la rainure de l’éponge(Figure 1A - B).</li>
	<li>Placez l’éponge sous un microscope de dissection avec éclairage descendant.</li>
</ol>2. Chirurgie
<ol><li>À l’aide d’une pince fine, pincer la peau et les écailles par voie médiale, juste en arrière du cœur (Figure 1B).</li>
	<li>À l’aide de ciseaux à ressort, faites une coupe sous la pince pour créer un trou dans la cavité du corps(Figure 1C - D). Prenez soin de ne pas blesser le cœur ou un vaisseau sanguin majeur, car cela entraînerait une mortalité accrue.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux à ressort, faire une incision de 3-4 mm le long de l’abdomen, traitement postérieur jusqu’à ce que l’incision arrive aux nageoires pelviennes (Figure 1D - E). À ce stade, le lobe ventral du foie peut être visible à travers l’incision.</li>
	<li>Pressez les côtés de l’éponge d’une main pour forcer les organes viscéraux à sortir de la cavité corporelle. Le lobe ventral du foie sera visible sur le dessus de l’intestin (Figures 1F,2A-B). Le foie apparaîtra sous la forme d’une structure rose ou orange étalée sur l’intestin brun doré. Les animaux désignés comme témoins fictifs sont récupérés à ce stade.</li>
	<li>Pressez la pince fine pour que les deux dents se touchent. Tout en maintenant la pression sur l’éponge, faites glisser les dents de la pince fine entre le foie et l’intestin (Figure 1G). Prenez soin de ne pas percer l’intestin, car cela entraînera une augmentation de la mortalité.</li>
	<li>Relâchez lentement la pression sur la pince afin que les dents s’éloignent les unes des autres(Figure 1H). Cette action glissante coupe les nombreuses attaches de veines portiques entre le lobe ventral et l’intestin(figure 2B),et est nécessaire pour enlever proprement le lobe ventral. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les connexions portales entre le foie et l’intestin aient été sectionné.</li>
	<li>Décoller le lobe ventral de l’intestin à l’aide d’une pince fine et couper le lobe ventral libre du reste du foie (Figure 1I).</li>
	<li>Cette procédure entraîne une hépatectomie partielle d’un tiers (figure 1J).</li>
</ol>3. Rétablissement
<ol><li>Retirez soigneusement le poisson de l’éponge et placez-le dans un réservoir d’eau du système.</li>
	<li>Le système de pipettes arrose les branchies pendant quelques minutes jusqu’à ce que le poisson nage seul(figure 1K).</li>
	<li>Surveillez les poissons pendant 2 à 4 heures avant de les replacer dans le système. Ne nourrissez pas le poisson pendant 24 h après la chirurgie.</li>
	<li>Surveiller les poissons quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience.</li>
	<li>Avec le temps, l’incision dans la paroi du corps guérira naturellement sans avoir besoin de sutures(Figure 1L,2C).</li>
</ol>4. Analyse de la longueur du lobe ventral à l’intestin
<ol><li>Euthanasier tous les animaux destinés à l’analyse dans l’eau glacée pendant 10 min jusqu’à ce que tous les mouvements operculaires cessent.</li>
	<li>Retirez le poisson de l’eau glacée et placez-le côté ventral dans la rainure d’une éponge.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux à ressort, faites une incision dans la paroi ventrale du corps à la position antérieure-postérieure du cœur. Ensuite, faites deux autres incisions qui longent l’axe antérieur-postérieur de la première incision jusqu’aux nageoires pelviennes. (Figure 2A).</li>
	<li>Décollez la peau et les muscles pour révéler les organes viscéraux (Figure 2A).</li>
	<li>Acquérir des images fluorescentes et en champ lumineux des organes viscéraux à l’aide d’un microscope à épifluorescence. Ce champ de vision comprendra la zone où le lobe ventral a été réséqué. Étant donné que les animaux sont euthanasiés avant l’analyse, ce type d’analyse empêche l’imagerie à long terme du même poisson.</li>
</ol>5. Analyse du rapport poids du foie au corps
<ol><li>Euthanasier tous les animaux destinés à l’analyse dans l’eau glacée pendant 10 min jusqu’à ce que tous les mouvements operculaires cessent.</li>
	<li>Placer le poisson dans un tube conique de 50 mL.</li>
	<li>Ajouter 25 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS et 0,3 % tween dans le tube. ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique et les solutions contenant du formaldéhyde doivent toujours être traitées dans une hotte chimique.</li>
	<li>Nutate pendant 48 h à 4 °C.</li>
	<li>Effectuez quatre lavages de 10 minutes en 1x PBS et 0,3% Tween.</li>
	<li>Récupérez le poisson avec une pince et séchez-le sur une serviette en papier.</li>
	<li>Notez le poids du poisson entier.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux à ressort, faites une incision dans la paroi ventrale du corps à la position antérieure-postérieure du cœur. Ensuite, faites deux autres incisions qui longent l’axe antérieur-postérieur de la première incision jusqu’aux nageoires pelviennes. (Figure 2A).</li>
	<li>Décollez la peau et les muscles pour révéler les organes viscéraux (Figure 2A).</li>
	<li>Acquérir des images en champ lumineux du foie à l’aide d’un microscope à épifluorescence.</li>
	<li>Disséquer le foie, en plaçant les morceaux de foie sur un bateau de pesée.</li>
	<li>Notez le poids du foie.</li>
</ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+liver+regeneration+and+growth+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Principles of liver regeneration and growth homeostasis.</a> Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).</li>
<li>Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+it+new+again%3A+insight+into+liver+development%2C+regeneration%2C+and+disease+from+zebrafish+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research.</a> Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).</li>
<li>Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+biological+and+pathological+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications.</a> Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).</li>
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<li>Dovey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+II+is+required+for+embryonic+development+and+liver+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).</li>
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<li>Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+characterization+of+the+dorsal+lobes+after+hepatectomy+of+the+ventral+lobe+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish.</a> BMC Genomics. 16, 979(2015).</li>
<li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).</li>
<li>Grisham, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+principles+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22The+Liver%3A+Biology+and+Pathobiology%3A+Fifth+Edition%22%5BJournal%5D)">Organizational principles of the liver.</a> The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les différences anatomiques entre les modèles de régénération hépatique chez le poisson zèbre et les mammifères présentent des défis uniques pour la résection hépatique. Le foie chez le poisson zèbre est à proximité du cœur et de l’intestin; Endommageant par inadvertance l’un ou l’autre organe a comme conséquence la mortalité accrue. Le foie de poisson zèbre n’est pas encapsulé, ce qui le rend plus difficile à séparer de l’intestin. Le foie reçoit du sang riche en nutriments de l’intestin par les veines portiques. Chez l...

Parmi les organes solides chez l’homme, le foie est le seul organe capable de régénération1. Ceci est essentiel, car le foie est un organe essentiel, responsable des fonctions métaboliques clés, du stockage de l’énergie, de la désintoxication du sang, de la sécrétion de protéines plasmatiques et de la production de bile2. Les hépatocytes perdus en raison de dommages toxiques ou inflammatoires sont remplacés principalement par division des hépatocytes restants1. Un modèle expérimental classique pour l’étude de la régénération du foie est l’hépatectomie partielle, où les lobes individuels du foie sont enlevés, laissant les lobes restants intacts3. Cette procédure a été initialement développée chez le rat, dans laquelle environ deux tiers de la masse hépatique est enlevée. Après hépatectomie partielle chez les mammifères, une régénération compensatoire se produit dans les lobes restants jusqu’à ce que le foie récupère sa masse initiale. Notamment, le foie des mammifères ne remplace pas les lobes manquants.
Le poisson zèbre (Danio rerio) représente un modèle traitable pour l’étude de la régénération des organes adultes4. Le foie de poisson zèbre, bien que structurellement différent du foie de mammifères, est composé des mêmes types de cellules et remplit la même fonction que chez les mammifères2. Il est composé de trois lobes, avec deux lobes dorsaux et un seul lobe ventral qui sont aplatir le long de l’intestin. L’hépatectomie partielle a été précédemment réalisée chez le poisson zèbre, avec des récits contradictoires quant au mode précis de régénération. Typiquement, une hépatectomie partielle d’un tiers est réalisée par ablation de l’ensemble du lobe ventral. Les rapports initiaux ont indiqué qu’après l’élimination du lobe ventral, il a été complètement régénéré en une semaine5,6,7,ce qui suggère que contrairement au foie de mammifère, le foie de poisson zèbre est capable de régénération épimorphique. Des études ultérieures ont démontré que l’ablation du lobe ventral entraînait une régénération compensatoire dans les lobes dorsaux, plutôt que la régénération du lobe ventral manquant, et finalement la récupération de la masse hépatique dans un délai de8,9. Le profilage transcriptomique des lobes dorsaux après la résection du lobe ventral a indiqué les changements significatifs liés à la régénération compensatoire10. Étant donné que le mode de régénération du foie peut varier avec l’étendue de la blessure8, nous avons spéculé que les écarts dans les résultats peuvent être dus à la variation technique dans le protocole partiel d’hépatectomie entre les groupes de recherche.
Ce protocole décrit un procédé pour exécuter un hepatectomy partiel d’un tiers sur le poisson zèbre adulte en enlevant le lobe ventral. Cette technique sera utile pour évaluer les mécanismes de régénération du foie.

<table><tbody><tr><td>Solution aqueuse de paraformaldéhyde à 16 %,</td><td>microscopie électronique de</td> qualité EM Sciences <td>15700</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon Centrifuge Tubes, polypropylène,</td><td>Corning</td> stérile <td>352098</td><td></td></tr><tr><td>AS 82/220.R2 PLUS Balance analytique</td><td>Bay State Scale & Systems, INC.</td><td>WL-104-1051</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pince</td> Outils <td>de science fine</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>EMS Kuehne Pince de protection/échantillon</td><td>Sciences de microscopie électronique</td><td>72997-07</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td></td></tr><tr><td>Mastertop Cellulose Nettoyage Éponge à récurer</td><td>Amazon</td><td>B07CBSM53Z</td><td></td></tr><tr><td>PBS10X Liquid Conc 4L</td><td>EMD Millipore</td><td>6505-4L</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ciseaux super fins, 3 1/4" droits</td><td>Instruments de recherche biomédicale</td><td>11-1020</td><td></td></tr><tr><td>Méthanesulfonate de tricaïne</td><td>Syndel</td><td>TRIC-M-GR-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20, Fisher BioReagents</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte

Partial Hepatectomy in Adult Zebrafish

L’insuffisance hépatique est l’une des principales causes de décès dans le monde, et la mortalité due aux maladies chroniques du foie augmente fortement aux États-Unis. Les foies sains sont capables de se régénérer des dommages toxiques, mais dans les maladies hépatiques avancées, la capacité naturelle du foie à se régénérer est altérée. Le poisson zèbre est devenu un puissant système expérimental pour l’étude de la régénération. Ils sont un modèle idéal pour étudier la régénération du foie à partir d’une hépatectomie partielle, une procédure ayant une pertinence clinique directe dans laquelle une partie du foie est enlevée chirurgicalement, laissant le reste intact. Il n’y a aucun protocole standard pour l’hépatectomie partielle; des études antérieures utilisant ce modèle ont utilisé des protocoles légèrement différents et ont rapporté des résultats disparates. Décrit ici est un protocole efficace et reproductible pour effectuer une hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte. Nous utilisons cette technique pour démontrer que les poissons zèbres sont capables de régénération épimorphe du lobe réséqué. Ce protocole peut être utilisé pour interroger davantage les mécanismes nécessaires à la régénération du foie chez le poisson zèbre.

Afin d’examiner le potentiel régénérateur du foie adulte de poisson zèbre, nous avons exécuté hepatectomy partiel (PHX) dans le poisson zèbre adulte. En général, de grands adultes (30-40 mm de longueur) ont été sélectionnés, allant de 1,5 à 2,5 ans. Dans le cadre d’expériences individuelles, les animaux ont été sélectionnés dans le même réservoir et ont été appariés selon l’âge et la taille. Comme contrôle approprié, nous avons utilisé des chirurgies simulées dans lesquelles l’animal a été anesthésié et a reçu une grande...

Ce protocole décrit la procédure pour enlever le lobe ventral du foie dans le poisson zèbre adulte pour permettre l’étude de la régénération de foie.

Hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte

Liver failure is one of the leading causes of death worldwide, and mortality from chronic liver disease is rising sharply in the United States. Healthy ...

Ce protocole permettra aux chercheurs de tirer parti des outils chimiques et génétiques disponibles pour étudier les mécanismes de régénération du foie chez le poisson zèbre. L’hépatectomie partielle permet l’ablation précise des tissus pour stimuler la régénération du foie sans avoir besoin des effets à l’échelle du corps des lésions hépatiques toxiques. Ce n’est qu’en comprenant les mécanismes moléculaires et cellulaires de la régénération du foie que nous pouvons concevoir de nouvelles thérapies pour traiter les patients atteints d’une maladie hépatique avancée.Pour commencer, retirez les poissons du réservoir de Tricaine à l’aide de pinces et intégrez-les dans la rainure d’une éponge imbibée de Tricaine avec la face ventrale vers le haut. Placez ensuite l’éponge sous un microscope de dissection avec éclairage descendant. Pincez la peau et les écailles juste après le cœur avec une pince fine et créez un trou dans la cavité corporelle en faisant une coupe sous la pince avec le ciseau à ressort.Faites pivoter l’éponge et faites une incision de trois à quatre millimètres le long de l’abdomen en coupant postéralement vers les nageoires pelviennes. Ensuite, faites pivoter l’éponge ve

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La transplantation de moelle rein entier chez le poisson zèbre pour adultes

Le rein zebrafish abrite à la fois rénale et hématopoïétique adulte cellules souches / progénitrices, et représente une occasion exceptionnelle d'étudier ces types de cellules et de leur progéniture dans un organisme modèle vertébré. Ici, nous démontrons une procédure de dissection détaillé qui permet au chercheur d'identifier et d'enlever chirurgicalement le rein poisson zèbre adulte, qui peut être utilisé pour des applications telles que l'isolement cellulaire, la transplantation, et les...

Dissection du rein Zebrafish adultes

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L’utilisation du poisson-zèbre pour la recherche cardiovasculaire s’étend à la recherche sur les cœurs adultes. Pour ces applications, l’isolement rapide et simple des tissus cardiaques est essentiel afin d’éviter les modifications post-mortem et d’obtenir un nombre adéquat d’échantillons. Nous décrivons ici une méthode rapide et reproductible pour disséquer des cœurs de poissons-zèbres adultes.

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Pour aider à évaluer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération biliaire du foie due au poisson-zèbre, nous avons établi un modèle de lésion hépatique dans lequel les hépatocytes exprimant la nitroréductase sont génétiquement ablatés lors d’un traitement au métronidazole.  Dans ce protocole, nous décrivons comment manipuler, surveiller et analyser habilement l’ablation des hépatocytes et la régénération hépatique induite par les voies biliaires.

Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

Une fibrose soutenue avec dépôt excessif de protéines de la matrice extracellulaire conduit à la cirrhose. L’abus d’alcool est l’une des principales causes de maladies graves du foie. Nous avons établi un modèle de foie fibrotique de poisson-zèbre induit par l’éthanol pour étudier les mécanismes et les stratégies de promotion de la régénération des hépatocytes lors de lésions induites par l’alcool.

Développement d&#39;un fibrotique du foie Modèle induite de l&#39;éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

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Il reste un défi majeur pour développer conditionnelle gène-knockdown gène-masquage ou efficace dans les organes de poisson-zèbre adulte. Nous rapportons ici un protocole pour exécutante siARN médiée par les nanoparticules gène-baffle en coeur de poisson-zèbre adulte, fournissant ainsi une nouvelle méthode de perte de fonction pour l’étude des organes adultes dans le poisson-zèbre et autres organismes modèles.

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Ici nous démontrons une méthode pour quantifier la taille du foie dans le poisson zèbre larvaire, fournissant un moyen d'évaluer les effets des manipulations génétiques et pharmacologiques sur la croissance et le développement de foie.

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Ici, nous présentons comment générer un modèle de poisson zèbre associé à la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) associé au carcinome hépatocellulaire (CHC) pour étudier l’impact du surplus de cholestérol sur le microenvironnement hépatique et le paysage des cellules immunitaires.

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Une nouvelle méthode d’injection intrapéritonéale (IP) chez le poisson-zèbre adulte est décrite. Lors de la manipulation de composés toxiques tels que la doxorubicine, cette procédure est plus efficace que les deux méthodes de propriété intellectuelle précédemment mentionnées. La technique est conçue pour être facilement adoptée par les chercheurs ayant une expérience limitée du modèle du poisson zèbre.

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Découvrez une méthode d'hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte pour étudier la régénération hépatique. Ce protocole permet d'analyser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la repousse du foie avec une grande reproductibilité.

Hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte

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