Name: Détection et analyse automatisées de l’exocytose (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Découvrez une méthode automatisée d'analyse de l'exocytose par microscopie TIRF et algorithmes de vision par ordinateur MATLAB. Ce pipeline permet la détection, la classification en quatre modes de fusion et l'analyse spatiale des événements exocytotiques dans les neurones.

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Nous remercions Dustin Revell et Reginald Edwards d’avoir testé le code et l’interface graphique. Le financement a été fourni par les National Institutes of Health pour soutenir cette recherche : Y compris R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) et F31NS103586 (FLU).

1. Choisissez les jeux de données et le répertoire
<ol><li>Pour sélectionner des jeux de données à analyser, cliquez sur le bouton Rechercher des jeux de données ( Figure2A, encadré rouge 1) pour accéder au dossier dans lequel les données sont déposées (par exemple, le dossier RawData). Les fichiers de données rempliront automatiquement les fichiers de données sous forme de liste. Il peut y avoir plusieurs jeux de données dans le dossier.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Choisir un répertoire et sélectionnez le répertoire (par exemple, Test) où les fichiers analysés seront déposés (Figure 2A, encadré rouge 2). Un ensemble de dossiers et de fichiers d’analyse terminés ainsi que des images temporaires intermédiaires seront créés dans ce répertoire lorsque vous appuyez sur le bouton Analyse. Des erreurs seront produites si un répertoire n’est pas choisi.</li>
</ol>2. Définissez la taille des pixels et la fréquence d’images
<ol><li>Renseignez la fréquence d’images et la taille de pixels appropriées des images dans la zone « Framerate » ou « pixel size » appropriée (Figure 2A, boîte verte). Si aucune valeur n’est fournie (elles sont définies sur le « 0 » par défaut), le programme recherchera dans les métadonnées associées au fichier la fréquence d’images et la taille des pixels. Si ces valeurs sont introuvables, le programme utilisera par défaut par pixel pour la mesure et par image pour les points temporels. Remarque : Dans l’exemple fourni, la fréquence d’images est de 100 et la taille des pixels est de 0,08.</li>
</ol>3. Choisissez ou fabriquez des masques
<ol><li>Utilisez le bouton Créateur de masques pour créer automatiquement des masques de cellule pour les données de la liste des jeux de données de fichiers ( Figure2A, zone bleue). Lors de l’utilisation du bouton Mask Maker, un nouveau dossier dans le répertoire choisi sera créé appelé MaskFiles. L’indicateur « Run » jaunira pendant la course et reviendra au vert une fois terminé. Remarque : Un masque pour chaque fichier de la liste Fichiers de données sera créé à partir des 10 premières images du fichier image (ou de toutes les images si moins de 10 sont dans le fichier image) et déposé dans le dossier MaskFiles en utilisant le schéma de dénomination approprié (décrit ci-dessous).</li>
	<li>Assurez-vous que les fichiers de masque remplissent automatiquement la liste Fichiers de masque. L’utilisateur peut procéder directement à l’analyse. REMARQUE: Vérifiez toujours visuellement les fichiers de masque et confirmez qu’ils capturent toute la région d’intérêt. La première image du fichier de données et le fichier de masque sont affichés sur l’interface utilisateur lorsque cette option est sélectionnée. (Figure 2B). Le Mask Maker peut produire des erreurs dans le cas d’un faible rapport signal-bruit, il est donc essentiel de valider que les fichiers de masque sont appropriés pour le contrôle qualité.</li>
	<li>Au lieu d’utiliser Mask Maker, si le signal vers le bruit des images est insuffisant, créez des masques manuellement dans ImageJ.<ol>
<li>Tout d’abord, ouvrez le fichier image brut dans ImageJ (Figure 3A).</li>
		<li>Cliquez sur le bouton Sélection du polygone et cliquez pour dessiner un masque autour de la cellule. Une fois terminé, double-cliquez sur le dernier point pour terminer le polygone.</li>
		<li>Une fois terminé, accédez à Modifier | | de sélection Créer un masque (Figure 3B). Un nouveau masque inversé sera créé en fonction du dessin du polygone. Enregistrez les masques dans un dossier MaskFiles désigné dans le répertoire choisi. Le schéma de dénomination des fichiers de masque doit correspondre aux fichiers de données individuels correspondants, suivis de « _mask_file ». Par exemple, si un fichier de données est nommé « VAMP2_488_WT_1.tif », le fichier de masque correspondant doit être nommé « VAMP2_488_WT_1_mask_file.tif ».</li>
		<li>Utilisez le bouton Rechercher des fichiers de masque pour accéder au dossier choisi des fichiers de masque personnalisés déposés. Les masques rempliront les fichiers de masque sous forme de liste. REMARQUE : Il est important d’avoir un masque pour chaque fichier de données avant d’exécuter l’analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analyse et extraction de caractéristiques
<ol><li>Une fois le répertoire choisi et la liste Fichiers de données et la liste Fichiers de masque renseignées, cliquez sur le bouton Analyse (Figure 4A). Si la classification des événements exocytaires est requise, passez à l’étape 5. REMARQUE: Le bouton Analyse clique sur effectuera une série de tâches automatisées pour analyser les données. Il créera des dossiers individuels dans le répertoire choisi pour déposer les données analysées. Pendant l’exécution, l’indicateur de course passe du vert au jaune(Figure 4A,encadré rouge). Une fois l’analyse terminée, cela redevient vert.</li>
	<li>Recherchez un dossier DataFiles (Figure 4B) avec l’ensemble complet des fichiers d’analyse (ainsi que des fichiers d’extraction d’entités, à utiliser dans la classification ultérieure) nommés en fonction de chaque fichier de données (Figure 4C). REMARQUE : Une description de ces fichiers d’analyse est incluse ci-dessous dans la section Résultats représentatifs.</li>
</ol>5. Classification des événements exocytaires
<ol><li>Pour effectuer une classification simultanée des événements exocytaires avec détection automatisée, cochez la case Classification avant de cliquer sur le bouton Analyse. Pour chaque événement exocytaire, attribuez un score de probabilité compris entre 0 et 1 pour chaque classe. Un événement exocytaire est considéré comme l’une des quatre classes si le score de probabilité pour cette classe est > 0,5. REMARQUE : Une fois l’analyse terminée, un nouveau dossier de fichiers de données apparaîtra dans le répertoire choisi. Le dossier contiendra des fichiers d’analyse correspondant à chaque fichier image.</li>
</ol>6. Analyse spatio-temporelle de l’exocytose à l’aide des valeurs K de Ripley
<ol><li>Créez un fichier de masque « neurite » et « soma » séparé. Tout d’abord, segmentez le soma de la neurite. Il n’y a pas de méthode impartiale pour segmenter le soma des neurites, de sorte que l’utilisateur doit être aveuglé par l’expérience de conditionnement et utiliser le meilleur jugement; un ellipsoïde sans extensions de neurites évidentes est suggéré.</li>
	<li>Ouvrez ImageJ/Fidji.</li>
	<li>Faites glisser et déposez le fichier de masque ou utilisez fichier | Ouvrez, puis sélectionnez le fichier de masque.</li>
	<li>Utilisez l’outil de sélection de couleur et cliquez sur l’un des pixels noirs en arrière-plan du masque pour définir la couleur sur noir.</li>
	<li>Utilisez l’outil de sélection de polygones ou à main levée pour dessiner un contour autour du soma, en le séparant des neurites. Cela nécessite une prise de décision manuelle.</li>
	<li>Cliquez sur Modifier | | de sélection Faire un masque. Une nouvelle image s’ouvrira avec le soma encerclé segmenté du reste de l’image. Cela créera un fichier de masque soma.</li>
	<li>Sans déplacer la région dessinée, cliquez sur l’en-tête du fichier de masque d’origine.</li>
	<li>Cliquez sur Modifier | Remplissez pour remplir le soma encerclé afin que seules les neurites restent le masque.</li>
	<li>Une fois les fichiers de neurite et de masque séparés obtenus, enregistrez les deux fichiers de masque.</li>
	<li>Ouvrez « neurite_2D_network » dans Matlab.</li>
	<li>Dans MATLAB, accédez au répertoire avec toutes les données d’analyse.</li>
	<li>Remplacez le chemin « nom du masque » par le nom du masque de neurite, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.tif »</li>
	<li>Remplacez le « csv_file_name » par l’emplacement de fluorescent_traces.csv fichier, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_neurite.csv ».</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter pour squelettiser le fichier de masque de neurite. Cela crée une version squelettée du fichier de masque de neurite et le dépose en tant que fichier CSV dans le dossier maskfiles.</li>
	<li>Ensuite, générez un fichier CSV pour le soma. Ouvrez « CSV_mask_creator.m » dans Matlab.</li>
	<li>Mettez dans le chemin d’accès pour le « nom du masque » au nom du masque soma, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2phLuorin_488_wt_4_mask_file_soma.tif</li>
	<li>Remplacez le « writematrix » par le nom de fichier csv à créer, c’est-à-dire « MaskFiles/VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv »</li>
	<li>Cliquez sur Exécuter. Cela crée le nouveau fichier VAMP2pHluorin_488_wt_4_mask_file_soma.csv.</li>
	<li>Répétez la section 6.14 pour chaque fichier de masque.</li>
</ol>7. Configuration de RStudio
<ol><li>Ouvrez Rstudio et ouvrez ripleys_k_analysis. Fichier R.</li>
	<li>Installez le paquet « spatstat » dans RStudio en allant dans Outils | Installez les packages et tapez « spatstat » puis cliquez sur Installer. REMARQUE: Cela ne doit être effectué qu’une seule fois par installation Rstudio.</li>
	<li>Exécutez le spatstat de la bibliothèque au début de chaque session.</li>
	<li>Faites attention à deux variables principales dans ce cas: « neuron_mask » et « neuron_datapoints ». Neuron Mask pointe vers l’ensemble des fichiers de masque à exécuter, c’est-à-dire les fichiers de masque soma. REMARQUE: Exécutez tous les fichiers de masque soma ensemble, séparément des fichiers de masque Neurite, et vice versa.</li>
	<li>Lisez dans le .csv des fichiers de masque pour chacun des neurones à analyser.</li>
	<li>Exécutez plusieurs fichiers à la fois en copiant des neuron_mask_n+1 supplémentaires. Cela permettra d’agréger l’analyse de Ripley ensemble, en utilisant le script décrit dans la section 8.</li>
	<li>Maintenant, vérifiez la deuxième variable, « neuron_datapoints ».</li>
	<li>Lisez dans le. » X_fluorescent_traces.csv » généré par le programme d’analyse (par caractéristiques de tous les fichiers extracted_R) avec les positions x,y,t des événements exocytaires, ainsi que le fichier spécifique aux neurites des positions x,y pour le réseau 2D. Cela va dans la position « neuron_datapoints ».</li>
	<li>Dans RStudio, sélectionnez le code | Exécuter la région | Exécuter tout. Cela génère plusieurs graphiques, y compris les valeurs K de Ripley regroupées ainsi que des diagrammes de densité.</li>
	<li>Enregistrez les tracés en allant dans Exporter | Enregistrer l’image sous | Sélectionnez le format d’image et le répertoire appropriés, puis entrez le nom de fichier approprié, puis cliquez sur Enregistrer. REMARQUE: La fonction de traçage pour les cartes thermiques est appelée dans le script en utilisant « plot(density(soma_data,0.4)) ». Le nombre « 0,4 » représente ici à quel point la fonction de densité doit être lissée. Il peut être modifié pour s’adapter aux données utilisateur de manière significative, mais si des comparaisons doivent être effectuées entre différentes cartes thermiques, le nombre doit être le même entre elles.</li>
	<li>
Exporter ou enregistrer l’image à partir de Rstudio. Si une carte thermique nécessite d’autres modifications, choisissez un type de fichier approprié (SVG ou EPS).</li>
</ol>8. Analyse de Ripley
REMARQUE: Le Ripleys_k_analysis. Le fichier R a également généré automatiquement les tracés de valeur k de Ripley. L’exécution du script entier exécutera automatiquement les fonctions mentionnées ci-dessous, mais il est inclus en détail si l’on souhaite exécuter chaque partie du script individuellement ou apporter des modifications à l’analyse.
<ol><li>Tout d’abord, exécutez la fonction d’enveloppe pour chaque cellule. Cette fonction a simulé le hasard spatial complet (CSR) pour tester la valeur K de Ripley du modèle de point d’événement exocytaire par rapport à. Data_envelope_1 = enveloppe(soma_data_1, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE) Data_envelope_2 = enveloppe(soma_data_2, Kest, nsim = 19, savefuns = TRUE)</li>
	<li>Ensuite, regroupez ces enveloppes et créez une estimation de la RSE pour le groupe : Pool_csr = pool(Data_envelope_1, Data_envelop_2,...) Ensuite, exécutez la fonction K de Ripley pour tous les points de données. Data_ripleys_k_1 = Kest(soma_data_1, ratio = VRAI) Data_ripleys_k_2 = Kest(soma_data_2, ratio = VRAI)</li>
	<li>Une fois terminé, mettez en commun les valeurs K de Ripley et amorcez leurs intervalles de confiance avec la commande suivante : Pool de données = pool(Data_ripleys_k_1, Data_ripleys_k_2,...)</li>
	<li>Bootstrap avec la commande suivante : Final_Ripleys_K = varblock(fun = Kest, Data_pool)</li>
	<li>Tracez les données.</li>
	<li>Si une différence statistique dure est requise, le test de permutation studentisée est inclus dans le package spatstat pour tester une différence entre des groupes de modèles de points: Test_difference = studpermu.test(all_points_to_test, exocytic_events ~ group, nperm = np).</li>
</ol>

<ol><li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).</li>
<li>Urbina, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM67+regulates+exocytic+mode+and+neuronal+morphogenesis+via+SNAP47%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47.</a> Cell Reports. 34 (6), 108743(2021).</li>
<li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+kiss-and-run%3A+Role+in+exocytosis%2C+endocytosis%2C+and+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission.</a> Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).</li>
<li>Albillos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exocytotic+event+in+chromaffin+cells+revealed+by+patch+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry.</a> Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).</li>
<li>He, L., Wu, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+debate+on+the+kiss-and-run+fusion+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The debate on the kiss-and-run fusion at synapses.</a> Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).</li>
<li>Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+patch+clamp+reveals+that+transient+fusion+%28kiss-and-run%29+is+a+major+mechanism+of+secretion+in+calf+adrenal+chromaffin+cells%3A+high+calcium+shifts+the+mechanism+from+kiss-and-run+to+complete+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion.</a> Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030(2006).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+single-vesicle+astrocyte+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).</li>
<li>Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+direct%2C+dynamin-dependent+recapture+of+fusing+secretory+granules+on+plasma+membrane+lawns+from+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).</li>
<li>Wang, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+domains+of+synaptotagmin+control+the+choice+between+kiss-and-run+and+full+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion.</a> Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).</li>
<li>Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+combined+methodologies+to+define+the+role+of+plasma+membrane+delivery+during+axon+branching+and+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), e53743(2016).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+primary+culture+of+embryonic+mouse+hippocampal+and+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).</li>
<li>Plooster, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM9-dependent+ubiquitination+of+DCC+constrains+kinase+signaling%2C+exocytosis%2C+and+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).</li>
<li>Urbina, F. L., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE-mediated+exocytosis+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SNARE-mediated exocytosis in neuronal development.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133(2020).</li>
<li>Ripley, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second-order+analysis+of+stationary+point+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Probability%22%5BJournal%5D)">The second-order analysis of stationary point processes.</a> Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pHmScarlet+is+a+pH-sensitive+red+fluorescent+protein+to+monitor+exocytosis+docking+and+fusion+steps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps.</a> Nature Communication. 12 (1), 1413(2021).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent rien à divulguer.

Lorsque vous utilisez le logiciel de détection et d’analyse exocytaire, veuillez noter que le programme n’accepte que la compression sans perte .tif fichiers en entrée. Les fichiers image .tif peuvent être des images en niveaux de gris (canal unique) 8 bits, 16 bits ou 32 bits. Les autres formats d’image doivent être convertis en l’un de ces types avant la saisie. À titre de référence, les exemples utilisés ici sont des images en niveaux de gris 16 bits.
Inhérents au processus de détection aut...

Les constructions VAMP-pHluorin ou récepteurs de la transferrine (TfR)-pHuji sont d’excellents marqueurs d’événements exocytaires, car ces fluorophores sensibles au pH sont trempés dans la lumière de la vésicule acide et fluorescent immédiatement après l’ouverture des pores de fusion entre la vésicule et la membraneplasmique 1. Après l’ouverture des pores de fusion, la fluorescence se désintègre de manière exponentielle, avec une certaine hétérogénéité qui révèle des informations sur l’événement de fusion. Ici, une application d’interface utilisateur graphique (GUI) est décrite qui détecte et analyse automatiquement les événements exocytaires. Cette application permet à l’utilisateur de détecter automatiquement les événements exocytaires révélés par les marqueurs sensibles au pH2 et de générer des caractéristiques de chaque événement qui peuvent être utilisées à des fins de classification3 (Figure 1A). En outre, l’analyse du regroupement d’événements exocytaires à l’aide de la fonction K de Ripley est décrite.
La classification automatisée des événements exocytaires en différents modes exocytaires a récemment été rapportée3. Deux modes d’exocytose, la fusion des vésicules complètes (FVF) et l’exocytose de la fusion kiss-and-run (KNR) ont déjà été décrits4,5,6,7. Pendant la FVF, le pore de fusion se dilate et la vésicule est incorporée dans la membrane plasmique. Pendant KNR, le pore de fusion s’ouvre transitoirement puis reseale4,5,8,9,10. Quatre modes d’exocytose ont été identifiés dans le développement des neurones, deux liés à la FVF et deux liés à KNR. Ces travaux démontrent que le FVF et le KNR peuvent être subdivisés en événements de fusion qui procèdent immédiatement à la désintégration de la fluorescence (FVFi et KNRi) après l’ouverture des pores de fusion ou en événements exocytaires qui présentent un délai après l’ouverture des pores de fusion avant le début de la désintégration de la fluorescence (FVFd et KNRd)(Figure 1B). Le classificateur identifie le mode d’exocytose pour chaque événement de fusion. Ici, cette analyse a été incorporée dans une interface graphique qui peut être installée dans MATLAB dans les systèmes d’exploitation Windows et Mac. Tous les fichiers d’analyse peuvent être consultés sur https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing ou https://github.com/GuptonLab.

<table><tbody><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td></tr><tr><td>R</td><td>R Core Team</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Rstudio</td><td>, Rstudio, PBC</td><td></td><td>https://rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

détection et analyse automatisées de l’exocytose

Automated Detection and Analysis of Exocytosis

La microscopie TIRF timelapse de la GFP sensible au pH (pHluorin) attachée aux protéines SNARE des vésicules est une méthode efficace pour visualiser les événements exocytaires d’une seule vésicule en culture cellulaire. Pour effectuer une identification et une analyse impartiales et efficaces de ces événements, une approche basée sur la vision par ordinateur a été développée et mise en œuvre dans MATLAB. Le pipeline d’analyse se compose d’un algorithme de segmentation cellulaire et d’identification des événements exocytaires. L’approche de vision par ordinateur comprend des outils pour étudier de multiples paramètres d’événements uniques, y compris la demi-vie de la désintégration de fluorescence et le pic ΔF / F, ainsi que l’analyse des cellules entières de la fréquence de l’exocytose. Ces paramètres et d’autres de la fusion sont utilisés dans une approche de classification pour distinguer les modes de fusion distincts. Ici, une interface graphique nouvellement construite effectue le pipeline d’analyse du début à la fin. Une adaptation supplémentaire de la fonction K de Ripley dans R Studio est utilisée pour distinguer l’occurrence groupée, dispersée ou aléatoire d’événements de fusion dans l’espace et le temps.

Ici, l’interface graphique(Figure 2A)a été utilisée pour analyser les événements exocytaires de trois neurones exprimant la VAMP2-pHluorine à 3 DIV en utilisant la microscopie TIRF (fluorescence par réflexion interne totale). Les neurones corticaux E15.5 ont été isolés, suivis d’une transfection avec VAMP2-pHluorin et d’un placage à l’aide des protocoles décrits dans Winkle et al., 2016 et Viesselmann et al., 201111,12. La méthodolog...

Nous avons développé un logiciel de vision par ordinateur automatisé pour détecter les événements exocytaires marqués par des sondes fluorescentes sensibles au pH. Ici, nous démontrons l’utilisation d’une interface utilisateur graphique et de RStudio pour détecter les événements de fusion, analyser et afficher les paramètres spatio-temporels de la fusion et classer les événements en modes de fusion distincts.

Détection et analyse automatisées de l’exocytose

Timelapse TIRF microscopy of pH-sensitive GFP (pHluorin) attached to vesicle SNARE proteins is an effective method to visualize single vesicle exocytic ...

Le logiciel de détection et d’analyse automatisées de l’exocytose permettra à l’utilisateur de détecter automatiquement les événements exocytaires et les séquences d’images TIRF de fluorophores sensibles au pH. Il produira également automatiquement des caractéristiques de l’exocytose telles que la distribution spatiale ou la fréquence, ainsi que des propriétés individuelles d’événements exocytaires, telles que la demi-vie ou le changement de fluorescence sur le fond. En outre, une option est incluse pour classer les événements exocytaires en quatre modes d’exocytose, précédemment décrits dans la littérature.Afin d’utiliser le logiciel de détection et d’analyse automatisées de l’exocytose, vous allez d’abord cliquer sur le bouton Rechercher un jeu de données, et vous allez naviguer jusqu’à l’endroit où vos données sont déposées, et vous voudrez mettre dans un dossier appelé données brutes. Vos fichiers de données rempliront automatiquement la liste ici, et vous pouvez avoir n’importe quel nombre de fichiers de données dans ce dossier. Ensuite, vous voudrez choisir un répertoire pour lequel vos fichiers d’analyse seront déposés.Ici, j’ai choisi un répertoire appelé test. Vous voudrez également remplir la fréquence d’images de vos images ainsi que la taille des pixels. Ici, mes fréquences d’images sont de cent millisecondes par image, ma taille de pixel est de huit nanomètres.Enfin, vous aurez besoin de fichiers de masque pour exécuter le logiciel de détection et d’analyse automatisées de l’exocytose. Vous pouvez utiliser le bouton de création de masque inclus afin de générer automatiquement des fichiers de masque à partir de vos fichiers de données. L’indicateur de course jaunit, puis redevient vert lorsque le fabricant de masques a fini de fonctionner.Votre masque sera déposé dans un nouveau dossier appelé fichiers de masque dans le répertoire de votre choix. Et notez que les fichiers de masque rempliront automatiquement la liste ici. Vous voudrez vérifier que vos fichiers de masque sont correctement conçus pour vos fichiers de données, et vous pouvez le faire en mettant en surbrillance l’un des fichiers de données de la liste, ainsi que le fichier de masque correspondant.La première image de votre fichier de données apparaîtra et le fichier de masque sélectionné apparaîtra également. Ici. Nous pouvons voir que nos fichiers de masque sont appropriés pour l’analyse en cours. Les fichiers de masque peuvent également être fournis séparément par l’utilisateur.Lorsque l’on souhaite créer un fichier de masque à partir d’un fichier de données actuel, nous vous recommandons d’utiliser Image J.In pour ce faire, ouvrez d’abord l’image dans Image J à partir de laquelle vous souhaitez créer un fichier de masque. Vous pouvez ensuite utiliser l’outil de sélection de polygones pour commencer à créer un fichier de masque en cliquant autour du bord de la cellule. Lorsque vous avez terminé votre masque, double-cliquez pour vous connecter à l’ensemble du polygone.Une fois cela terminé, vous vous dirigerez vers l’édition, la sélection et la création du masque. Un masque inversé sera créé. Vous souhaiterez enregistrer ce fichier de masque en utilisant le même nom que le fichier de données suivi de _mask_file.Maintenant, si vous fournissez vos propres fichiers de masque personnalisés, il est important de faire savoir au logiciel de détection automatisée où se trouvent ces fichiers de masque. Pour ce faire, vous cliquerez sur le bouton Rechercher les fichiers de masque et accéderez au répertoire dans lequel se trouvent vos fichiers de masque. Les nouveaux fichiers de masque rempliront ensuite la liste ici.Il est important que vous disposiez d’un masque pour chaque fichier de données avant que l’analyse puisse être exécutée. Maintenant, une fois que vous avez chargé votre jeu de données, vos fichiers de masque, votre fréquence d’images et votre taille de pixel ajustés correctement, et un répertoire choisi, vous pouvez enfin décider si vous souhaitez inclure la classification dans votre analyse. Si vous basculez le bouton de classification, en plus de détecter les événements exocytaires, chaque événement exocytaire sera classé dans l’une des quatre classes.Une fois que vous avez décidé de la manière dont votre analyse doit être exécutée, vous pouvez commencer l’analyse en cliquant sur le bouton d’analyse. L’indicateur d’exécution devient jaune pour indiquer que l’analyse est en cours et redevient vert lorsque votre analyse est terminée. Une fois l’analyse terminée, comme indiqué par votre indicateur d’exécution passant du jaune au vert, vous remarquerez qu’un nouveau dossier de fichiers de données est apparu dans le répertoire de votre choix.Dans le dossier des fichiers de données, vous trouverez des fichiers d’analyse correspondant à chaque ensemble d’images de votre exécution d’analyse. De plus, un fichier de statistiques cellulaires contenant des informations sommaires telles que la fréquence de l’exocytose pour chacun des ensembles d’images est ici. Pour chaque ensemble d’images, vous disposez d’un fichier de traces fluorescentes, qui contient des informations sur la position X, la position Y et le numéro d’image pour l’endroit où les événements exocytaires se produisent.De plus, la fluorescence moyenne dans une région d’intérêt autour de chaque événement exocytaire est présentée avant, pendant et après l’exocytose. En outre, il existe également un fichier de suivi, qui contient des informations similaires sur les positions X, Y et temporelles. Cependant, si la case de classification est cochée, en outre, il y aura quatre colonnes supplémentaires, qui indiquent la probabilité que l’événement exocytaire appartienne à l’une des quatre classes.Soit fusion de vésicules complète instantanée, fusion complète de vésicules retardée, baiser et courir instantanément, ou baiser et courir retardé. Un événement exocytaire appartient à l’une des quatre classes s’il est supérieur à 0,5 et est la probabilité la plus élevée au sein des quatre classes gouvernées. Dans ce cas, le premier événement exocytaire ici appartient à la classe instantanée de fusion de vésicules complète, car c’est le nombre le plus élevé au-dessus des quatre classes et il est supérieur à 0,5.En outre, il existe un certain nombre d’autres fichiers de caractéristiques pour chaque ensemble d’images, qui sont utilisés lors de la classification de l’exocytose et peuvent être intéressants pour une analyse plus approfondie. Enfin, si nous voulons utiliser l’analyse K de Ripley afin de détecter l’organisation spatio-temporelle de l’exocytose, nous allons d’abord commencer par diviser notre fichier de masque en un fichier de masque de neurite et un fichier de masque de soma. Nous allons le faire en ouvrant d’abord notre masque dans Image J.Nous voudrons utiliser le sélecteur de couleurs afin de sélectionner un pixel d’arrière-plan.Et de cette façon, lorsque nous remplissons le fichier de masque, c’est la valeur correcte. Ensuite, nous utiliserons l’outil de sélection de polygones et décrirons la région somatique. Maintenant, cela nécessite un peu de prise de décision subjective et manuelle.nous suggérons un ellipsoïde rugueux. Une fois que vous avez terminé cela, vous allez ensuite éditer, sélectionner et créer un masque. Enfin, vous revenez à notre fichier de masque d’origine et utilisez l’édition et le remplissage afin de remplir le soma, et maintenant nous avons un fichier de masque neurite et soma séparé, que vous enregistrerez ensuite.Une fois que vous avez enregistré votre fichier de masque neurite et soma séparé, ici, je l’ai en tant que fichier de masque underscore neur pour neurite et underscores soma, nous allons venir à MATLAB et ouvrir le fichier MATLAB du réseau neurite 2D. Ici, nous allons naviguer dans le dossier actuel jusqu’à notre répertoire où nous avons déposé toutes nos données d’analyse. Une fois que nous avons fait cela, nous aurons alors changé le chemin du nom du masque en notre nouveau fichier de masque qui est le neurite.Donc, dans ce cas, j’ai mon fichier de masque neurite sous le dossier des fichiers de masque. Nous allons ensuite changer le nom du fichier CSV à l’endroit où se trouve notre fichier de traces fluorescentes. Dans ce cas, il est toujours dans le dossier des fichiers de données, et donc les fichiers de données slash et le nom du fichier CSV de traces fluorescentes.Une fois que cela a été terminé, vous pouvez ensuite appuyer sur run. Cela créera ensuite une version squelettée du fichier de masque de neurite et le déposera en tant que fichier CSV dans le dossier des fichiers de masque, que nous pouvons voir ici. Ensuite, nous allons également générer un fichier CSV pour le soma.Pour ce faire, ouvrez le fichier créateur de masque CSV. Vous voudrez mettre le chemin d’accès de votre masque soma et un nom pour le fichier CSV à créer. Ici, je viens d’aller de l’avant et d’utiliser le même nom de fichier exact, juste avec un point CSV ajouté.Appuyez sur Run, et vous verrez qu’un nouveau fichier CSV soma a été créé à côté de la neurite. Une fois que nous avons créé les fichiers CSV pour le masque de neurite et le masque de soma, nous pouvons exécuter l’analyse K de Ripley. Pour ce faire, nous allons naviguer jusqu’à R Studio et ouvrir le fichier R d’analyse K de Ripley.Il y a deux variables principales aux prises en compte, le masque neuronal et les points de données neuronales. Le masque neuronique pointera vers les fichiers de masque que vous souhaitez exécuter. Dans ce cas, j’exécute d’abord les fichiers de masque soma.Vous voudrez exécuter tous vos fichiers de masque soma séparément de tous vos fichiers de masque neurite. Ici, j’ai deux neurones, que je vais utiliser pour cette analyse. Cependant, vous pouvez en utiliser autant que vous le souhaitez pour l’analyse K de Ripley, vous voudrez simplement copier et coller ce code pour le masque de neurone et changer la variable à trois, et au-delà.La deuxième variable est les points de données neuronales. Ici, vous voulez le pointer vers le fichier qui a été généré par vos fonctionnalités tous les fichiers R extraits. Maintenant, le mien s’appelait fusion stats, et c’est donc ce qu’il lit ici.Comme mentionné, j’ai un deuxième fichier de masque de soma et un neurone, qui est en cours d’analyse à côté afin que nous puissions agréger le K de Ripley ensemble. Une fois que vous avez modifié ces chemins d’accès au chemin d’accès correct, vous utiliserez du code, exécuterez la région et exécuterez tout. Une fois l’exécution terminée, plusieurs tracés seront générés, y compris les valeurs K de Ripley groupées, ainsi que les diagrammes de densité.Ceux-ci peuvent être enregistrés en allant exporter, enregistrer l’image sous et en choisissant le format d’image approprié, le répertoire, le nom de fichier, et enfin en appuyant sur Enregistrer. Nous voyons ici des résultats représentatifs de 12 neurones corticaux murins exprimant l’évent en fluor imagés à deux jours in vitro en utilisant la microscopie TIRF. Dans A, nous voyons la fréquence de l’exocytose divisée par classe.Ici, nous pouvons voir que la fusion complète des vésicules instantanée se produit plus fréquemment que les autres classes. Dans B, nous pouvons voir la distribution du mode, confirmant que la fusion instantanée complète des vésicules représente plus de la moitié de tous les événements. En C, nous déterminons la distribution spatiale de l’exocytose sous forme de carte thermique.Nous pouvons voir que la majorité des événements exocytaires sont regroupés dans un point chaud près du soma, ainsi qu’aux extrémités distales des neurites. En D, nous pouvons déterminer que les événements exocytaires sont statistiquement regroupés de manière significative et que la taille de ces amas varie d’un demi-micron à un micron. L’utilisation d’un programme d’analyse automatisé pour identifier et analyser correctement les événements exocytaires de manière impartiale augmente l’efficacité de l’analyse et améliore la reproductibilité et la rigueur.Pour assurer la précision de la détection, il est important de maintenir un signal élevé au bruit pendant l’imagerie. La capture d’événements exocytaires ou d’autres événements transitoires sensibles au pH nécessite une fréquence d’imagerie suffisamment rapide pour capturer tous les événements et améliorer les estimations telles que la demi-vie ou le changement de pic de fluorescence. Nous avons démontré que non seulement ce programme fonctionne pour capturer avec précision la fluorescence sensible au pH dans les neurones en développement, mais aussi d’autres types de cellules.Toutefois, si vous utilisez un autre type de cellule, il est important de vérifier les différences de précision, en raison des comportements distincts des événements transitoires dans d’autres types de cellules. Cette classification n’a été utilisée que dans le développement des neurones à ce jour. Et en effet, nous ne savons pas que ces processus existent dans d’autres types de cellules ou à des moments de développement ultérieurs dans les neurones.

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JoVE Journal

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Biologie

Cette vidéo montre une technique pour visualiser l’exocytose dans les mastocytes. Les cellules sont incubées avec du FITC-dextran – un rapporteur fluorescent – qui est absorbé par les cellules à l’intérieur des granules sécrétoires (SG), où le pH acide éteint sa fluorescence. Lors de la stimulation de l'exocytose granulaire, le pH plus élevé du milieu induit une fluorescence rapporteure à l'intérieur des SG fusionnés, qui est visualisée à l'aide d'un microscope à fluorescence.

Une technique in vitro pour visualiser l’exocytose des granules sécrétoires dans les mastocytes

endocytose médiée par la clathrine, un processus rapide et hautement dynamique internalise de nombreuses protéines, y compris les récepteurs de signalisation. Le protocole décrit ici visualise directement la cinétique des événements endocytaires individuels. Ceci est essentiel pour comprendre comment les membres centraux de la machinerie endocytaire se coordonnent les uns avec les autres, et comment la cargaison de protéines influence ce processus.

Visualisation endocytose clathrine de G récepteurs couplés aux protéines à un seul événement résolution par microscopie TIRF

De nombreux procédés existent pour la mesure de vésicules extracellulaires (VE) à l'aide de la cytométrie de flux (FCM). Plusieurs aspects doivent être considérés au moment de déterminer la méthode la plus appropriée à utiliser. Deux protocoles de mesure pour les véhicules électriques sont présentés, en utilisant soit la détection individu ou une approche à base de billes.

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L'objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l'évaluation quantitative de la libération d'un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d'intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Endocytose Vésicule synaptique est détectée par microscopie de pHluorin fusionnée avec des protéines de la vésicule synaptique et par microscopie électronique de l’absorption de la vésicule.

Mesurer l’endocytose de la vésicule synaptique dans des neurones Hippocampal cultivés

Le stress osmotique affecte exocytose et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de ce processus. Nous démontrons comment combinant méthodes électrochimiques ainsi que de la microscopie électronique peut être utilisé pour étudier l’effet de la pression osmotique extracellulaire sur l’activité de l’exocytose, la vésicule quantique taille et la quantité de neurotransmetteur libéré au cours de l’exocytose.

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