Name: In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Découvrez des protocoles in vitro pour analyser l'activité des ligases E3 ubiquitine et la coopération E2-E3. Ces méthodes permettent d'évaluer la spécificité des substrats et le transfert d'ubiquitine sans équipement spécialisé.

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Nous remercions les membres de notre laboratoire pour leur discussion critique et leurs conseils utiles sur le manuscrit. Nous nous excusons de ne pas avoir cité de précieuses contributions en raison de la limitation de taille. Ce travail est soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 et Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD à TH. Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne - EXC 2030 - 390661388 et - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

1. Préparation des tampons et des réactifs
REMARQUE : Les tampons et les réactifs qui ont été préparés manuellement en laboratoire sont énumérés ci-dessous. Tous les autres tampons et réactifs utilisés dans les protocoles ont été achetés auprès de différentes sources et utilisés conformément aux instructions des fabricants.
<ol><li>Préparez 10x solution saline tamponnée au phosphate (10x PBS). À cette fin, mélanger 1,37 M de chlorure de sodium (NaCl), 27 mM de chlorure de potassium (KCl), 80 mM de dihydrate de dihydrate d’hydrogène-phosphate disodique (Na2HPO4,2H2O) et 20 mM de phosphate de potassium-dihydrogène (KH2PO4) dans 1 L deH2Odouble distillé (ddH2O). Autoclavez le PBS 10x et préparez une solution 1x PBS en ddH2O.<ol>
<li>L’autoclavage est effectué pendant 15 min à 121 °C et 98,9 kPa. REMARQUE: L’autoclavage est effectué dans ces conditions pour tous les tampons et solutions. Sauf indication contraire, les solutions sont conservées à température ambiante (RT).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 1 L de solution PBS-Tween (PBS-T) en ajoutant 0,1 % de Tween à 1 L de 1x PBS.</li>
	<li>Préparer 10 mL d’une solution mère de L-lysine de 0,5 Men dissolvant la L-lysine dans ddH2 O. Aliquoter L-lysine en portions de 1 mL et les conserver à -20 °C jusqu’à nouvel usage. REMARQUE: La L-lysine peut être congelée et décongelée à plusieurs reprises.</li>
	<li>Préparer une solution d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) de 0,25 M en dissolvant l’EDTA dans 200 mL de ddH2O.<ol>
<li>Ajuster le pH à 8,0 avec de l’hydroxyde de sodium (NaOH).</li>
		<li>Réglez le volume à 250 mL avec ddH2O.</li>
		<li>Autoclavez la solution.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 10 mL d’une solution d’albumine sérique bovine (BSA) de 20 mg/mL en dissolvant le BSA dans ddH2O. Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 200 μL. REMARQUE: BSA peut être congelé et décongelé à plusieurs reprises.</li>
	<li>Préparer 1 L de tampon d’acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique (MES) en dissolvant 50 mM de MES, 50 mM de base de Tris, 3,47 mM de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 1,03 mM d’EDTA dans 0,9 L deddH2O. Après avoir mélangé correctement, réglez le volume à 1 L.<ol>
<li>Le pH du tampon 1x est de 7,6. N’ajustez pas le pH avec de l’acide ou de la base.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer 200 mL de solution bloquante (lait à 5 %) en dissolvant 10 g de lait en poudre dans 1x PBS-T. Conserver la solution bloquante à 4 °C jusqu’à une semaine.</li>
	<li>Préparer 1 L de tampon de transfert (voir le tableau des matériaux)selon les instructions du fabricant.</li>
	<li>Préparer 2x tampon d’échantillon de FDS en dissolvant 125 mM de base de Tris, 4 % de FDS, 4 % de glycérol, 0,03 % de bleu de bromophénol et 50 μL/mL de β-mercaptoéthanol dans 50 mL de ddH2O. Aliquotet en portions de 1 mL et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.</li>
</ol>2. Essai d’auto-ubiquitylation in vitro
<ol><li>Préparation et exécution des essais<ol>
<li>Calculer le volume de chaque réactif requis par réaction en fonction des molarités données des protéines et des concentrations protéiques des solutions protéiques. Par réaction d’auto-ubiquitylation, utilisez 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3 et 50 μM Ub. Réglez le volume de la réaction à 20 μL avec ddH2O. REMARQUE: La solution d’ATP et le tampon d’ubiquitylation ont été achetés en tant que solutions mères 10x et utilisés à 1x.</li>
		<li>Préparez un schéma de pipetage pour toutes les réactions. Testez neuf enzymes E2 différentes pour leur capacité à fonctionner (I) avec CHIP, (II) avec un mutant CHIP(H260Q) catalytiquement inactif, et (III) sans CHIP dans des réactions d’ubiquitylation individuelles.</li>
		<li>Pour éviter les erreurs de pipetage, préparez un mélange maître sur glace qui contient le volume requis pour toutes les réactions plus une réaction supplémentaire. Calculez la quantité de mélange maître requise par réaction. REMARQUE: Les composants du mélange maître sont des réactifs qui sont également requis pour chaque réaction, c’est-à-direE1, E3, Ub, ATP et tampon d’ubiquitylation.</li>
		<li>Ajouter ddH2O et le mélange maître aux tubes de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Gardez les tubes sur la glace.</li>
		<li>Avant de commencer les réactions d’ubiquitylation en ajoutant les enzymes E2, mettez en place un cycleur thermique PCR avec le programme suivant: 2 h, 37 °C suivi de 4 °C, à l’infini.</li>
		<li>Ajouter 1 μM des enzymes E2 dans les tubes respectifs et incuber les échantillons dans le cycleur thermique PCR pendant la période indiquée.</li>
		<li>Après 2 h, ajoutez un tampon d’échantillon SDS à chaque réaction et mélangez en pipetant plusieurs fois de haut en bas. REMARQUE : Le volume requis du tampon d’échantillon dépend de la concentration en stock du tampon d’échantillon. Ici, 20 μL de tampon d’échantillon SDS 2x ont été ajoutés à chaque réaction.</li>
		<li>Faire bouillir les échantillons immédiatement à 95 °C pendant 5 min, et continuer avec l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE). Conserver les protéines dénaturées à -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Électrophorèse sur gel et transfert western<ol>
<li>Après la décongélation, faites tourner les échantillons pendant environ 10 s et chargez le gel SDS-PAGE. Utilisez une échelle de protéines comme référence de taille. REMARQUE: Ici, 4-12% de gels de gradient Bis-Tris et 3 μL d’échelle de protéines ont été utilisés. Divisez les volumes d’échantillon et chargez deux gels de manière égale en utilisant 20 μL de chaque échantillon.</li>
		<li>Faites couler le gel à 160-200 V pendant environ 30-45 min afin que le front de l’échantillon atteigne le fond du gel.</li>
		<li>Transférer chaque gel dans un récipient en plastique rempli de tampon de buvard semi-sec et l’incuber pendant 2 à 5 minutes à RT. Retirez le gel empilable.</li>
		<li>Préparez deux morceaux de papier buvard de la taille d’un gel et une membrane de nitrocellulose de la taille d’un gel de la taille d’un gel et pré-trempez dans un tampon de buvard semi-sec. Assemblez le sandwich western blot (WB) dans une chambre WB de bas en haut dans l’ordre suivant : papier buvard, membrane de nitrocellulose, gel SDS-PAGE, papier buvard.</li>
		<li>Enlevez les bulles d’air qui peuvent avoir été piégées entre les couches sandwich. À cette fin, utilisez un rouleau pour rouler soigneusement sur le sandwich plusieurs fois.</li>
		<li>Fermez la chambre et laissez l’excès de tampon de transfert s’écouler.</li>
		<li>Placez la chambre dans le dispositif de buvard respectif et utilisez le programme suivant pour le buvard semi-sec: 25 V, 1,0 A, 30 min.</li>
		<li>Transférer la membrane tachée dans un récipient en plastique rempli de solution bloquante et incuber pendant 30 min à TA.</li>
		<li>Préparer la solution d’anticorps primaire en ajoutant l’anticorps à 10 mL de PBS-T contenant un réactif bloquant (voir la Table des matériaux). REMARQUE: La concentration de travail de l’anticorps est spécifique à l’anticorps. Dans ce cas, un anticorps anti-ubiquitine monoclonal de souris a été utilisé à une dilution de 1:5 000. Pour le deuxième gel, un anticorps monoclonal anti-CHIP de lapin a été utilisé à 1:5 000 dans le pbS-T/réactif bloquant.</li>
		<li>Remplacer la solution bloquante par la solution d’anticorps primaire et incuber pendant la nuit à 4 °C sur une bascule.</li>
		<li>Lavez la membrane trois fois pendant 10 min avec du PBS-T.</li>
		<li>Préparer la solution d’anticorps secondaire en ajoutant l’anticorps respectif à 10 mL de PBS-T. REMARQUE: Ici, les anticorps anti-souris et anti-lapin de chèvre et de souris sont utilisés à une dilution de 1:10 000.</li>
		<li>Incuber la membrane avec l’anticorps secondaire pendant 1 h à TA sur une bascule.</li>
		<li>Lavez la membrane trois fois pendant 5 min avec PBS-T.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des données<ol>
<li>Ajouter des réactifs de détection par transfert western pour les anticorps conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) à la membrane lavée conformément aux instructions du fabricant, et capturer le signal HRP à l’aide de films à rayons X ou d’une caméra à couplage de charge (Figure 1).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Essai d’ubiquitylation de substrat in vitro
<ol><li>Préparation et exécution des essais<ol>
<li>Calculer le volume de chaque réactif requis par réaction, en fonction des molarités données des protéines et des concentrations protéiques des solutions protéiques. Par réaction d’ubiquitylation du substrat, utilisez 100 nM E1, 1 μM E2, 1 μM E3, 1 μM de substrat et 50 μM Ub. Utilisez 10x solution d’ATP et 10x tampon d’ubiquitylation à 1x. Ajuster le volume de la réaction d’ubiquitylation du substrat à 20 μL avec ddH2O.</li>
		<li>Préparez un schéma de pipetage pour toutes les réactions. Inclure des réactions de contrôle appropriées vérifiant que l’ubiquitylation du substrat est spécifique à l’E3. Utilisez la protéine UNC-45B comme substrat représentatif de CHIP et un mutant CHIP catalytiquement inactif (H260Q) comme témoin. Préparer les réactions suivantes: E1, E2, Ub mélange (y compris Ub, ATP, tampon d’ubiquitylation); E1, E2, mélange Ub, UNC-45B; E1, E2, Ub mix, CHIP(H260Q), UNC-45B; et E1, E2, Ub mix, CHIP, UNC-45B.</li>
		<li>Pour éviter les erreurs de pipetage, préparez un mélange maître sur glace qui contient le volume requis pour toutes les réactions plus une réaction supplémentaire. Calculez le volume du mélange principal requis par réaction. REMARQUE: Les composants du mélange principal pour ce test comprennent E1, E2, Ub, ATP et tampon d’ubiquitylation.</li>
		<li>Ajouter les composants de réaction dans l’ordre suivant : ddH2O, substrat, E3 ligase.</li>
		<li>Avant de commencer la réaction d’ubiquitylation par addition du mélange maître, mettez en place un cycleur thermique PCR avec le programme suivant: 2 h, 37 °C suivi de 4 °C, à l’infini.</li>
		<li>Ajouter le mélange maître à chaque tube et incuber les échantillons dans le cycleur thermique PCR pendant la période indiquée.</li>
		<li>Après 2 h, ajoutez 2x tampon d’échantillon SDS à chaque réaction et mélangez en pipetant plusieurs fois de haut en bas.</li>
		<li>Après l’exécution, faire bouillir les échantillons immédiatement à 95 °C pendant 5 min, puis continuer avec PAGE. Alternativement, stockez les protéines dénaturées à -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Électrophorèse sur gel et transfert western<ol>
<li>Effectuer l’électrophorèse sur gel et le transfert western comme décrit à la rubrique 2.2. Utilisez des anticorps spécifiques pour la détection du substrat et de la ligase E3, respectivement. REMARQUE: Ici, UNC-45B est fusionné à une étiquette de protéine polypeptidique dérivée du produit du gène c-myc permettant l’utilisation d’un anticorps anti-MYC monoclonal de souris. Anti-MYC est utilisé à 1:10 000.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse des données<ol>
<li>Effectuer l’analyse des données comme décrit à la section 2.3 (Figure 2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Dosage de décharge de lysine
<ol><li>Préparation et exécution des essais<ol><li>Charge de l’enzyme E2 avec Ub par E1<ol>
<li>Calculer le volume de chaque réactif requis par réaction en fonction des molarités données des protéines et des concentrations protéiques des solutions protéiques. Par réaction de charge, utilisez 2 μM E1, 4 μM E2 et 4 μM d’ubiquitine sans lysine (Ub K0). Utilisez 10x ATP et 10x tampon d’ubiquitylation à 1x. Réglez le volume de la réaction de charge à 20 μL avec ddH20. REMARQUE: Le mutant Ub K0 sans lysine est utilisé pour renforcer la production exclusive d’E2 mono-ubiquitylé. Ub de type sauvage peut également être utilisé; cependant, cela pourrait conduire à diverses modifications E2 ~ Ub(par exemple,poly-ubiquitylation de E2), qui sont plus difficiles à analyser. Pour la première utilisation ou lors de l’utilisation d’une nouvelle enzyme E2, déterminez le niveau de charge Ub sur E2 qui peut être atteint par E1. Pour déterminer le rendement de la charge, visualisez l’E2 non chargé par rapport à l’E2 chargé via la coloration coomassie. Ici, environ la moitié de Ub K0 a été convertie de manière fiable en UBE2D2 ~ Ub lors de l’utilisation de rapports équimolaires de UBE2D2 et Ub K0(figure supplémentaire S2A).</li>
			<li>Préparez un schéma de pipetage pour la réaction de charge. Ajustez le volume de la réaction de charge aux réactions de décharge ultérieures de votre choix, par exemple,utilisez CHIP et CHIP (H260Q) dans des réactions de décharge individuelles. Ainsi, préparez le double du volume d’une réaction de charge. REMARQUE: Pour la première utilisation, testez différentes concentrations de la ligase E3 de votre choix pour surveiller les conditions de décharge optimales et analysez-les par transfert western. Dans des conditions idéales, la décharge d’Ub de E2 augmentera au fil du temps jusqu’à ce que la bande protéique E2 ~ Ub respective disparaisse.</li>
			<li>Incuber la réaction de charge pendant 15 min à 37 °C.</li>
		</ol></li>
		<li>Fin de la réaction de charge<ol>
<li>Arrêter la réaction de charge par addition d’apyrase à une concentration finale de 1,8 U/mL. Effectuer l’incubation avec de l’apyrase pendant 5 min à RT, suivie de l’ajout d’EDTA à une concentration finale de 30 mM. Réglez le volume de la réaction de charge à 30 μL avec ddH2O. REMARQUE: L’apyrase est utilisée pour convertir les molécules d’ATP en molécules d’ADP (adénosine diphosphate). Comme l’activité de l’enzyme E1 dépend de l’ATP, E1 ne peut plus charger E2. L’EDTA est également utilisé pour s’assurer que l’E1 est inhibé par la trempe des ions Mg2+ qui sont des cofacteurs nécessaires pour l’E1. Le volume d’apyrase nécessaire pour arrêter la réaction peut varier selon les conditions d’essai. Bien que l’apyrase seule éteigne déjà les molécules d’ATP disponibles, une combinaison d’apyrase et d’EDTA était plus efficace pour arrêter la réaction de charge de la paire E1-UBE2D2. Comme l’arrêt de la réaction est un facteur critique pour la reproductibilité du test, un arrêt efficace doit être testé pour les nouvelles paires E1-E2. À cette fin, configurez une réaction de charge, arrêtez-la et collectez des échantillons à des moments précis, par exempleaprès 2, 5, 10 et 15 minutes. Les niveaux inchangés de E2 ~ Ub indiquent que la réaction s’est arrêtée et que le thioester était stable pendant cette période de temps (Figure supplémentaire S2B).</li>
		</ol></li>
		<li>Décharge de E2 ~ Ub par E3<ol>
<li>Préparer quatre tubes correspondant aux différents points temporels (t0, t1, t2, t3); ajouter un tampon d’échantillon non réducteur (6,7 μL de tampon 4x de dodécylsulfate de lithium (LDS)) à chaque tube. Remarque : N’utilisez pas d’agent réducteur dans l’exemple de tampon.</li>
			<li>Retirez 6 μL de la réaction de charge arrêtée pour t0et réglez le volume à 20 μL avec ddH2O.</li>
			<li>Incuber l’échantillon t0 pendant 10 min à 70 °C. REMARQUE: Ne pas faire bouillir l’échantillon en prolongeant le temps d’incubation car les thioesters sont labiles à des températures plus élevées.</li>
			<li>Calculer le volume de chaque réactif requis par réaction de décharge. Utilisez les 24 μL restants de l’E2 chargé et ajoutez 10 mM de L-lysine, 1 mg/ml de BSA et 500 nM de ligase E3. Utilisez le tampon d’ubiquitylation à 1x et réglez le volume à 80 μL avec ddH2O.</li>
			<li>Préparez un schéma de pipetage pour toutes les réactions de décharge et utilisez CHIP(H260Q) comme contrôle en plus de CHIP(WT).</li>
			<li>Mettez en place des réactions de décharge sur la glace en ajoutant les composants requis dans l’ordre suivant: ddH2O, tampon d’ubiquitylation, BSA, lysine, ligase E3 et E2 chargé pour démarrer la réaction.</li>
			<li>Incuber la réaction de décharge à RT.</li>
			<li>Prélever des échantillons après 5, 30 et 60 min en transférant 20 μL de la réaction de décharge dans les tubes d’échantillonnage respectifs. REMARQUE: Les points temporels appropriés qui permettent une surveillance appropriée de la décharge peuvent varier entre les paires E2-E3.</li>
			<li>Vortex l’échantillon immédiatement, et l’incuber à 70 °C pendant 10 min.</li>
			<li>Passez directement à PAGE. REMARQUE: E2 ~ Ub thioesters peuvent être labiles même après la dénaturation dans le tampon de l’échantillon. Ainsi, l’électrophorèse sur gel doit être effectuée directement après l’exécution du test.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Électrophorèse sur gel et transfert western<ol>
<li>Effectuer l’électrophorèse sur gel et le transfert western comme décrit à la rubrique 2.2. Utilisez un anticorps spécifique à l’Ub et, si disponible, utilisez également un anticorps spécifique à l’E3 qui a été élevé chez une espèce différente, permettant la détection simultanée du signal de ligase Ub et E3.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des données<ol>
<li>Effectuer l’analyse des données comme décrit à la section 2.3 (Figure 3).</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Cet article décrit les méthodes d’ubiquitylation in vitro de base pour l’analyse de la fonction de la ligase E3. Lors de la réalisation de tests d’ubiquitylation in vitro, il convient de considérer que certaines enzymes E2 peuvent effectuer une auto-ubiquitylation en raison de l’attaque de leur cystéine active sur leurs propres résidus de lysine situés à proximité du site actif30. Pour contourner ce problème, l’utilisation d’un mutant E2 est recommandée dans lequel le résidu de l...

L’ubiquitylation est le processus par lequel Ub est lié de manière covalente à une protéine de substrat1. La modification Ub est catalysée par des réactions enzymatiques successives impliquant l’action de trois classes d’enzymesdifférentes, à savoir les enzymes activatrices Ub (E1s), les enzymes conjuguantes Ub (E2s), les ligas Ub (E3s), et éventuellement les facteurs d’allongement de la chaîne Ub (E4s)2,3,4,5. Après l’activation de l’Ub dépendant de l’adénosine triphosphate (ATP) et du magnésium (Mg2+),le site actif cystéine d’E1 attaque la glycine C-terminale d’Ub, formant un complexe thioester (Ub ~E1). L’énergie tirée de l’hydrolyse de l’ATP permet à l’Ub d’atteindre un état de transition à haute énergie, qui est maintenu tout au long de la cascade enzymatique suivante. Ensuite, l’enzyme E2 transfère l’Ub activé à sa cystéine catalytique interne, formant ainsi une liaison transitoire Ub ~ E2 thioester. Par la suite, Ub est transféré à la protéine de substrat.
Cela peut être fait de deux manières. Soit la ligase E3 peut d’abord se lier à E2, soit la ligase E3 peut se lier directement à Ub. Cette dernière méthode aboutit à la formation d’un intermédiaire E3 ~ Ub. Dans les deux cas, Ub est lié à la protéine du substrat par la formation d’une liaison isopeptide entre le groupe carboxyle C-terminal d’Ub et le groupe lysine Ɛ-amino du substrat6. Le génome humain code deux E1, environ 40 E2, et plus de 600 ligases putatives d’ubiquitine7. Sur la base du mécanisme de transfert Ub de l’E3, les ligas Ub sont divisées en trois catégories impliquant le type Homologue au type E6AP C-Terminus (HECT), le type Really Interesting New Gene (RING) / U-box et le RING entre les ligas de type RING (RBR)8. Dans cette étude, la boîte en U contenant de la ligase, Carboxyl Terminus de la protéine en interaction HSC70 (CHIP), est utilisée comme enzyme E3 représentative. Contrairement aux enzymes E3 de type HECT qui forment des thioesters Ub ~ E3, le domaine U-box de CHIP lie E2 ~ Ub et favorise le transfert ultérieur Ub / substrat directement à partir de l’enzyme E28,9. Sur la base de l’importance de la boîte en U pour la fonction enzymatique, un mutant CHIP U-box inactif, CHIP (H260Q), est utilisé comme contrôle. CHIP(H260Q) ne parvient pas à se lier à ses E2 apparentés, perdant ainsi son activité de ligase E310.
L’ubiquitylation des protéines joue un rôle crucial dans la régulation d’une multitude d’événements cellulaires dans les cellules eucaryotes. La diversité des résultats cellulaires favorisés par l’attachement réversible des molécules Ub aux protéines du substrat peut être attribuée aux caractéristiques moléculaires de l’Ub. Comme Ub lui-même contient sept résidus de lysine (K) pour une ubiquitylation ultérieure, il existe une riche variété de types de chaînes Ub de tailles et/ou de topologies différentes11. Par exemple, les substrats peuvent être modifiés par une seule molécule Ub à une (mono-ubiquitylation) ou plusieurs lysines (multi mono-ubiquitylation), et même par des chaînes Ub (poly-ubiquitylation)11. Les chaînes Ub sont formées homo- ou heterotypiquement via les mêmes ou différents résidus de lysine d’Ub, ce qui pourrait même entraîner des chaînes Ub ramifiées9. Ainsi, l’ubiquitylation des protéines conduit à divers arrangements de molécules Ub qui fournissent des informations spécifiques, par exemple,pour la dégradation, l’activation ou la localisation des protéines conjuguées12,13. Ces différents signaux Ub permettent une reprogrammation rapide des voies de signalisation cellulaire, ce qui est une exigence importante pour la capacité de la cellule à répondre aux besoins environnementaux changeants.
Un aspect central de l’ubiquitylation est lié au contrôle de la qualité des protéines. Les protéines mal repliées ou irréversiblement endommagées doivent être dégradées et remplacées par des protéines nouvellement synthétisées pour maintenir l’homéostasie ou la protéostasie des protéines14. Le contrôle qualité E3 ligase, CHIP, collabore avec des chaperons moléculaires dans la dégradation Ub-dépendante des protéines endommagées9,15,16,17. En dehors de cela, CHIP régule la stabilité du chaperon dirigé par la myosine, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), qui est étroitement coordonné avec la fonction musculaire et les écarts par rapport aux niveaux optimaux conduisent à une myopathie humaine18,19,20,21. La dégradation de l’UNC-45B par le protéasome 26S est médiée par la fixation d’une chaîne poly-Ub liée au K489. En l’absence de protéines de substrat, CHIP effectue une auto-ubiquitylation10,22,23, qui est caractéristique des ligas d’ubiquitine RING/U-box E324,25 et considérée comme régulant l’activité de la ligase26. L’application des méthodes de dosage d’ubiquitylation in vitro décrites dans cet article a permis d’identifier systématiquement les enzymes E2 qui s’associent à CHIP pour favoriser la formation de chaînes poly-Ub libres et/ou l’auto-ubiquitylation de CHIP (section 2 du protocole). En outre, une ubiquitylation dépendante de CHIP de l’UNC-45B a été observée, qui est un substrat connu de la ligase E318,19 (section 3 du protocole). En fin de compte, le transfert dépendant de CHIP de l’Ub activé à partir du thioester Ub ~ E2 a été surveillé (section 4 du protocole).

<table><tbody><tr><td>Amershan Protran 0.1 & micro ; m NC</td><td>GE Healthcare</td><td>10600000</td><td>membrane nitrocellulosique</td></tr><tr><td>Anti-CHIP</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>2080</td><td>Anticorps monoclonal anti-CHIP de lapin, clone C3B6</td></tr><tr><td>Anti-MYC</td><td>Roche</td><td>OP10</td><td>Anticorps anti-MYC de souris monoclonale, clone 9E10</td></tr><tr><td>Anti-ubiquitine</td><td>Upstate</td><td>05-944</td><td>Anticorps anti-Ub de souris monoclonale, clone P4D1-A11</td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma</td><td>A6535-100UN</td><td></td></tr><tr><td>ATP (10x)</td><td>Enzo</td><td>12091903</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A6003-10G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749.2</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>LDS tampon d’échantillon (4x)</td><td>novex</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501-5G</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Roth</td><td>4256.4</td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>VWR Chemicals</td><td>2,08,47,307</td><td>100 %</td></tr><tr><td>Milchpulver</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>P029.3</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE</td><td>Invitrogen</td> antioxydant <td>NP0005</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer tampon (20x)</td><td>novex</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Règle de page plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>26619</td><td>Échelle protéique</td></tr><tr><td>RotiBlock</td><td>Roth</td><td>A151.1</td><td>Réactif de blocage</td></tr><tr><td>SDS (20 %)</td><td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>S1000 Thermocycleur</td><td>Bio Rad</td><td>1852196</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio Rad</td><td>1704150EDU</td><td>Système de transfert</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>UbcH Enzyme</td><td>Set BostonBiochem</td><td>K-980B</td><td>E2 enzymes</td></tr><tr><td>Ubiquitin</td><td>BostonBiochem</td><td>U-100H</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme activatrice de l’ubiquitine E1</td><td>Enzo</td><td>BML-UW941U-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’ubiquitylation (10x)</td><td>Enzo</td><td>BML-KW9885-001</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papier buvard</td><td>Bio Rad</td><td>1703969</td><td>Papier filtre extra épais</td></tr></tbody></table>

in vitro analyse de la fonction e3 ubiquitin ligase

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

La fixation covalente de l’ubiquitine (Ub) au(x) résidu(s) interne(s) de lysine d’une protéine de substrat, un processus appelé ubiquitylation, représente l’une des modifications post-traductionnelles les plus importantes chez les organismes eucaryotes. L’ubiquitylation est médiée par une cascade séquentielle de trois classes d’enzymes, notamment les enzymes activatrices de l’ubiquitine (enzymes E1), les enzymes conjuguant l’ubiquitine (enzymes E2) et les ligas d’ubiquitine (enzymes E3), et parfois les facteurs d’allongement de la chaîne ubiquitine (enzymes E4). Ici, des protocoles in vitro pour les tests d’ubiquitylation sont fournis, qui permettent l’évaluation de l’activité de l’ubiquitine ligase E3, la coopération entre les paires E2-E3 et la sélection du substrat. Les paires E2-E3 coopérantes peuvent être examinées en surveillant la génération de chaînes de poly-ubiquitine libres et/ou l’auto-ubiquitylation de la ligase E3. L’ubiquitylation du substrat est définie par liaison sélective de la ligase E3 et peut être détectée par transfert occidental de la réaction in vitro. En outre, un test de décharge E2 ~ Ub est décrit, ce qui est un outil utile pour l’évaluation directe de la coopération fonctionnelle E2-E3. Ici, le transfert dépendant de l’E3 de l’ubiquitine est suivi de l’enzyme E2 correspondante sur des acides aminés lysine libres (imitant l’ubiquitylation du substrat) ou des lysines internes de la ligase E3 elle-même (auto-ubiquitylation). En conclusion, trois protocoles in vitro différents sont fournis qui sont rapides et faciles à réaliser pour traiter la fonctionnalité catalytique de la ligase E3.

Pour identifier les enzymes E2 qui coopèrent avec l’ubiquitine ligase CHIP, un ensemble de candidats E2 a été testé dans des réactions d’ubiquitylation in vitro individuelles. Les paires E2-E3 coopérantes ont été surveillées par la formation de produits d’ubiquitylation dépendants de l’E3, c’est-à-direl’auto-ubiquitylation de la ligase E3 et la formation de polymères Ub libres. Les produits d’ubiquitylation ont été analysés par western blotting. L’interprétation des données est basée sur la comparaison ...

La présente étude fournit des protocoles détaillés de dosage d’ubiquitylation in vitro pour l’analyse de l’activité catalytique de l’ubiquitine ligase E3. Les protéines recombinantes ont été exprimées à l’aide de systèmes procaryotes tels que la culture d’Escherichia coli.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

L’objectif global de ce protocole est d’analyser des aspects clés importants de la fonction de la ligase E3, y compris la spécificité de l’enzyme E2, la sélection du substrat et le transfert de l’ubiquitine. Le principal avantage de cette technique est sa large applicabilité, car les protéines de toutes les sources eucaryotes peuvent être exprimées et étudiées in vitro de manière recombinante sans avoir besoin d’un équipement spécial. Lorsque vous utilisez la technique de décharge de lysine pour la première fois, il est important d’optimiser les paramètres de dosage, tels que les concentrations enzymatiques, afin d’identifier les conditions de décharge idéales pour la ligase E3 de choix.Pour effectuer un test d’auto-ubiquitylation in vitro, mettez en place un schéma de pipetage pour tester la capacité fonctionnelle de différentes enzymes E2 et préparez un mélange maître sur glace pour toutes les réactions d’ubiquitylation plus une réaction supplémentaire. Ensuite, ajoutez un micromolaire d’enzymes E2 aux tubes appropriés et incubez les échantillons dans un cycleur thermique PCR pendant deux heures dans les conditions indiquées. Après l’incubation, ajoutez un tampon d’échantillon SDS à chaque réaction et mélangez en pipetant plusieurs fois.Ensuite, faites bouillir immédiatement les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes et stockez les protéines dénaturées à 20 degrés Celsius. Pour effectuer un test d’ubiquitylation de substrat in vitro, préparez le schéma de pipetage pour toutes les réactions. Après avoir calculé la quantité de mélange maître requise pour une réaction, préparez le mélange maître pour toutes les réactions sur la glace et ajoutez le mélange maître à chaque tube.Ajoutez les ligas E3 respectives individuellement. Ensuite, incubez les échantillons dans le cycleur thermique PCR pendant deux heures, comme démontré. À la fin de l’incubation, ajoutez deux fois le tampon de l’échantillon SDS à chaque réaction, mélangez plusieurs fois par pipetage et faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius.Pour effectuer un test de décharge de lysine, configurez le schéma de pipetage pour la réaction de charge et incubez les réactions de charge pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Pour arrêter la réaction de charge, ajoutez l’apyrase à une concentration finale de 1,8 unité par millilitre et incubez la réaction pendant cinq minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter l’EDTA à une concentration finale de 30 millimolaires et utiliser de l’eau double distillée pour ajuster le volume de la réaction à 30 microlitres.Pour décharger l’ubiquitylation E2 par E3, configurez cinq tubes correspondant aux points temporels de l’expérience, ajoutez 6,7 microlitres de tampon d’échantillon non réducteur à chaque tube, retirez six microlitres de la réaction de charge arrêtée du tube du point de temps zéro et ajustez le volume total à 26,7 microlitres. Pour mettre en place les réactions de décharge, ajoutez de l’eau double distillée, du tampon d’ubiquitylation, du BSA, de la lysine, de la ligase E3 et de l’E2 chargé à chaque réaction. Après les périodes sélectionnées, transférer des échantillons de 20 microlitres de chaque réaction de décharge vers le tube d’échantillonnage correspondant.Ensuite, vortex immédiatement les échantillons et placez-les à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Dans cette analyse représentative par transfert western, le CHIP inactif n’était pas auto-ubiquitylé. Cependant, les produits d’ubiquitine indépendants de l’E3 ont été formés en présence de CHIP inactif et en l’absence de CHIP.Le CHIP de type sauvage était auto-ubiquitylé lorsqu’il était combiné avec les protéines des familles UBE2D et UBE2E, tandis que les chaînes de polyubiquitine libre étaient produites en coopération avec les protéines de la famille UBE2D mais pas avec les protéines de la famille UBE2E. La liaison de l’ubiquitine par UBE2N/V1 a dirigé la formation de chaînes d’ubiquitine libres. L’auto-ubiquitylation et l’ubiquitylation de l’UNC-45B ont été observées avec le CHIP de type sauvage mais pas avec le mutant inactif du CHIP, ce qui indique que l’UNC-45B agit comme un substrat conservé pour le CHIP.Lorsque l’activité catalytique de CHIP a été analysée à l’aide d’un test de décharge de lysine, l’enzyme UBE2D2 non chargée avait un poids moléculaire de 17 kilodaltons et l’UBE2D2 chargée avec une seule molécule d’ubiquitine avait un poids moléculaire d’environ 26 kilodaltons. Au moment 0, la totalité du rendement E2 chargé a été observée. En présence de CHIP inactif, une faible décharge D’UBE2D2 sans ligase E3, mais pas d’auto-ubiquitylation de CHIP, a été détectée.En présence de CHIP de type sauvage, la décharge d’UBE2D2 a été rapide et terminée en 60 minutes, et l’auto-ubiquitylation de CHIP indiquait un transfert d’ubiquitine sur ses propres résidus de lysine. En raison de la capacité E2 limitée, travaillez le plus rapidement possible et procédez immédiatement à la réaction de décharge suivie de SDS-PAGE et de Western blotting. En suivant ces protocoles d’ubiquitylation in vitro, les types spécifiques de liaison d’ubiquitylation peuvent être identifiés en sondant les transferts de Western avec des anticorps spécifiques à la liaison.

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Biology

Biologie

Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .

In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO

L'ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui joue un rôle important dans les processus cellulaires et est étroitement coordonnée par la désubiquitination. Les défauts dans les deux réactions sous-tendent les pathologies humaines. Nous fournissons des protocoles pour mener la réaction d'ubiquitination et de deubiquitination in vitro utilisant des composants purifiés.

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones In Vitro

Ce protocole vise à établir des protéomes spécifiques à l'ubiquitine (Ubquitin) et à l'ubiquitine (Ubls) afin d'identifier les altérations de ce type de modifications post-traductionnelles (PTM), associées à une condition spécifique telle qu'un traitement ou un phénotype.

Profilage des modifications post-traductions à l'ubiquitine et à l'ubiquitine et identification des modifications importantes

L'objectif de ce manuscrit est de présenter un aperçu des études biochimiques et fonctionnelles complètes des ligases d'ubiquitine E3 de type RING. Ce pipeline en plusieurs étapes, avec des protocoles détaillés, valide une activité enzymatique de la protéine testée et démontre comment lier l'activité à la fonction.

Caractérisation fonctionnelle des ligases d'ubiquitine RING-Type E3 In Vitro et In Planta

Cette méthode décrit l’évaluation des changements mondiaux dans la topologie de chaîne d’ubiquitine. L’évaluation est effectuée par l’application d’une approche protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse.

Analyse en chaîne de l’ubiquitine par surveillance parallèle des réactions

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle critique de la protéine, dont le dérèglement a été impliqué dans de nombreuses maladies humaines. Ce protocole détaille comment l’affichage des phages peut être utilisé pour isoler de nouvelles variantes d’ubiquitine qui peuvent lier et moduler l’activité des ligas E3 qui contrôlent la spécificité, l’efficacité et les modèles d’ubiquitination.

Utilisation de Phage Display pour développer des modulateurs de variante d’ubiquitine pour les ligas E3

Nous fournissons un protocole détaillé pour un test d’ubiquitylation d’un substrat spécifique et d’une ubiquitine-ligase E3 dans des cellules de mammifères. Les lignées cellulaires HEK293T ont été utilisées pour la surexpression des protéines, le substrat polyubiquitylé a été purifié des lysats cellulaires par immunoprécipitation et résolu dans SDS-PAGE. L’immunoblotting a été utilisé pour visualiser cette modification post-traductionnelle.

Évaluation de l’ubiquitylation du substrat par l’ubiquitine-ligase E3 dans les lysats de cellules de mammifères

Une méthode simple et évolutive a été développée pour évaluer la signification fonctionnelle des variantes faux-sens dans Ube3a, un gène dont la perte et le gain de fonction sont liés à la fois au syndrome d’Angelman et au trouble du spectre autistique.

Une méthode évolutive basée sur des cellules pour l’évaluation fonctionnelle des variantes d’Ube3a

Ce protocole explique comment mesurer l’effet de la variation génétique associée aux troubles neurodéveloppementaux sur l’activité de l’enzyme de désubiquitylation en combinant la purification des protéines recombinantes avec des tests de clivage de la chaîne d’ubiquitine.

Mesure de l’activité enzymatique d’enzymes désubiquitylantes associées à des troubles neurodéveloppementaux au moyen d’un test de clivage de la chaîne d’ubiquitine in vitro

L’ubiquitination est un régulateur critique des fonctions intracellulaires des protéines. Ici, nous décrivons deux méthodes de lyse cellulaire pour détecter les niveaux d’ubiquitination des protéines du substrat dans les cellules de mammifères et comparons leur efficacité dans l’analyse des niveaux d’ubiquitination. La surexpression des protéines dans HEK293T cellules a été induite par transfection transitoire, et des protéines ubiquitinées ont été détectées par analyse western blot.

Stratégies comparatives pour la détection de l’ubiquitination dans les lysats cellulaires de mammifères en utilisant SMAD2/SMURF2 comme modèle

Ce protocole décrit une méthode pour ubiquitiner Streptococcus pneumoniae en utilisant un lysat cellulaire de mammifère ou un complexe enzymatique d’ubiquitine pur, suivie d’un traitement avec un complexe protéique VCP/p97-UFD1-NPLOC4 purifié afin d’évaluer son activité bactériolytique, permettant l’étude des effecteurs immunitaires dépendants de l’ubiquitine.

In-vitro Reconstitution de l’ubiquitination bactérienne et élimination médiatisée par VCP/p97

Découvrez des protocoles in vitro pour analyser l'activité des ligases E3 ubiquitine et la coopération E2-E3. Ces méthodes permettent d'évaluer la spécificité des substrats et le transfert d'ubiquitine sans équipement spécialisé.

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

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