Name: Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Découvrez la préparation de tranches pulmonaires de précision chez la souris pour étudier la structure et la contractilité vasculaire. Cette méthode ex vivo permet l'imagerie en temps réel et les analyses moléculaires des maladies pulmonaires.

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Les auteurs tiennent à remercier les Drs Yuan Hao et Kaifeng Liu pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par un NIH 1R01 HL150106-01A1, la bourse Parker B. Francis et le prix de recherche Aldrighetti de l’Association pour l’hypertension pulmonaire au Dr Ke Yuan.

Tous les soins aux animaux ont été conformes aux lignes directrices du Boston Children’s Hospital et les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Les souris utilisées dans cette étude sont des souris sauvages de type C57/B6 et des souris croisées Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. Préparation des solutions
<ol><li>Préparer à l’avance une solution tampon de phosphate (1x PBS) et une solution d’agarose à 2% requise pendant l’expérience.<ol>
<li>Mélanger 2 g de poudre d’agarose dans 100 mL d’eau autoclavée. Chauffez-le au micro-ondes quelques secondes à la fois jusqu’à ce que la solution soit claire.</li>
		<li>Placer la solution au bain-marie à 42 °C jusqu’à utilisation. REMARQUE: Le PBS et l’agarose à 2% peuvent être conservés à température ambiante pendant des semaines.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extraction du poumon de la souris
<ol><li>Euthanasier la souris par surdosage d’isoflurane. Obtenez un surdosage d’isoflurane en plaçant une petite quantité d’isoflurane sur du papier de soie au niveau inférieur et en plaçant la souris au niveau supérieur dans un dessiccateur. La souris reste dans le dessiccateur jusqu’à ce qu’elle soit inconsciente.</li>
	<li>Assurer la mort de la souris en appliquant une pression inférieure sur le cou et en tirant caudale sur la queue. Amenez la souris sur la surface de dissection.</li>
	<li>Placez la souris en position couchée et fixez-la en place en scotchant les pattes et le nez à la table avec du ruban adhésif.</li>
	<li>Vaporisez la surface ventrale de la souris avec 70% d’éthanol et essuyez l’excès d’éthanol.</li>
	<li>Soulevez la peau abdominale de la souris avec une pince à l’emplacement de la vessie et coupez à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux, en se déplaçant de manière supérieure vers la région cervicale, exposant la trachée.</li>
	<li>Soulevez la couche fasciale sous-jacente avec une pince à épiler et coupez-la avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer les organes viscéraux et le compartiment médiastinal, en coupant à nouveau de manière inférieure à supérieure.</li>
	<li>Coupez le sternum à la ligne médiane pour exposer le cœur et les poumons.</li>
	<li>À l’aide d’une dissection émoussée, détachez le diaphragme du foie et du compartiment abdominal.</li>
	<li>Localisez la veine cave inférieure (CIV) sous les intestins et coupez la CIV.</li>
	<li>Localisez le ventricule droit. REMARQUE: Le ventricule droit aura un aspect plus léger par rapport au ventricule gauche et le septum intraventriculaire doit être visualisé, séparant le ventricule droit du ventricule gauche.</li>
	<li>Injecter 0,5 mL d’héparine fractionnée à 1 % dans le ventricule droit avec une aiguille papillon de 25 à 30 G, puis rincer lentement mais régulièrement avec 10 à 15 mL de 1x PBS(Figure 1A).<ol>
<li>Attention à ne pas insérer l’aiguille dans le cœur et à injecter de l’héparine dans la cavité médiastinale. REMARQUE: L’injection de 1x PBS rend le tissu pulmonaire blanc. Le liquide extravasant de l’aorte abdominale doit être clair et incolore et le foie peut devenir blanc en apparence après un rinçage réussi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Localisez le larynx et disséquez le fascia et les tissus environnants à l’aide d’une pince à épiler à pointe émoussée.</li>
	<li>Placez la suture chirurgicale sous la trachée et nouez lâchement un nœud chirurgical.</li>
	<li>Placez un petit trou dans la trachée supérieur à la ficelle et canulez avec une aiguille émoussée de 20 G.</li>
	<li>Serrez la suture autour de l’aiguille et de la trachée à l’aide d’un nœud chirurgical.</li>
	<li>Injecter 2,5 à 4 mL d’agarose dans la trachée et surveiller l’inflation du poumon.</li>
	<li>Après l’instillage de l’agarose, versez 1x PBS froid et réfrigéré sur le poumon pour solidifier l’agarose.</li>
	<li>Coupez la trachée supérieure à la suture chirurgicale et disséquez le poumon et le cœur du médiastin en enlevant les adhérences et le fascia.</li>
	<li>Après solidification, placer 1x DMEM (assez pour immerger les tissus) dans une boîte de Petri pour rester sur la glace. Trancher immédiatement un lobe à l’aide d’une machine à vibratome (Figure 1B).</li>
</ol>3. Tranches de poumon coupées avec précision
<ol><li>Fixez l’échantillon à la plate-forme avec de la supercolle, en gardant le côté médial de l’échantillon tourné vers le haut.</li>
	<li>Remplissez le récipient d’échantillon avec 1x PBS, en vous assurant que l’échantillon est complètement immergé.</li>
	<li>Remplissez le récipient entourant le récipient d’échantillon avec de la glace pour garder le PBS environnant et l’échantillon au froid.</li>
	<li>Allumez le vibratome et ajustez-le aux paramètres souhaités ci-dessous.<ol>
<li>Réglez l’épaisseur sur 300um.</li>
		<li>Réglez la fréquence sur 100 Hz.</li>
		<li>Réglez l’amplitude sur 0,6 mm.</li>
		<li>Réglez la vitesse sur 5 μm/s.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l’aide d’une clé Allen, tournez le porte-lame en position de sécurité et ouvrez les mâchoires pour insérer une lame.</li>
	<li>Serrez les mâchoires avec une clé Allen et tournez le porte-lame dans la position appropriée pour le tranchage.</li>
	<li>Placez l’échantillon et la plate-forme sur la boîte et faites glisser devant la lame.</li>
	<li>Remplissez la boîte autour de la plate-forme d’échantillon avec 1x PBS jusqu’à ce que l’échantillon soit submergé.</li>
	<li>Amenez la lame du vibratome jusqu’au bord du bloc et abaissez manuellement la lame jusqu’à ce qu’elle soit uniforme avec le haut de l’échantillon.</li>
	<li>Confirmez les paramètres appropriés et exécutez le vibratome (Figure 2).</li>
	<li>Au fur et à mesure que les tranches fraîches sont coupées, retirez les échantillons du PBS et placez-les dans une boîte de Petri stérile avec 10 mL de 1x DMEM contenant 1x antibiotique-antimycotique.</li>
	<li>Lorsque vous avez terminé, rétractez entièrement la lame, puis utilisez la clé Allen pour la mettre dans une position sûre.</li>
	<li>Conservez les échantillons dans 1x DMEM dans un incubateur à 37 °C avec une viabilité préservée jusqu’à 10 jours (voir l’expérience de viabilité ci-dessous).</li>
</ol>4. Exemple d’expérience vasoconstrictrice
<ol><li>Placez une tranche de vibratome sur une lame de microscope.</li>
	<li>Avant de le placer sur la glissière, utilisez une lingette nettoyante pour vous débarrasser de l’excès de milieu (PBS).</li>
	<li>Placez l’échantillon sous microscopie à contraste de phase et utilisez un grossissement de 10 à 20x pour identifier un récipient.</li>
	<li>Mettez 500 μL de vasoconstricteurs, tels que 60 mM KCl ou 1 μM d’endothéline-1 pour immerger complètement la lame.</li>
	<li>Observez et capturez la vidéo en enregistrant pendant 30 s-60 s (Vidéo 1).</li>
</ol>5. Préparation du tissu pour la lyse de l’ARN ou des protéines sur le PCLS
<ol><li>Avant de commencer l’expérience, remplissez une petite boîte en mousse de polystyrène avec 1 L d’azote liquide.</li>
	<li>Placer deux petits tubes de microcentrifugation (1,5 mL) dans le récipient avec de l’azote liquide avant de commencer. REMARQUE: L’azote liquide doit refroidir à l’extérieur des tubes, mais pas à l’intérieur. Assurez-vous de manipuler l’azote liquide avec soin et n’exposez pas la peau à l’azote liquide. Utilisez des pinces et des gants pour placer et retirer les tubes de la boîte.</li>
	<li>Placez 4-5 tranches de vibratome frais dans un bol de mortier.</li>
	<li>Versez 5 à 10 mL de liquide N2 sur les tranches dans le bol de mortier.</li>
	<li>Utilisez rapidement le pilon pour broyer les tranches de congélation éclair en poudre avant que l’azote liquide ne s’évapore. REMARQUE: Les tissus doivent se condenser en une poudre fine. Si ce n’est pas le cas, ajoutez de l’azote liquide supplémentaire jusqu’à ce qu’il soit atteint.</li>
	<li>À l’aide d’une pelle de laboratoire en acier (pré-refroidie avec de l’azote liquide), pré-cuillère la poudre dans les deux tubes de microcentrifugation réfrigérés.</li>
	<li>Lyser la poudre en ajoutant 500 μL de réactif d’extraction d’ARN pour procéder à l’isolement de l’ARN ou 500 μL de tampon RIPA (contient 1x inhibiteurs de la protéase) pour procéder à la lyse des protéines.</li>
	<li>Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à l’isolement supplémentaire de l’ARN, la mesure de l’ACA et le transfert western.</li>
</ol>6. Détermination de la viabilité
<ol><li>Après la préparation du vibratome, placer deux tranches de poumon dans une plaque de culture de 24 puits avec 450 μL de milieu DMEM et 50 μL de réactif de viabilité cellulaire (assurez-vous que le tissu est entièrement immergé).</li>
	<li>Replacez les échantillons dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant la nuit avec une exposition minimale à la lumière.</li>
	<li>Le matin, observez la solution pour le changement de couleur. La solution bleue devient rose lorsque le tissu est viable.</li>
</ol>7. Préservation de l’étiquetage cellulaire
<ol><li>Traiter un Cdh5-CreERT2 transgénique croisé avec une souris Ai14 tdTomato avec une injection IP de tamoxifène (2 mg/ jour) pendant un total de 5 jours (dose totale de 10 mg de tamoxifène) pour induire des cellules tdTomato label Cre positives.</li>
	<li>Une semaine après l’injection, préparez les poumons en suivant les étapes 1 à 3 ci-dessus.</li>
	<li>Après la préparation de la tranche de poumon coupée avec précision, placez le tissu sur une lame de microscope et placez un couvercle sur le dessus du tissu.</li>
	<li>Utilisez un microscope confocal pour détecter la coloration tdTomato (en utilisant la longueur d’onde d’excitation 555 nm).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Dans ce manuscrit, une méthode améliorée pour produire des images à haute résolution du tissu pulmonaire murin qui préserve la structure vasculaire et optimise la flexibilité expérimentale est décrite, en utilisant spécifiquement l’application de PCLS pour obtenir des microslices de tissu pulmonaire qui peuvent être visualisés en trois dimensions avec une contractilité préservée du système vasculaire. En utilisant le réactif de viabilité, le protocole démontre que des tranches soigneusement préparées et conservées peuven...

Les progrès dans la préparation et l’imagerie du tissu pulmonaire qui préserve les composants cellulaires sans sacrifier la structure anatomique fournissent une compréhension détaillée des maladies pulmonaires. La capacité d’identifier les protéines, l’ARN et d’autres composés biologiques tout en maintenant la structure physiologique offre des informations vitales sur l’arrangement spatial des cellules qui peuvent élargir la compréhension de la physiopathologie dans de nombreuses maladies pulmonaires. Ces images détaillées peuvent conduire à une meilleure compréhension des maladies vasculaires pulmonaires, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, lorsqu’elles sont appliquées à des modèles animaux, ce qui peut conduire à des stratégies thérapeutiques améliorées.
Malgré les progrès technologiques, l’obtention d’images de haute qualité du tissu pulmonaire murin reste un défi. Le cycle respiratoire est entraîné par une pression intrathoracique négative générée lors de l’inhalation1. Lors de l’obtention traditionnelle de biopsies et de la préparation d’échantillons pulmonaires pour l’imagerie, le gradient de pression négative est perdu, ce qui entraîne l’effondrement des voies respiratoires et du système vasculaire, qui ne se représente plus dans son état actuel. Pour obtenir des images réalistes reflétant les conditions actuelles, les voies respiratoires pulmonaires doivent être regonflées et le système vasculaire perfusé, transformant le poumon dynamique en un luminaire statique. L’application de ces techniques distinctes permet de préserver l’intégrité structurelle, le système vasculaire pulmonaire et les composants cellulaires, y compris les cellules immunitaires telles que les macrophages, ce qui permet de voir le tissu pulmonaire aussi près que possible de son état physiologique.
Le tranchage pulmonaire coupé avec précision (PCLS) est un outil idéal pour étudier l’anatomie et la physiologie du système vasculaire pulmonaire2. PCLS fournit une imagerie détaillée du tissu pulmonaire en trois dimensions tout en préservant les composants structurels et cellulaires. Le PCLS a été utilisé dans des modèles animaux et humains pour permettre des images vivantes et à haute résolution des fonctions cellulaires en trois dimensions, ce qui en fait un outil idéal pour étudier des cibles thérapeutiques potentielles, mesurer la contraction des petites voies respiratoires et étudier la physiopathologie des maladies pulmonaires chroniques telles que la MPOC, la MFI et le cancer du poumon3. En utilisant des techniques similaires, l’exposition d’échantillons de PCLS à des vasoconstricteurs peut préserver la structure pulmonaire et la contractilité des vaisseaux, reproduisant ainsi des conditions in vitro. En plus de préserver la contractilité, les échantillons préparés peuvent subir des analyses supplémentaires telles que le séquençage de l’ARN, le transfert Western et la cytométrie en flux lorsqu’ils sont préparés correctement. Enfin, les cellules marquées par couleur rapporteur marquées avec la fluorescence tdTomato après la récolte pulmonaire peuvent préserver l’étiquetage après la préparation des microselices, ce qui le rend idéal pour les études de suivi cellulaire. L’intégration de ces techniques fournit un modèle sophistiqué préservant l’arrangement spatial des cellules et la contractilité des vaisseaux qui peut conduire à une compréhension plus détaillée des cascades de signalisation et des options thérapeutiques potentielles dans la maladie vasculaire pulmonaire.
Dans ce manuscrit, le tissu pulmonaire murin PCLS est exposé à des vasoconstricteurs, démontrant une intégrité structurelle préservée et une contractilité des vaisseaux. L’étude démontre que les tissus préparés et manipulés de manière appropriée peuvent rester viables pendant 10 jours. L’étude démontre également la préservation des cellules à fluorescence endogène (tdTomato), permettant aux échantillons de fournir des images à haute résolution du système vasculaire pulmonaire et de l’architecture. Enfin, des moyens de manipuler et de préparer des tranches de tissu pour la mesure de l’ARN et le transfert Western pour étudier les mécanismes sous-jacents ont été décrits.

<table><tbody><tr><td>0,5 cc d’héparine fractionnée dans la seringue</td><td>BD</td><td>100 unités USP par mL</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning</td><td>&nbsp ; 21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille à extrémité émoussée de calibre 20 1/2 pouce pour canulation de la trachée</td><td>Cml Supply</td><td>90120050D</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 30cc</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Anti Anti solution</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Microtome à lame vibrante automatisée</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td><td>Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Confocéphale</td><td>Zeiss</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié et GLutaMAX, complété par 10 % de FBS, 1 % Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Mortier et pilon</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RIPA Tampon de lyse et d’extraction</td><td>Thermoscientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Suture chirurgicale 6/0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif</td><td>Invitrogen, Thermofisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose à bas point de fusion</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de prélèvement sanguin ailé (aiguille papillon) 25-30G</td><td>BD</td><td>25-30G</td><td></td></tr></tbody></table>

les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

La visualisation du tissu pulmonaire murin fournit des informations structurelles et cellulaires précieuses concernant les voies respiratoires et le système vasculaire sous-jacent. Cependant, la préservation des vaisseaux pulmonaires qui représente vraiment des conditions physiologiques présente encore des défis. De plus, la configuration délicate des poumons murins entraîne des défis techniques dans la préparation d’échantillons pour des images de haute qualité qui préservent à la fois la composition cellulaire et l’architecture. De même, des tests de contractilité cellulaire peuvent être effectués pour étudier le potentiel des cellules à répondre aux vasoconstricteurs in vitro,mais ces tests ne reproduisent pas l’environnement complexe du poumon intact. Contrairement à ces problèmes techniques, la méthode de la tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS) peut être appliquée comme une alternative efficace pour visualiser le tissu pulmonaire en trois dimensions sans biais régional et servir de modèle de contractilité de substitution vivant jusqu’à 10 jours. Les tissus préparés à l’aide de PCLS ont conservé la structure et l’orientation spatiale, ce qui les rend idéaux pour étudier les processus pathologiques ex vivo. L’emplacement des cellules endogènes tdTomato-marqué dans le PCLS récoltées à partir d’un modèle murin tdTomato reporter inductible peut être visualisé avec succès par microscopie confocale. Après exposition à des vasoconstricteurs, le PCLS démontre la préservation de la contractilité des vaisseaux et de la structure pulmonaire, qui peuvent être capturées par un module time-lapse. En combinaison avec les autres procédures, telles que le transfert de Western et l’analyse de l’ARN, le PCLS peut contribuer à la compréhension globale des cascades de signalisation qui sous-tendent une grande variété de troubles et conduire à une meilleure compréhension de la physiopathologie dans les maladies vasculaires pulmonaires.

Lorsqu’il est ajouté aux cellules ou aux tissus, le réactif de viabilité est modifié par l’environnement réducteur des tissus viables et devient rose / rouge, devenant très fluorescent. Les changements de couleur représentatifs détectés du jour 0-1 et du jour 9-10 sont illustrés à la figure 3. Comme indiqué, la solution a commencé en bleu et est devenue rose du jour au lendemain, démontrant ainsi sa viabilité. Le changement de couleur se produit généralement dans les 1-4 h; cependant, un dél...

Présenté ici est un protocole pour préserver la contractilité vasculaire du tissu pulmonaire murin PCLS, résultant en une image tridimensionnelle sophistiquée du système vasculaire pulmonaire et des voies respiratoires, qui peut être préservée jusqu’à 10 jours et qui est sensible à de nombreuses procédures.

Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

La méthode des tranches pulmonaires coupées avec précision préservera la structure et les orientations spatiales en trois dimensions sans biais régional et peut servir de modèle de substitution vivant pour les mesures de la contractilité des vaisseaux et des voies respiratoires. En combinaison avec l’imagerie time-lapse, le transfert western et l’analyse de l’ARN, les tranches pulmonaires coupées avec précision contribuent à la compréhension globale des cascades de signalisation qui sous-tendent une grande variété de troubles et conduisent à une meilleure compréhension de la physiopathologie des maladies vasculaires pulmonaires. Pour commencer, placez la souris adulte euthanasiée en position couchée et fixez-la en place en scotchant les pattes et le nez à la table avec du ruban adhésif.Vaporiser la surface ventrale de la souris avec 70% d’éthanol. Utilisez des pinces pour soulever la peau abdominale de la souris à l’emplacement de la vessie et des ciseaux chirurgicaux pour couper à la ligne médiane, en se déplaçant de manière supérieure vers la région cervicale pour exposer la trachée. Ensuite, utilisez une pince à épiler pour soulever la couche de fascia sous-jacente et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour exposer les organes viscéraux et le compartiment médiastinal, coupant à nouveau de manière inférieure à supérieure.Coupez le sternum à la ligne médiane pour exposer le cœur et les poumons. Disséquez soigneusement le diaphragme du foie et du compartiment abdominal. Localisez la veine cave inférieure sous les intestins et coupez-la.Après avoir localisé le ventricule droit, utilisez une aiguille papillon de calibre 25 à 30 pour injecter 0,5 millilitre d’héparine fractionnée à 1% dans le ventricule droit et rincez-le lentement mais régulièrement avec 10 à 15 millimètres de PBS. Après avoir localisé le larynx, utilisez une pince à épile émoussée pour disséquer le fascia et les tissus environnants, puis placez la suture chirurgicale sous la trachée et nouez lâchement un nœud chirurgical. Placez un petit trou dans la trachée supérieur à la ficelle et canulez avec une aiguille émoussée de calibre 20.Serrez la suture autour de l’aiguille et de la trachée à l’aide d’un nœud chirurgical. Injectez ensuite 2,5 à 4 millilitres d’agarose dans la trachée et surveillez l’inflation du poumon. Après l’injection d’agarose, versez du PBS froid sur le poumon pour solidifier l’agarose.Ensuite, coupez la trachée supérieure à la suture chirurgicale et disséquez le poumon et le cœur du médiastin en enlevant les adhérences et le fascia. Après la solidification, placez le tissu dans le DMEM dans une boîte de Petri sur de la glace et procédez immédiatement au tranchage d’un lobe à l’aide d’une machine à vibratome. Pour préparer les tranches de poumon, fixez l’échantillon à la plate-forme avec de la supercolle, en gardant le côté médial tourné vers le haut.Remplissez ensuite le récipient d’échantillon avec PBS. Remplissez le récipient avec de la glace pour garder le PBS environnant et échantillonnez au froid. Allumez le vibratome.Ajustez l’épaisseur à 300 micromètres, la fréquence à 100 Hertz, l’amplitude à 0,6 millimètre et la vitesse à cinq micromètres par seconde. À l’aide d’une clé Allen, tournez le porte-lame en position de sécurité et ouvrez les mâchoires pour insérer une lame. Ensuite, serrez les mâchoires avec une clé Allen.Placez l’échantillon sur la boîte, en vous assurant qu’il est immergé dans PBS. Faites glisser la boîte dans la bonne position et assurez-vous qu’elle est sécurisée. Tournez le support de lame dans la position appropriée pour le tranchage.Amenez la lame du vibratome jusqu’au bord du bloc et abaissez manuellement la lame jusqu’à ce qu’elle soit uniforme avec le haut de l’échantillon. Confirmez les paramètres et exécutez le vibratome. Une fois les tranches fraîches coupées, retirez les échantillons du PBS et placez-les dans une boîte de Petri stérile avec 10 millilitres de DMEM contenant un antibiotique antimycotique unique.Après avoir placé toutes les tranches dans une boîte de Pétri, rétractez entièrement la lame et utilisez la clé Allen pour soulever la lame dans une position sûre. Conservez les échantillons dans du DMEM à 37 degrés Celsius. Et placez une tranche de vibratome sur une lame de microscope.Utilisez une lingette nettoyante pour éliminer l’excès de liquide. Placez l’échantillon sur la microscopie à contraste de phase et utilisez un grossissement de 10 à 20X pour identifier un récipient. Ajoutez ensuite 500 microlitres de vasoconstricteurs, tels que du chlorure de potassium de 60 millimolaires ou un endothéline-1 micromolaire pour immerger complètement la lame.Observez et capturez la vidéo en enregistrant pendant 30 à 60 secondes. Avant de commencer l’expérience, remplissez une petite boîte en mousse de polystyrène avec un litre d’azote liquide et placez deux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre dans le récipient avec de l’azote liquide. Placez quatre à cinq tranches de vibratome frais dans un bol de mortier.Versez 5 à 10 millilitres d’azote liquide sur les tranches et utilisez rapidement le pilon pour broyer les tranches en poudre avant que l’azote liquide ne s’évapore. Utilisez une pelle de laboratoire en acier pré-réfrigéré pour pré-réfrigérer la poudre dans les deux tubes de microcentrifugation réfrigérés et lyser la poudre en ajoutant 500 microlitres de réactif d’extraction d’ARN pour l’isolement de l’ARN ou 500 microlitres de tampon RIPA pour la lyse des protéines. Dans l’expérience de viabilité représentative, le changement de couleur des tranches PCLS a été détecté du jour zéro au premier jour et du neuvième au 10e jour.La solution était initialement bleue et est devenue rose du jour au lendemain, démontrant ainsi sa viabilité. Le changement de couleur s’est généralement produit dans les une à quatre heures, mais un temps plus long peut être nécessaire. La différence quotidienne entre l’absorbance à des longueurs d’onde de 562 et 613 nanomètres pour le tissu préparé par vibratome est montrée ici.La constriction du système vasculaire dans un tissu pulmonaire préparé par vibratome à l’aide d’endothéline-1 et de chlorure de potassium peut être visualisée ici. La préservation du label tdTomato dans les cellules une semaine après l’injection de tamoxifène est démontrée dans ces tranches pulmonaires. Il est très important de bien effectuer l’étape de clairage et de gonflage des poumons pour retirer tout le sang de la circulation avant des expériences et des images supplémentaires.En plus des maladies vasculaires, le PCLS peut être appliqué pour étudier la physiobiologie des maladies liées aux voies respiratoires et peut être testé davantage sur les tissus pulmonaires humains dans des scénarios cliniquement pertinents.

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Les cultures d’explants de tissus primaires organotypiques, qui comprennent des tranches découpées avec précision, représentent l’architecture tissulaire tridimensionnelle (3D) ainsi que les interactions multicellulaires des tissus natifs. Cette vidéo décrit la culture de tranches de tissus murins dérivés d’une tumeur pulmonaire à l’aide d’une unité d’incubation rotative, un système qui permet une exposition intermittente des tissus à l’oxygène et aux nutriments. Le protocole décrit la...

Culture d’explants de tissus de tumeurs pulmonaires : une procédure pour générer et cultiver des tranches de tumeurs pulmonaires coupées avec précision

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure permettant de gonfler des poumons humains isolés avec de l’agarose et de préparer des tranches de poumons humains découpées avec précision. Les coupes pulmonaires ex vivo préparées peuvent être utilisées pour d’autres expériences immunologiques.

Préparation à base d’agarose de tranches de poumon humain coupées avec précision

La vasoconstriction pulmonaire hypoxique (HPV) est un phénomène physiologique important par lequel à l’hypoxie alvéolaire la perfusion pulmonaire est assortie à la ventilation. Le segment vasculaire principal contribuant au VPH est l’artère intra-acinnaire. Ici, nous décrivons notre protocole pour l’analyse du VPH des vaisseaux pulmonaires murins d’un diamètre de 20 à 100 μm.

Analyse vidéomorphométrique de la vasoconstriction pulmonaire hypoxique des artères intra-pulmonaires à l’aide de tranches pulmonaires coupées de précision murine

Nous décrivons un procédé pour générer des tranches de poumon couper avec précision (PCLS) et les immunocoloration pour visualiser la localisation de divers types de cellules immunitaires dans le poumon. Notre protocole peut être étendu pour visualiser l'emplacement et la fonction de différents types de cellules dans une variété de conditions.

coupe de précision de la souris Tranches Lung pour visualiser les cellules vivantes pulmonaire dendritiques

Compte tenu du principe des 3 r, modèles respiratoires comme des alternatives aux études sur les animaux évoluent. Surtout pour l’évaluation des risques des substances respiratoires, il y a un manque d’essais appropriés. Nous décrivons ici l’utilisation de tranches de poumon humain de coupe de précision pour l’évaluation des substances véhiculées.

Évaluation de la cytotoxique et effets immunomodulateurs de Substances dans des tranches de poumon humain de coupe de précision

Ce protocole fournit une méthode simple et fiable pour la production de tranches de foie de précision viables de souris. Les échantillons de tissu ex vivo peuvent être maintenus dans des conditions de culture tissulaire de laboratoire pendant plusieurs jours, fournissant un modèle flexible pour examiner la pathobiologie de foie.

Murine Precision-Cut Liver Slices comme un modèle Ex Vivo de biologie du foie

Ce protocole décrit une méthode pour générer des tissus pulmonaires modifiés reproductibles à petite échelle, en repeuplant des tranches pulmonaires décellularisées coupées avec précision avec des cellules épithéliales alvéolaires de type 2, des fibroblastes et des cellules endothéliales.

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Le présent protocole décrit la préparation et l’utilisation de tranches pulmonaires coupées avec précision par des souris pour évaluer la contractilité des voies respiratoires et des muscles lisses artériels intrapulmonaires dans un milieu presque in vivo .

Utilisation de la tranche pulmonaire coupée avec précision pour étudier la régulation contractile des voies respiratoires et du muscle lisse artériel intrapulmonaire

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Coupe automatisée par vibratome de tissu pulmonaire enrobé d’agarose pour l’imagerie par fluorescence multiplex

Ici, nous décrivons un protocole simple et économique pour effectuer une quantification non biaisée de la densité microvasculaire pulmonaire pour des tissus pulmonaires de souris entières en utilisant une coloration unique de l’isolectine B4.

Quantification de la densité microvasculaire pulmonaire chez la souris à travers les lobules

Découvrez la préparation de tranches pulmonaires de précision chez la souris pour étudier la structure et la contractilité vasculaire. Cette méthode ex vivo permet l'imagerie en temps réel et les analyses moléculaires des maladies pulmonaires.

Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires (Vidéo) | JoVE Journal

Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires

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