In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

L’objectif global de ce protocole est d’analyser des aspects clés importants de la fonction de la ligase E3, y compris la spécificité de l’enzyme E2, la sélection du substrat et le transfert de l’ubiquitine. Le principal avantage de cette technique est sa large applicabilité, car les protéines de toutes les sources eucaryotes peuvent être exprimées et étudiées in vitro de manière recombinante sans avoir besoin d’un équipement spécial. Lorsque vous utilisez la technique de décharge de lysine pour la première fois, il est important d’optimiser les paramètres de dosage, tels que les concentrations enzymatiques, afin d’identifier les conditions de décharge idéales pour la ligase E3 de choix.

Pour effectuer un test d’auto-ubiquitylation in vitro, mettez en place un schéma de pipetage pour tester la capacité fonctionnelle de différentes enzymes E2 et préparez un mélange maître sur glace pour toutes les réactions d’ubiquitylation plus une réaction supplémentaire. Ensuite, ajoutez un micromolaire d’enzymes E2 aux tubes appropriés et incubez les échantillons dans un cycleur thermique PCR pendant deux heures dans les conditions indiquées. Après l’incubation, ajoutez un tampon d’échantillon SDS à chaque réaction et mélangez en pipetant plusieurs fois.

Ensuite, faites bouillir immédiatement les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes et stockez les protéines dénaturées à 20 degrés Celsius. Pour effectuer un test d’ubiquitylation de substrat in vitro, préparez le schéma de pipetage pour toutes les réactions. Après avoir calculé la quantité de mélange maître requise pour une réaction, préparez le mélange maître pour toutes les réactions sur la glace et ajoutez le mélange maître à chaque tube.

Ajoutez les ligas E3 respectives individuellement. Ensuite, incubez les échantillons dans le cycleur thermique PCR pendant deux heures, comme démontré. À la fin de l’incubation, ajoutez deux fois le tampon de l’échantillon SDS à chaque réaction, mélangez plusieurs fois par pipetage et faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius.

Pour effectuer un test de décharge de lysine, configurez le schéma de pipetage pour la réaction de charge et incubez les réactions de charge pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Pour arrêter la réaction de charge, ajoutez l’apyrase à une concentration finale de 1,8 unité par millilitre et incubez la réaction pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter l’EDTA à une concentration finale de 30 millimolaires et utiliser de l’eau double distillée pour ajuster le volume de la réaction à 30 microlitres.

Pour décharger l’ubiquitylation E2 par E3, configurez cinq tubes correspondant aux points temporels de l’expérience, ajoutez 6,7 microlitres de tampon d’échantillon non réducteur à chaque tube, retirez six microlitres de la réaction de charge arrêtée du tube du point de temps zéro et ajustez le volume total à 26,7 microlitres. Pour mettre en place les réactions de décharge, ajoutez de l’eau double distillée, du tampon d’ubiquitylation, du BSA, de la lysine, de la ligase E3 et de l’E2 chargé à chaque réaction. Après les périodes sélectionnées, transférer des échantillons de 20 microlitres de chaque réaction de décharge vers le tube d’échantillonnage correspondant.

Ensuite, vortex immédiatement les échantillons et placez-les à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Dans cette analyse représentative par transfert western, le CHIP inactif n’était pas auto-ubiquitylé. Cependant, les produits d’ubiquitine indépendants de l’E3 ont été formés en présence de CHIP inactif et en l’absence de CHIP.

Le CHIP de type sauvage était auto-ubiquitylé lorsqu’il était combiné avec les protéines des familles UBE2D et UBE2E, tandis que les chaînes de polyubiquitine libre étaient produites en coopération avec les protéines de la famille UBE2D mais pas avec les protéines de la famille UBE2E. La liaison de l’ubiquitine par UBE2N/V1 a dirigé la formation de chaînes d’ubiquitine libres. L’auto-ubiquitylation et l’ubiquitylation de l’UNC-45B ont été observées avec le CHIP de type sauvage mais pas avec le mutant inactif du CHIP, ce qui indique que l’UNC-45B agit comme un substrat conservé pour le CHIP.

Lorsque l’activité catalytique de CHIP a été analysée à l’aide d’un test de décharge de lysine, l’enzyme UBE2D2 non chargée avait un poids moléculaire de 17 kilodaltons et l’UBE2D2 chargée avec une seule molécule d’ubiquitine avait un poids moléculaire d’environ 26 kilodaltons. Au moment 0, la totalité du rendement E2 chargé a été observée. En présence de CHIP inactif, une faible décharge D’UBE2D2 sans ligase E3, mais pas d’auto-ubiquitylation de CHIP, a été détectée.

En présence de CHIP de type sauvage, la décharge d’UBE2D2 a été rapide et terminée en 60 minutes, et l’auto-ubiquitylation de CHIP indiquait un transfert d’ubiquitine sur ses propres résidus de lysine. En raison de la capacité E2 limitée, travaillez le plus rapidement possible et procédez immédiatement à la réaction de décharge suivie de SDS-PAGE et de Western blotting. En suivant ces protocoles d’ubiquitylation in vitro, les types spécifiques de liaison d’ubiquitylation peuvent être identifiés en sondant les transferts de Western avec des anticorps spécifiques à la liaison.