Name: Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Découvrez un test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie SRS de l'incorporation de deutérium dans une seule bactérie. Cette méthode réduit le temps d'analyse à 2,5 heures pour des échantillons cliniques complexes comme l'urine et le sang.

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Ce travail a été soutenu par NIH R01AI141439 à J.-X.C et M.S, et R35GM136223 à J.-X.C.

L’utilisation d’échantillons de sang humain est conforme aux directives de l’IRB de l’Université de Boston et des National Institutes of Health (NIH). Plus précisément, les spécimens proviennent d’une banque et sont complètement dépersonnalisés. Ces spécimens ne sont pas considérés comme des sujets humains par le bureau du comité d’examen institutionnel (IRB) de l’Université de Boston.
1. Préparation de la solution mère de bactéries et d’antibiotiques
<ol><li>Préparer la solution mère d’antibiotiques (sulfate de gentamicine ou amoxicilline) à une concentration de 1 mg/mL dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile1x ou un solvant de diméthylsulfoxyde (DMSO) dans des microtubes de 1,5 mL. Dissoudre le sulfate de gentamicine dans une solution stérile de PBS et l’amoxicilline dans un solvant DMSO stérile. Par la suite, conserver la solution antibiotique entre 2 et 8 °C comme suggéré.</li>
	<li>Pour fabriquer un milieu contenant du bouillon Mueller-Hinton ajusté en D2 O (MHB), ajouter 220 mg de base de bouillon MHB à 10 mL deD2Opour obtenir unmilieu contenant 100 % deD2O. Stériliser la solution en filtrant avec des filtres de 200 nm de taille de pores. REMARQUE: Utilisez toujours ce protocole pour la fabrication et la stérilisation des solutions de milieu dans les étapes suivantes.</li>
	<li>Pour préparer des échantillons bactériens pour l’imagerie SRS, ajouter 2 mL de milieu MHB normal, qui ne contient pas de deutérium, à un tube de culture stérile à fond rond, puis le préchauffer à 37 °C.</li>
	<li>Utilisez une boucle stérile pour sélectionner une colonie bactérienne (Escherichia coli BW 25113 ou Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085) de la culture fraîche sur une plaque de gélose tryptique au soja. Ensuite, suspendez-le dans le milieu de culture préchauffé et tourbillonnez doucement pour préparer la suspension bactérienne.</li>
	<li>Incuber les bactéries à 37 °C dans un agitateur à 200 tours par minute (tr/min) jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase logarithmique.</li>
</ol>2. D2O traitement d’incorporation en présence d’antibiotiques (Figure 2a)
<ol><li>Vérifiez la concentration bactérienne en mesurant la densité optique (DO) avec un photomètre à une longueur d’onde de 600 nm.</li>
	<li>Diluer la solution bactérienne en utilisant le milieu MHB normal, qui ne contient pas de deutérium, pour atteindre une concentration cellulaire finale de 8 x 105 UFC/mL. Vortex doucement pour mélanger les cellules bactériennes.</li>
	<li>Préparer 300 μL d’aliquotes de la solution bactérienne dans sept microtubes de 1,5 mL et 600 μL d’aliquotes de la solution bactérienne dans un microtube de 1,5 mL.</li>
	<li>Ajouter 4,8 μL de solution mère d’antibiotique (gentamicine ou amoxicilline) (1 mg/mL) dans le microtube contenant 600 μL de la solution bactérienne, pour porter la concentration finale d’antibiotique à 8 μg/mL.</li>
	<li>Prélever 300 μL de solution sur les 8 μg/mL de solution bactérienne contenant des antibiotiques et ajouter à 300 μL de solution bactérienne pour obtenir une solution bactérienne contenant deux fois un antibiotique dilué (4 μg/mL).</li>
	<li>Répéter la double dilution en série des antibiotiques d’essai, la gentamicine ou l’amoxicilline, jusqu’à ce que le microtube ayant la concentration la plus faible (0,25 μg/mL) soit atteint, et éliminer 300 μL du tube. Pour la gentamicine et l’amoxicilline, les concentrations en série varient de 0,25 μg/mL à 8 μg/mL.<ol><li>Laissez un tube sans antibiotiques pour le contrôle à blanc. Ce sera le contrôle positif pour inspecter l’activité métabolique bactérienne sans traitement antibiotique mais avec un traitementD2O.</li>
		<li>Laissez un tube sans antibiotiques et sans D2O pour le témoin négatif.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber l’aliquote bactérienne avec le certain antibiotique (gentamicine ou amoxicilline) contenant le milieu MHB pendant 1 h.</li>
	<li>Pendant l’incubation, préparer une dilution en série des antibiotiques avec un milieu contenant 100 %D2Oavec le même gradient de concentration que les antibiotiques préparés à l’étape 2.6. Pour la gentamicine et l’amoxicilline, les concentrations en série varient de 0,25 μg/mL à 8 μg/mL.</li>
	<li>Après 1 h de traitement antibiotique, ajouter 700 μL d’antibiotique dilué en série et un milieu MHB contenant 100 % de D 2 O aux 300 μL de bactéries prétraitées par antibiotique à la même concentration d’antibiotique (préparé à l’étape2.6), respectivement.<ol><li>Par exemple, ajoutez 700 μL de milieu MHB contenant 100 % D2O (contenant 8 μg/mL d’antibiotique) aux 300 μL de bactéries prétraitées aux antibiotiques à 8 μg/mL de bactéries prétraitées par les antibiotiques. De la même manière, transférer dans les tubes correspondants de la concentration suivante, et homogénéiser en pipetant de haut en bas plusieurs fois.</li>
		<li>Ajouter 700 μL de milieu MHB 100 % D 2 O sansantibiotique à 300 μL de bactéries sans antibiotiques (préparé à l’étape 2.6.1) comme témoin à blanc.</li>
		<li>Incuber à 37 °C dans un agitateur d’incubation à 200 tr/min pendant 30 minutes supplémentaires. NOTA: Dans cette étape, la concentration finale deD2Odans le milieu pour l’essai est de 70%.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifuger d’abord l’échantillon bactérien traité à 1 mL d’antibiotique et D2O à 6200 x g pendant 5 min à 4 °C, puis laver deux fois à l’eau purifiée. Enfin, fixez les échantillons dans une solution de formol à 10% et conservez-les à 4 °C.</li>
</ol>3. Préparation des bactéries dans l’environnement urinaire (figure 2b)
<ol><li>Pour préparer E. coli BW 25113 à la phase logarithmique, suivez les étapes indiquées aux points 1.4 et 1.5.</li>
	<li>Vérifiez la concentration bactérienne en mesurant la DO avec un photomètre à une longueur d’onde de 600 nm.</li>
	<li>Pour imiter les échantillons cliniques d’infection urinaire 14,18,41, augmenter la solution d’E. coli dans 10 mL d’urine déidentifiée pour atteindre une concentration cellulaire finale de10 6 UFC/mL.</li>
	<li>Filtrer l’urine enrichie d’E. coli à l’aide d’un filtre de 5 μm, puis diviser la solution bactérienne en aliquotes de 300 μL en sept microtubes de 1,5 mL et 600 μL aliquotes de la solution bactérienne dans un microtube de 1,5 mL.</li>
	<li>Effectuer le traitement d’incorporationD2Oen présence d’antibiotiques et le prélèvement d’échantillons comme décrit dans les étapes précédentes de 2.4 à 2.10.</li>
</ol>4. Préparation des bactéries dans l’environnement sanguin (figure 2c)
<ol><li>Pour préparer Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 à la phase logarithmique, suivez les étapes indiquées aux points 1.4 et 1.5.</li>
	<li>Pour imiter les échantillons cliniques d’infections sanguines42,43, augmenter P. aeruginosa dans 1 mL de sang humain déidentifié pour atteindre une concentration de 107 UFC/mL.</li>
	<li>Ajouter 9 mL d’eau purifiée stérile pour lyser le sang.</li>
	<li>Filtrer le sang enrichi de P. aeruginosa à l’aide d’un filtre de 5 μm. Récoltez ensuite les bactéries à 1 mL de volume par centrifugation à 6200 x g pendant 5 min à 4 °C.  Ajouter 9 mL de MHB normal préchauffé dans la solution bactérienne et vortex doucement. La concentration finale de bactéries est de 106 UFC/mL</li>
	<li>Diviser la solution sanguine enrichie de P. aeruginosa en aliquotes de 300 μL en sept microtubes de 1,5 mL et 600 μL aliquotes de la solution bactérienne dans un microtube de 1,5 mL.</li>
	<li>Effectuer le traitement d’incorporationD2Oen présence d’antibiotiques et le prélèvement d’échantillons comme décrit dans les étapes précédentes de 2.4 à 2.10.</li>
</ol>5. Imagerie SRS de l’incorporation métabolique D2O dans une seule bactérie
<ol><li>Laver 1 mL de solution bactérienne fixe avec de l’eau purifiée, puis centrifuger à 6200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant. Enrichir la solution bactérienne à environ 20 μL.</li>
	<li>Déposer la solution bactérienne sur un verre revêtu de poly-L-lysine. Sandwichiser et sceller l’échantillon pour l’imagerie SRS.</li>
	<li>Image des bactéries à la fréquence vibratoire C-D à 2168 cm-1 à l’aide d’un microscope SRS.<ol><li>Entrez et réglez la longueur d’onde de la pompe à 852 nm à l’aide du logiciel de contrôle d’un ordinateur.</li>
		<li>Mesurez la puissance laser à l’aide d’un capteur de puissance. Réglez la puissance du laser de la pompe à l’échantillon à ~8 mW et la puissance du laser Stokes à l’échantillon à ~40 mW en ajustant la plaque demi-onde devant la sortie laser. REMARQUE: Dans le microscope SRS, un laser femtoseconde accordable avec un taux de répétition de 80 MHz fournit les lasers d’excitation de la pompe (680 à 1300 nm) et de Stokes (1045 nm).</li>
	</ol></li>
	<li>En ajustant les vis des miroirs de réflexion, alignez spatialement la pompe et les faisceaux de Stokes et dirigez les deux faisceaux dans un microscope vertical équipé d’un système de miroir galvo 2D pour le balayage laser.<ol><li>Utilisez un objectif d’immersion dans l’eau 60x pour focaliser la pompe et les lasers Stokes sur l’échantillon.</li>
		<li>Utilisez un condenseur d’huile pour recueillir les signaux de l’échantillon vers l’avant.</li>
		<li>Utilisez un filtre passe-bande pour filtrer le laser Stokes avant de le diriger dans une photodiode.</li>
		<li>Extrayez le signal Raman stimulé par un amplificateur verrouillé et détectez les signaux par la photodiode.</li>
	</ol></li>
	<li>Définissez chaque image SRS pour qu’elle contienne 200 x 200 pixels et le temps de séjour des pixels pendant 30 μs dans le panneau de commande du logiciel. Le temps total d’acquisition d’une image est de ~1,2 s. Définissez la taille de l’étape sur 150 nm, de sorte que la taille de l’image soit d’environ 30 x 30 μm2. Image d’au moins trois champs de vision pour chaque échantillon.</li>
</ol>6. Traitement d’images et analyse de données (Figure 3)
<ol><li>Pour obtenir l’intensité moyenne du signal C-D, ouvrez et traitez les images SRS avec le logiciel ImageJ.</li>
	<li>Tout d’abord, convertissez les images SRS en images de type 8 bits avec couleur inversée en cliquant sur Image | Type | 8 bits, puis Modifier | Inverser les boutons dans le logiciel ImageJ.</li>
	<li>Ensuite, filtrez les images avec le flou gaussien en cliquant sur Traiter | Filtres | Boutons de flou gaussien et définissez le Sigma (rayon) sur 1.</li>
	<li>Utilisez le réglage du seuil d’image pour sélectionner la zone bactérienne. Cliquez sur Image | Ajuster | Seuil pour s’assurer que les tailles bactériennes sélectionnées correspondent à celles des images SRS originales. Éliminez les petites particules en ajustant le seuil de taille pour déterminer les particules. Cliquez sur Appliquer.</li>
	<li>Appliquer Analyser | Boutons d’analyse des particules pour étiqueter et déterminer la zone des bactéries.</li>
	<li>En cliquant sur le bouton Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement de l’image SRS non traitée d’origine, étiquetez la même zone de bactéries, déterminez l’intensité moyenne de chaque point de données en cliquant sur le bouton Mesure dans le gestionnaire de retour sur investissement.</li>
	<li>Encerclez la zone d’arrière-plan dans l’image SRS d’origine et mesurez l’intensité moyenne de l’arrière-plan. Les intensités C-D moyennes de chaque bactérie sont obtenues en déduisant l’intensité du signal de fond.</li>
</ol>7. Quantification de la sensibilité aux antimicrobiens via SC-MIC
NOTA : La valeur seuil à 0,60 pour déterminer la CMI-SC est établie selon l’analyse statistique des intensités SRS C-D des conditions métaboliquement actives et inhibées par le métabolisme des bactéries à diverses concentrations d’exposition au médicament40. Les intensités C-D pour les groupes sensibles aux antibiotiques et résistants aux antibiotiques ont été ajustées avec une distribution normale.
<ol><li>Tracez la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) et évaluez le seuil de coupure à 0,60. Sur la base de cette valeur seuil, le SC-MIC en tant qu’indicateur de l’efficacité des antibiotiques peut être défini pour déterminer le groupe métaboliquement inactif et métaboliquement actif.</li>
	<li>Pour analyser quantitativement les données d’imagerie SRS, tracer les histogrammes des intensités du signal C-D pour chaque groupe de bactéries traitées avec la concentration d’antibiotique diluée en série. Les points de données colorés représentent différentes bactéries individuelles.</li>
	<li>Normaliser les intensités C-D du groupe traité aux antibiotiques à l’intensité moyenne du groupe témoin sans traitement antibiotique. Déterminer les résultats SC-MIC de différentes combinaisons de bactéries et d’antibiotiques en quantifiant les intensités du signal SRS dans la région C-D par rapport à diverses concentrations d’antibiotiques en utilisant la valeur seuil à 0,60.</li>
	<li>Valider et comparer la lecture de la CMI-SC avec la CMI déterminée à l’aide du test de microdilution conventionnel du bouillon.</li>
	<li>Selon le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), la catégorie de sensibilité basée sur les résultats de l’imagerie métabolique SRS pour chaque souche bactérienne testée est interprétée comme « sensible », « résistante » ou « intermédiaire ».</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’AST rapide peut être obtenue en évaluant la réponse de l’activité métabolique bactérienne au traitement antibiotique à l’aide de l’imagerie métabolique SRS unicellulaire dans les 2,5 heures suivant l’échantillon aux résultats SC-MIC. La réponse de l’activité métabolique bactérienne et la sensibilité aux antimicrobiens peuvent être détectées en surveillant l’incorporation métabolique de D2O pour la synthèse de biomolécules à l’aide de l’imagerie SRS des liaisons C-D. Étant donné que l’eau est omniprésente dan...

La résistance aux antimicrobiens (RAM) est une menace mondiale croissante pour le traitement efficace des maladies infectieuses1. On prévoit que la RAM causera 10 millions de décès supplémentaires par an et une perte de PIB mondial de 100 000 milliards de dollars d’ici 2050 si aucune mesure n’est prise pour lutter contre les bactéries résistantes auxantibiotiques1,2. Cela souligne le besoin urgent de méthodes de diagnostic rapides et innovantes pour les tests de sensibilité aux antibiotiques (AST) des bactéries infectieuses afin de ralentir l’émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques et de réduire le taux de mortalité associé3. Pour assurer le meilleur résultat clinique possible, il est crucial d’introduire un traitement efficace dans les 24 heures. Cependant, la méthode de référence actuelle, comme la méthode de diffusion sur disque ou de dilution du bouillon, nécessite généralement au moins 24 heures pour la procédure de préincubation des échantillons cliniques et 16 à 24 heures supplémentaires pour obtenir les résultats de la concentration minimale inhibitrice (CMI). Dans l’ensemble, ces méthodes prennent trop de temps pour guider une décision immédiate pour le traitement des maladies infectieuses en clinique, ce qui conduit à l’émergence et à la propagation de la résistance aux antimicrobiens4.
Des méthodes AST génotypiques, telles que les techniques basées sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR)5, ont été développées pour une détection rapide. Ces techniques mesurent les séquences génétiques de résistance spécifiques afin de fournir des résultats AST rapides. Ils ne dépendent pas de la culture cellulaire qui prend beaucoup de temps; Cependant, seules des séquences génétiques spécifiques connues avec résistance sont testées. Par conséquent, son application est limitée à diverses espèces bactériennes ou à différents mécanismes de résistance. De plus, ils ne peuvent pas fournir de résultats de CMI pour les décisions thérapeutiques 6,7. En outre, de nouvelles méthodes phénotypiques pour l’AST rapide sont en cours de développement pour surmonter ces limitations8, y compris les dispositifs microfluidiques 9,10,11,12,13, les dispositifs optiques14,15,16, l’AST phénotypique quantifiant les acides nucléiques numéro de copie17,18, et les méthodes spectroscopiques Raman 19, 20,21,22,23,24. Ces méthodes réduisent le temps nécessaire pour guider les résultats de l’AST, mais la plupart d’entre elles ne s’appliquent qu’aux isolats bactériens, et non directement aux échantillons cliniques, et nécessitent toujours une préincubation prolongée.
Dans ce travail, nous présentons une méthode de détermination rapide de la sensibilité des bactéries dans l’urine et le sang total via le suivi de l’activité métabolique cellulaire par imagerie SRS. L’eau (H2O) participe à la grande majorité des processus essentiels de synthèse biomoléculaire dans les cellules vivantes. En tant qu’isotopologue de l’eau, par réaction d’échange H/D catalysée par enzyme entre l’atome d’hydrogène redox-actif dans le NADPH et l’atome D dansD2O, le deutérium peut être incorporé dans la biomasse à l’intérieur d’une cellule25,26. Une réaction de synthèse d’acides gras deutérés est médiée par le deutérium marqué NADPH. L’incorporation deD2Odans les réactions des acides aminés (AA) entraîne la production de protéines deutérées26 (Figure 1). De cette façon, les biomolécules nouvellement synthétisées contenant des liaisons C-D dans des cellules microbiennes simples peuvent être utilisées comme marqueur d’activité métabolique générale à détecter. Pour lire les liaisons C-D synthétisées de novo, la spectroscopie Raman, un outil analytique polyvalent fournissant des informations chimiques spécifiques et quantitatives sur les biomolécules, est largement utilisée pour déterminer la sensibilité aux antimicrobiens et réduire considérablement le temps de test à quelques heures27,28,29,30 . Cependant, en raison de la faible efficacité inhérente au processus de diffusion Raman, la spectroscopie Raman spontanée est de faible sensibilité de détection. Par conséquent, il est difficile d’obtenir des résultats d’image en temps réel en utilisant la spectroscopie Raman spontanée. La diffusion Raman cohérente (CRS), y compris la diffusion Raman cohérente anti-Stokes (CARS) et la diffusion Raman stimulée (SRS), a atteint une sensibilité de détection élevée en raison du champ lumineux cohérent pour générer des ordres de grandeur plus grands que celui de la spectroscopie Raman spontanée, rendant ainsi l’imagerie chimique à grande vitesse, spécifique et quantitative au niveau de la cellule unique 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.
Ici, sur la base de nos travaux les plus récents40, nous présentons un protocole pour la détermination rapide de l’activité métabolique et de la sensibilité aux antimicrobiens par imagerie femtoseconde SRS C-D de l’incorporation de bactéries D2O dans le milieu normal, l’urine et l’environnement sanguin total au niveau unicellulaire. L’imagerie femtoseconde SRS facilite la surveillance de la concentration d’inactivation du métabolisme unicellulaire (SC-MIC) contre les antibiotiques au niveau de la bactérie unique en 2,5 heures. Les résultats SC-MIC sont validés par test MIC standard par microdilution du bouillon. Notre méthode est applicable pour déterminer la sensibilité aux antimicrobiens des bactéries pathogènes des infections des voies urinaires (IVU) et des infections sanguines (BSI) avec un temps de test beaucoup plus court par rapport à la méthode conventionnelle, ce qui ouvre la possibilité d’une AST phénotypique rapide en clinique au niveau unicellulaire.

<table><tbody><tr><td>Modulation acousto-optique</td><td>Gooch& Housego</td><td>R15180-1.06-LTD</td><td>Faisceau laser de stokes modulant</td></tr><tr><td>Amoxicilline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8523-5G</td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bande</td><td>Chroma</td><td>HQ825/150m</td><td>Bloquer le faisceau laser de stokes avant la photodiode</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Réglage des cations</td></tr><tr><td>Réglage des cations Mueller-Hinton Broth Fisher</td><td>Scientific</td><td>B12322</td><td>Sensibilité aux antimicrobiens des micro-organismes par des méthodes de dilution en bouillon</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002542</td><td></td></tr><tr><td>Verres de protection</td><td>VWR</td><td>16004-318</td><td></td></tr><tr><td>Tube de culture avec bouchon à pression</td><td>Fisher brand</td><td>149569B</td><td></td></tr><tr><td>Daptomycine</td><td>Acros</td><td>A0386346</td><td></td></tr><tr><td>Oxyde de</td><td></td><td>deutérium 151882</td><td>Solvant organique pour dissoudre les antibiotiques</td></tr><tr><td>Oxyde de deutérium-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156914</td><td>Solvant organique comme norme pour calibrer le système d’imagerie SRS</td></tr><tr><td>Escherichia coli BW 25113</td><td>The Coli Genetic Stock Center</td><td>7636</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en polypropylène Eppendorf 1,5 mL</td><td>marque Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de gentamicine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4918</td><td></td></tr><tr><td>Filtres hydrophiles en fluorure de polyvinylidène</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLSV025NB</td><td>pores taille 5 &micro ; m</td></tr><tr><td>Logiciel ImageJ</td><td></td><td>NIH Version : 2.0.0-rc-69/1.52t</td><td>Traitement et analyse d’images</td></tr><tr><td>Agitateur orbital d’incubation réglé à 37 &deg ; C</td><td>VWR</td><td>97009-890</td><td></td></tr><tr><td>Boucle d’inoculation</td><td>Sigma</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee laser pulsé femtoseconde</td><td>Spectra-Physics</td><td>Modèle : insight X3</td><td>Source laser accordable et source laser fixe à 1045 nm pour l’imagerie SRS</td></tr><tr><td>Amplificateur de verrouillage</td><td>Zurich Instrument</td><td>HF2LI</td><td>Démoduler les signaux SRS</td></tr><tr><td>Condenseur d’huile</td><td>Olympus</td><td>U-AAC</td><td>NA 1.4</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 47085</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode</td><td>Hamamatsu</td><td>S3994-01</td><td>Détecteur</td></tr><tr><td>Polypropylène tube conique 15 mL</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Filtres en polypropylène</td><td>Thermo Scientific</td><td>726-2520</td><td>taille des pores 0.2 &micro ; m</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri stériles</td><td>Corning</td><td>07-202-031</td><td></td></tr><tr><td>Seringue 10 mL</td><td>Spectrophotomètre UV</td>/Vis 14955459 <td></td><td>de marque Fisher</td></tr><tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>Modèle : DU 530</td><td>Mesure de la densité optique à la longueur d’onde de 600 nm</td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Objectif d’eau</td><td>Olympus</td><td>UPLANAPO/IR</td><td>60&times ;, S.O. 1,2</td></tr></tbody></table>

test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

Pour ralentir et prévenir la propagation des infections résistantes aux antimicrobiens, il est urgent de procéder à des tests rapides de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour déterminer quantitativement les effets antimicrobiens sur les agents pathogènes. Il faut généralement des jours pour compléter l’AST par des méthodes conventionnelles basées sur la culture à long terme, et elles ne fonctionnent pas directement pour les échantillons cliniques. Ici, nous rapportons une méthode AST rapide rendue possible par l’imagerie par diffusion Raman stimulée (SRS) de l’incorporation métabolique d’oxyde de deutérium (D2O). L’incorporation métabolique deD2Odans la biomasse et l’inhibition de l’activité métabolique lors de l’exposition aux antibiotiques au niveau de la bactérie unique sont surveillées par imagerie SRS. La concentration d’inactivation du métabolisme unicellulaire (SC-MIC) des bactéries lors de l’exposition aux antibiotiques peut être obtenue après un total de 2,5 heures de préparation et de détection des échantillons. De plus, cette méthode AST rapide est directement applicable aux échantillons bactériens dans des environnements biologiques complexes, tels que l’urine ou le sang total. L’imagerie métabolique SRS de l’incorporation de deutérium est transformatrice pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

L’effet du temps d’incubation sur l’incorporation du deutérium est mesuré par microspectroscopie Raman spontanée dans les régions C-D (2070 à 2250 cm-1) et C-H (2 800 à 3 100 cm-1) (Figure 4a). Les spectres Raman monocellulaires en accéléré de P. aeruginosa cultivés dans un milieu contenant du D2O à 70 % montrent une augmentation de l’intensité CD/CH sur le temps d’incubation de 0 à 180 min. (Figure 4b) L’abondance croissante de C-...

Ce protocole présente un test rapide de sensibilité aux antimicrobiens (AST) en 2,5 heures par imagerie de diffusion Raman stimulée par une cellule unique du métabolisme D2O. Cette méthode s’applique aux bactéries dans l’urine ou l’environnement sanguin total, ce qui est transformateur pour l’AST phénotypique rapide à cellule unique en clinique.

Test rapide de sensibilité aux antimicrobiens par imagerie par diffusion Raman stimulée de l’incorporation de deutérium dans une seule bactérie

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

Des tests rapides de sensibilité aux antimicrobiens peuvent être obtenus dans les 2,5 heures dans l’urine et le sang, ce qui est considéré comme une réduction considérable du temps d’analyse par rapport à la méthode conventionnelle de microdilution du bouillon. Il peut surveiller l’activité métabolique bactérienne dans un environnement complexe, comme le sang total. Pour commencer, vérifiez la concentration bactérienne des échantillons en mesurant la densité optique avec un photomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres.Pour atteindre une concentration cellulaire finale de huit fois 10 à la cinquième unité formant colonie, ou UFC, par millilitre, diluer la solution bactérienne en utilisant le milieu MHB normal sans deutérium. Après avoir mélangé les cellules bactériennes par vortex, prélever 300 microlitres aliquotes de la solution bactérienne dans sept microtubes de 1,5 millilitre et une aliquote de 600 microlitres de la solution bactérienne dans un microtube de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite 4,8 microlitres de la solution mère d’antibiotiques dans le microtube contenant 600 microlitres de la solution bactérienne pour atteindre la concentration finale d’antibiotique de huit microgrammes par millilitre.Ajouter 300 microlitres de la solution bactérienne avec antibiotique à une partie aliquote de 300 microlitres de la solution bactérienne sans antibiotique pour obtenir une solution diluée double avec la concentration finale d’antibiotique de quatre microgrammes par millilitre. Répétez la double dilution en série des antibiotiques testés jusqu’à ce que la concentration la plus basse de 0,25 microgramme par millilitre soit atteinte. Jetez 300 microlitres de la solution du dernier microtube.Attribuer un tube sans antibiotiques au témoin positif avec traitement au deutérium et au témoin négatif sans deutérium. Incuber l’aliquote bactérienne avec l’antibiotique contenant le milieu MHB pendant une heure. Pendant ce temps, préparer une dilution en série d’antibiotiques avec un milieu MHB contenant du deutérium à 100% avec les mêmes gradients de concentration que ceux décrits précédemment.Après une heure d’incubation, ajouter 700 microlitres d’antibiotique dilué en série avec un milieu MHB contenant du deutérium à 100% aux 300 microlitres de bactéries prétraitées aux antibiotiques dans la même concentration d’antibiotique. Homogénéiser le mélange en pipetant de haut en bas plusieurs fois. Ajouter 700 microlitres de milieu 100% deutérium sans antibiotique contenant du milieu MHB à 300 microlitres de bactéries sans antibiotiques comme contrôle positif.Ajouter 700 microlitres de milieu 0% de deutérium sans antibiotique contenant du milieu MHB à 300 microlitres de bactéries sans antibiotiques comme contrôle négatif. Incuber tous les microtubes à 37 degrés Celsius et 200 rotations par minute pendant 30 minutes. Après l’incubation, centrifuger l’échantillon bactérien traité au millilitre d’antibiotique et au deutérium à 6 200 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Ensuite, lavez le granulé deux fois avec de l’eau purifiée. Fixez les échantillons dans une solution de formol à 10% volume par volume et conservez-les à quatre degrés Celsius. Vérifiez la concentration d’Escherichia coli à partir de l’échantillon bactérien fraîchement préparé en mesurant la densité optique avec un photomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres.Pour imiter les échantillons cliniques d’infection des voies urinaires, augmenter l’échantillon d’Escherichia coli dans 10 millilitres d’échantillons d’urine anonymisés pour atteindre une concentration finale de 10 à six UFC par millilitre. Filtrer l’urine enrichie d’Escherichia coli à l’aide d’un filtre de cinq microns et diviser la solution bactérienne filtrée en aliquotes de 300 microlitres en sept microtubes de 1,5 millilitre et une aliquote de 600 microlitres dans un microtube de 1,5 millilitre. Effectuer un traitement d’incorporation de deutérium en présence d’antibiotiques comme décrit précédemment.Pour imiter les échantillons cliniques d’infection sanguine, ajoutez Pseudomonas aeruginosa dans un millilitre de sang humain anonymisé pour atteindre une concentration finale de 10 à la sixième UFC par millilitre. Pour lyser le sang, ajoutez neuf millilitres d’eau purifiée stérile. Filtrer le sang enrichi de Pseudomonas aeruginosa à l’aide d’un filtre de cinq microns.Ensuite, récoltez les bactéries de l’échantillon filtré à un volume d’un millilitre par centrifugation à 6 200 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, diviser la solution sanguine enrichie de Pseudomonas aeruginosa dans des aliquotes de 300 microlitres en sept microtubes de 1,5 millilitre et une aliquote de 600 microlitres de la solution bactérienne dans un microtube de 1,5 millilitre, et effectuer un traitement d’incorporation de deutérium en présence d’antibiotiques comme décrit précédemment. Pour la préparation de l’échantillon, laver un millilitre de solution bactérienne fixe avec de l’eau purifiée et centrifuger la solution de bactéries lavées à 6 200 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Retirer le surnageant et enrichir la solution bactérienne à environ 20 microlitres avec de l’eau stérilisée. Déposer la solution bactérienne sur un verre de couverture revêtu de poly-L-lysine, sandwich avec un autre verre de couverture, et sceller l’échantillon. Dans le microscope SRS, un laser femtoseconde accordable avec un taux de répétition de 80 mégahertz fournit la pompe et les lasers d’excitation de Stokes.Le faisceau de Stokes est modulé par un modulateur acousto-optique à 2,4 mégahertz. Les deux faisceaux sont combinés colilinéairement à travers un miroir dichroïque. Ensuite, la pompe et les faisceaux de Stokes sont dirigés vers un microscope à balayage laser construit en laboratoire avec un miroir Galvo 2D pour le balayage laser.Un objectif d’eau 60x focalise les lasers sur l’échantillon et un condenseur d’huile recueille le signal de l’échantillon. Deux filtres sont utilisés pour filtrer le faisceau de Stokes, tandis que le faisceau de la pompe est détecté par une photodiode, après quoi le signal Raman stimulé est extrait par un amplificateur de verrouillage. À l’aide du logiciel de contrôle, entrez et réglez la longueur d’onde de la pompe à 852 nanomètres.Ajustez la fréquence vibratoire C à D à 2 168 ondes pour imager les bactéries à l’aide d’un microscope SRS. Mesurez la puissance laser à l’aide d’un capteur de puissance. Réglez la puissance du laser de la pompe sur l’échantillon à huit milliwatts et la puissance du laser Stokes sur l’échantillon à 50 milliwatts en ajustant la plaque demi-onde devant la sortie laser.Placez l’échantillon standard DMSO d6 sur l’étage d’échantillonnage et utilisez un objectif d’immersion dans l’eau 60x pour focaliser la pompe et les lasers Stokes sur l’échantillon. En ajustant les vis des miroirs de réflexion, alignez spatialement la pompe et les faisceaux de Stokes et dirigez les deux faisceaux dans un microscope vertical équipé du système de miroir 2D Galvo pour le balayage laser. Dans le panneau de configuration du logiciel, définissez chaque image SRS pour qu’elle contienne 200 x 200 pixels et que le temps d’attente des pixels soit de 30 microsecondes.Le temps total d’acquisition d’une image est d’environ 1,2 seconde. Définissez la taille du pas sur 150 nanomètres, de sorte que la taille de l’image est d’environ 30 par 30 micromètres carrés. Après avoir optimisé le système, retirez l’échantillon standard et placez l’échantillon bactérien sur l’étape de l’échantillon sous l’objectif d’immersion dans l’eau 60x.Démarrez l’imagerie SRS des échantillons bactériens. Image d’au moins trois champs de vision pour chaque échantillon. L’effet du temps d’incubation sur l’incorporation de deutérium est mesuré par microspectroscopie Raman spontanée dans les régions CD et CH.Le diagramme du rapport d’intensité CD sur CH sur le temps d’incubation du deutérium pour les bactéries individuelles a montré une augmentation de l’intensité CD sur CH sur le temps d’incubation de zéro à 180 minutes. L’imagerie SRS de Pseudomonas aeruginosa a été réalisée lors de l’incubation avec de la gentamicine et du deutérium à 70%. L’analyse statistique quantitative supplémentaire a montré que les signaux CD des bactéries étaient significativement plus faibles à deux microgrammes par millilitre, ou une concentration de gentamicine plus élevée que sans traitement à la gentamicine.Le seuil d’intensité seuil à 0,60 a conclu que Pseudomonas aeruginosa était métaboliquement inhibé à deux microgrammes par millilitre et à des concentrations plus élevées de gentamicine. La CMI-SC pour Pseudomonas aeruginosa contre la gentamicine dans un milieu MHB normal a été déterminée à deux microgrammes par millilitre, ce qui se situait dans la plage de différence d’un seul fois avec une CMI de quatre microgrammes par millilitre déterminée par la méthode de microdilution du bouillon. Des tests rapides de sensibilité aux antimicrobiens, ou AST, d’échantillons d’urine enrichis d’Escherichia coli ont été effectués par imagerie SRS.La CMI-SC de l’échantillon d’urine enrichie d’Escherichia coli contre l’amoxicilline a été déterminée à quatre microgrammes par millilitre, ce qui a la même lecture de sensibilité que la CMI de huit microgrammes par millilitre par la méthode de dilution conventionnelle du bouillon pour Escherichia coli pur dans un milieu MHB normal. L’applicabilité de l’AST rapide de Pseudomonas aeruginosa enrichi dans le sang humain a été étudiée par imagerie SRS. L’intensité CD de l’image SRS à 2 168 centimètres était dominée par des signaux bactériens provenant de l’incorporation métabolique de deutérium de bactéries vivantes.La CMI-SC pour Pseudomonas aeruginosa dans le sang a été déterminée à deux microgrammes par millilitre, ce qui concorde bien avec le résultat standard conventionnel de la CMI pour Pseudomonas aeruginosa dans le milieu de croissance normal. Le nombre de cellules bactériennes utilisées pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens est maintenu à environ cinq fois 10 à la cinquième colonie formant des unités par millilitre, comme recommandé par le Clinical and Laboratory Standards Institute. Une concentration plus élevée de bactéries peut entraîner une augmentation de la concentration minimale inhibitrice.La combinaison de l’identification in situ des agents pathogènes et du diagnostic rapide des tests de sensibilité aux antimicrobiens pourrait être d’un grand potentiel de traduction dans une clinique qui permet d’identifier à temps les agents antimicrobiens appropriés pour un traitement précis.

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