Stratégies d’optimisation de l’acquisition de données de tomographie électronique cryogénique

La mise en place d’une session de collecte de données à grande échelle est une procédure fastidieuse qui peut réduire considérablement le temps de microscope restant disponible pour l’acquisition de séries d’inclinaison. Cette méthode permet une configuration rapide de l’acquisition automatisée de données de tomographie à grande échelle afin de maximiser l’efficacité temporelle des expériences de tomographie qui nécessitent une sélection minutieuse des cibles d’acquisition. Commencez par ouvrir une instance SerialEM factice.

Une fois le premier carré de grille mappé, utilisez l’option de menu du navigateur SerialEM fusionner pour voir le montage dans l’instance SerialEM factice. Double-cliquez sur la fenêtre du navigateur pour ouvrir la carte carrée de la grille. Recherchez la carte et utilisez l’option de navigateur SerialEM factice ajouter des points pour ajouter des points d’acquisition d’image sur la cible d’intérêt.

Après avoir mappé les nouveaux carrés, enregistrez le fichier du navigateur et fusionnez à nouveau le navigateur. Continuez jusqu’à ce que tous les carrés de la grille soient mappés. Encore une fois, fusionnez le fichier de navigateur avec l’instance SerialEM factice.

Exécutez le script de cartes virtuelles Pi EM à partir du menu SerialEM factice. Sélectionnez des outils et sélectionnez des cartes d’ancrage virtuelles. Cela peut prendre un certain temps en fonction de la taille et de la quantité des cartes carrées de la grille, ainsi que du binning des cartes d’affichage et d’aperçu.

Pour garantir des performances de microscope correctes, utilisez le même grossissement et la même configuration de taille de faisceau pour l’acquisition de données dans l’ordre suivant. Exécutez SerialEM coma-free alignment by CTF. Insérez et centrez une ouverture d’objectif.

Exécutez SerialEM astigmatism correct par CTF et GIF quick tune. Dans SerialEM, ouvrez le nouveau fichier de navigation. Désélélez tous les points A.

Sélectionnez les cartes de la première vue. Sélectionnez Réduire. Cliquez deux fois sur A et désétraitez la réduction.

Sélectionnez la première position de la carte d’affichage. Appuyez sur Maj T, puis sélectionnez la toute dernière position de la carte d’affichage et appuyez à nouveau sur Maj T. Choisissez des images à image unique dans les propriétés du fichier pour ouvrir une boîte de dialogue.

Dans la boîte de dialogue des propriétés du fichier suivant, sélectionnez les paramètres souhaités en fonction des besoins d’imagerie et de la configuration de l’instrument. Lorsque vous y êtes invité, donnez un nom avec un numéro et cliquez sur Enregistrer. Configurez le contrôleur de la série d’inclinaison pour la première position TS.

Lorsque vous avez terminé, cliquez sur OK pour définir ces paramètres pour toutes les séries d’inclinaison après cet élément d’acquisition. Toutes les cartes d’aperçu sont maintenant sélectionnées comme TS avec un nom de fichier numéroté. Si nécessaire, définissez la distance de mise au point/suivi pour chaque cible.

Double-cliquez sur la carte d’affichage pour la charger. Sélectionnez la carte d’aperçu dans la liste du navigateur. Sélectionnez ensuite Modifier le focus dans la fenêtre du navigateur.

Dans le panneau de commande à faible dose, désélirez l’axe de rotation entre les zones pour positionner l’essai et faire la mise au point le long de l’axe d’inclinaison de la scène. Cliquez sur la région souhaitée dans la carte d’affichage chargée pour définir la position d’essai de mise au point pour cette série d’inclinaison et vous assurer que l’élément de navigateur a TSP défini. Répétez la procédure pour tous les éléments.

Modifiez la plage de mise au point dans le script PreTomo qui s’exécute avant chaque série d’inclinaison. Dans le menu Série d’inclinaisons SerialEM, cochez exécuter le script dans TS et sélectionnez le numéro de script du script DuringTomo lors de chaque inclinaison. Vérifiez le niveau du réservoir d’azote et si le turbo du chargeur automatique désactivé est sélectionné.

Vérifiez l’espace libre de stockage des données. Dans le menu Fichier SerialEM, déséllez l’enregistrement continu pour le fichier journal. Chaque série d’inclinaison aura son propre fichier journal.

Après avoir cliqué sur acquérir aux éléments dans le menu de navigation, exécutez le script PreTomo. Sélectionnez la tâche principale acquérir une série d’inclinaisons, puis sélectionnez Exécuter le script après PostTomo. Sélectionnez fermer les vannes de colonne à la fin et envoyez un e-mail à la fin, puis cliquez sur go.

71 carrés appropriés ont été sélectionnés sur la carte de la grille à un grossissement inférieur. Des cartes à grossissement moyen ont été acquises avec des paramètres qui permettent la visualisation directe et l’identification de l’échantillon d’intérêt, les coronavirus dans ce cas. Le temps d’acquisition était de trois minutes par carré, trois heures et 45 minutes au total.

Lors de la création de la première carte carrée, une instance SerialEM factice a été ouverte sur un ordinateur séparé pour visualiser la carte carrée et ajouter des points sur des cibles adaptées à l’acquisition de séries d’inclinaison. SerialEM à faible dose a été mis en place et des images de vue de référence et d’aperçu ont été prises et enregistrées sous forme de cartes. Ces dernières cartes peuvent ensuite être utilisées immédiatement sur l’instance fictive de SerialEM pour générer la vue virtuelle et l’aperçu virtuel à partir des images de carte carrée correspondantes.

Les cartes de vue virtuelle ont été utilisées pour un centrage initial de la cible, suivi d’un centrage final effectué au grossissement d’acquisition de la série d’inclinaison réelle à l’aide de la carte de prévisualisation virtuelle. Les utilisateurs doivent se donner suffisamment de temps pour explorer l’exemple de paysage. Après avoir recherché quelques cartes, on développe une meilleure idée des zones de bonne qualité pour collecter des données.