Name: Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Découvrez l'isolation d'astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés par tri des noyaux activés par fluorescence. Cette méthode permet d'obtenir des populations purifiées pour des analyses transcriptomiques et d'accessibilité chromatinienne.

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Nous tenons à remercier les membres en pathologie et neurochirurgie de l’École de médecine Icahn du mont Sinaï pour leur aide dans l’approvisionnement en tissus cérébraux anonymisés et le CORE de cytométrie en flux de l’ISMMS pour les conseils d’experts. L’étude a été partiellement financée par NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (à N.M.T.) et R61DA048207 (à S.A.).

NOTE: Le Programme pour la protection des sujets humains de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï (ISMMS) et de son Conseil d’examen institutionnel (CISR) assure la conduite éthique de la recherche et la conformité aux réglementations fédérales, étatiques et institutionnelles. Dans cette étude, tous les échantillons post-mortem utilisés ont été anonymisés, obtenus avec le consentement approprié par l’intermédiaire du biodépôt et ont été exemptés de la désignation de « recherche humaine » par la CISR de l’ISMMS (HS#14-01007).
1. Préparation du tampon
REMARQUE: Si vous effectuez un séquençage de l’ARN en aval, traitez soigneusement tous les espaces de travail et outils avec la solution de décontamination par RNase pour prévenir la dégradation de l’ARNm.
<ol><li>Préparer le tampon de lyse.<ol>
<li>Dissoudre dans H2Odistillé jusqu’à 50 mL : 5,47 g de saccharose (0,32 M final), 250 μL de 1 MCaCl2 (5 mM final), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM final), 10 μL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 500 mM (0,1 mM final), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 50 μL de Triton X-100 (0,1 % final) et 17 μL de 3 M de dithiothréitol (TNT, 1 mM final, ajouter frais) (voir le Tableau des matériaux).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer un tampon de saccharose<ol>
<li>Dissoudre ce qui suit dans H2O distillé jusqu’à 50 mL : 30,78 g de saccharose (1,8 M final), 150 μL de 1 M Mg(CH3COO)2 (3 mM final), 500 μL de 1 M Tris-HCl (pH 8) (10 mM final), 17 μL de 3 M TNT (1 mM final, ajouter frais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Dissociation tissulaire congelée en suspension mononucléaire
<ol><li>Ajouter 4 mL de tampon de lyse glacé à un douncer de tissu en verre de 7 mL (broyeur) et garder sur la glace. Disséquer environ 200 à 400 mg de cortex adulte humain fraîchement congelé, dounce environ 50x et transférer l’homogénat tissulaire dans un tube en polypropylène ultracentrifuge de 12 mL.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette de 5 mL, ajouter 6,5 mL de tampon de saccharose glacé au fond du tube ultracentrifuge, en prenant soin de ne pas perturber la couche entre le saccharose et l’homogénat tissulaire. REMARQUE: Si vous traitez des échantillons supplémentaires, équilibrez soigneusement les tubes en poids en ajoutant un tampon de lyse supplémentaire à l’échantillon plus léger. Un équilibrage précis des tubes d’ultracentrifugation est essentiel pour éviter d’endommager le rotor et assurer une rotation à la bonne vitesse.</li>
</ol>3. Ultracentrifugation
<ol><li>Ultracentrifugeer le lysat à 24 400 tr/min (101 814 × g) pendant 1 h à 4 °C. Aspirez soigneusement le surnageant et les débris sans perturber la pastille. REMARQUE: Une pastille peut ne pas être visible si elle commence avec moins de 200 mg de tissu.</li>
	<li>Ajouter 600 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (Ca2+, Mg2+ libre) à la pastille de noyaux et incuber sur de la glace pendant 10 min avant de les remettre en suspension.</li>
	<li>Pipette de haut en bas 50 fois pour remettre en suspension la pastille de noyau sur la glace.</li>
	<li>Utilisez un hémocytomètre pour visualiser les noyaux intacts au microscope et pour vous assurer que la concentration de la remise en suspension est supérieure à 105 noyaux/mL avant de passer à l’étape suivante (combiner 10 μL des noyaux remis en suspension avec 10 μL de bleu de trypan).</li>
</ol>4. Incubation d’anticorps
<ol><li>Pour identifier l’échantillon pour fans, ajouter 500 μL de la pastille d’échantillon remise en suspension, 490 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libre), 10 μL de 10% de BSA (0,1% final), 1 μL d’anticorps anti-NeuN de souris conjugué à AF555 (NeuN-AF555, concentration finale de 1:1000) et 1 μL d’anticorps anti-PAX6 de souris conjugué à l’allophycocyanine (PAX6-APC, concentration finale de 1:1000). REMARQUE: Des anticorps alternatifs conjugués à d’autres fluorophores peuvent être ajoutés (voir la discussion). Ici, la souris anti-OLIG2 conjuguée à AF488 (concentration de 1:1000) a été utilisée avec des résultats favorables.</li>
	<li>Effectuez des contrôles 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) uniquement et unicolores pour configurer les paramètres de contrôle, en utilisant une petite quantité de l’échantillon si nécessaire.<ol>
<li>Pour effectuer le contrôle unicolore AF555, ajoutez 20 μL de la pastille d’échantillon remise en suspension, 970 μL de 1x PBS (Ca2+, Mg2+ libre), 10 μL de 10% de BSA (0,1% final) et 1 μL d’anticorps NeuN-AF555 (concentration de 1:1000).</li>
		<li>Pour effectuer le contrôle monocolore APC, ajoutez 20 μL de la pastille d’échantillon remise en suspension, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libre), 10 μL de 10% BSA (0,1% final) et 1 μL d’anticorps PAX6-APC (concentration de 1:1000).</li>
		<li>Pour effectuer le contrôle DAPI uniquement, ajoutez 20 μL de la pastille d’échantillon remise en suspension, 970 μL de 1X PBS (Ca2+, Mg2+ libre) et 10 μL de 10 % de BSA (0,1 % final) (DAPI sera ajouté plus tard, voir 4.4). REMARQUE: Si plus de deux anticorps sont utilisés, il est recommandé d’effectuer un contrôle par fluorescence moins un (FMO) en plus des contrôles monocolores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber les échantillons et les commandes avec rotation dans l’obscurité pendant 1 h à 4 °C.</li>
	<li>Ajoutez DAPI à 1:1000 à tous les exemples et contrôles, puis procédez au tri.</li>
</ol>5. Tri des noyaux activés par fluorescence (FANS)
REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser une installation institutionnelle de cytométrie en flux avec l’aide d’un personnel qualifié, à moins qu’elle ne soit déjà compétente en cytométrie en flux / techniques de tri.
<ol><li>Porte comme indiqué ci-dessous.<ol>
<li>Tout d’abord, et pour chaque échantillon, porte par dispersion directe (FSC-A) vs. la dispersion latérale (SSC-A) pour inclure les particules dans la plage de taille appropriée pour les noyaux, excluant ainsi les globules rouges et les débris (figure 1A). REMARQUE: Une préparation de noyaux très propre peut faire la distinction entre un amas de débris plus petit et un groupe de noyaux.</li>
		<li>Ensuite, et pour chaque échantillon, passez par FSC-A vs FSC-W (ou FSC-A vs FSC-H ) et SSC-A vs SSC-W (ou SSC-A vs SSC-H ) pour n’inclure que les noyaux singulets (Figure 1B).</li>
		<li>Ensuite, et pour chaque échantillon, la porte par DAPI inclut les singulets de noyaux intacts (population fermée élevée en DAPI), à l’exclusion des débris (faible en DAPI, à gauche de la population fermée) et des doublets (à droite de la population fermée) (figure 1C).</li>
		<li>Définissez d’autres grilles basées sur des contrôles de fluorescence, déterminés visuellement sous forme de grappes distinctes sur des diagrammes FACS.<ol>
<li>Exécuter un contrôle DAPI uniquement pour déterminer la coloration de fond des populations, en l’absence d’anticorps (Figure 1D et Figure 2A).</li>
			<li>Exécutez la commande NeuN-AF555 uniquement pour déterminer la coupure de la coloration NeuN+ dans le canal pour AF555 (Figure 2B).</li>
			<li>Exécutez le contrôle PAX6-APC uniquement pour déterminer la coupure de coloration PAX6+ dans le canal APC (Figure 2C).</li>
			<li>Exécutez des contrôles unicolores supplémentaires si vous utilisez plus d’anticorps (Figure 2D,E). REMARQUE: Si vous utilisez plus de deux anticorps, un contrôle FMO est recommandé pour visualiser tout changement dans les populations.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Une fois tous les contrôles exécutés, tracez les portes des collections NeuN+ et PAX6+ au-dessus des seuils établis.<ol>
<li>Gate la population NeuN+ pour collecter les neurones (Figure 1E et Figure 2F).</li>
			<li>Gate la population PAX6+ de la population NeuN- pour prélever des astrocytes (Figure 1E, F et Figure 2F).</li>
			<li>Gate et collectez des populations gliales supplémentaires (telles que les cellules progénitrices oligodendrocytes, comme le montre ici OLIG2+) de la population NeuN-PAX6- (Figure 1F). REMARQUE: Dans le cas où il est difficile de déterminer les seuils de contrôle appropriés avec le logiciel de cytométrie en flux en raison de populations indistinctes, il peut être utile de modifier le nombre d’événements visualisés (en augmentant ou en réduisant le nombre d’événements sur le diagramme FANS).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prélever les échantillons de manière appropriée en fonction de l’analyse en aval prévue.</li>
</ol>6. Collecte des populations de FANS pour les analyses moléculaires en aval
<ol><li>Pour le séquençage de l’ARN en vrac, collectez 50 000 à 500 000 noyaux dans pbS (voir également rubrique 7.1).<ol>
<li>Ajouter 2 mL de solution de saccharose, 50 μL de 1 MCaCl2 et 30 μL de 1 M Mg(CH3COO)2, et remplir de PBS jusqu’à 10 mL.</li>
		<li>Inverser et incuber sur de la glace pendant 15 min, puis centrifuger à 900 × g pendant 10-15 min à 4 °C.</li>
		<li>Aspirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 mL de réactif extracteur d’ARN, vortex, congeler sur de la glace sèche et conserver à -80 °C.</li>
		<li>Alternativement, prélèvez les échantillons directement dans 200 μL du réactif extracteur d’ARN. Ajouter le réactif extracteur d’ARN jusqu’à 1 mL après le tri, en maintenant un rapport de 1:1 du réactif à l’échantillon trié. Vortex, congeler sur glace carbonique et conserver à -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour le dosage en vrac de la chromatine accessible par transposase par séquençage (ATAC-seq), recueillir 50 000 à 75 000 noyaux dans le PBS dans un tube de microcentrifuge recouvert d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 %. Congelez les noyaux sur de la glace carbonique/-80 °C ou utilisez-les immédiatement pour la préparation de l’ATAC.</li>
	<li>Pour sn RNA-seq ou ATAC-seq, collecter des noyaux dans 0,04% BSA dans PBS (voir également rubrique 7.2).</li>
</ol>7. Conseils de préparation préalable à la bibliothèque
<ol><li>Préparation de la bibliothèque de séquençage d’ARN nucléaire en vrac<ol>
<li>Après avoir recueilli dans le réactif d’extraction de l’ARN, effectuer une extraction standard de l’ARN phénol/chloroforme en ajoutant du phénol/chloroforme et en précipitant l’ARN de la couche aqueuse supérieure avec de l’éthanol, suivie d’une digestion de la DNase sur tube (15 min).</li>
		<li>Effectuer le nettoyage de l’ARN et le concentrer dans un volume final de 15 μL d’eau. REMARQUE: En utilisant cette méthode, la récupération représentative de 300 mg d’échantillon de cortex adulte est d’environ 300 000 noyaux NeuN + (ARN total de 15-20 ng / μL après nettoyage et concentration) et ~ 250 000 noyaux PAX6 + (ARN total de 10-12 ng / μL après nettoyage et concentration). Ce rendement représentatif peut varier considérablement en fonction de la qualité de l’échantillon, de la rigueur de contrôle et de la récupération de l’ARN.</li>
		<li>Effectuer une réaction en chaîne quantitative par polymérase (qPCR) avant le séquençage pour confirmer l’enrichissement des astrocytes basé sur une expression différentielle élevée des marqueurs astrocytaires canoniques (GFAP, SOX9), la 10-formyltétrahydrofolate déshydrogénase (ALDH1L1)) et l’épuisement des marqueurs neuronaux et autres marqueurs de lignée cellulaire (Figure 1G). NOTE: La collecte de la population double négative (NeuN-PAX6-) permet une analyse de contrôle de la qualité qPCR plus précise et à plusieurs niveaux pour l’enrichissement relatif des astrocytes (Figure 2H).</li>
		<li>Générez des bibliothèques d’ARN-seq à l’aide d’un kit recommandé pour les faibles valeurs de nombre d’intégrité de l’ARN, comme prévu pour les échantillons post-mortem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la bibliothèque de séquençage à noyau unique<ol>
<li>Effectuer le séquençage sn à travers un noyau de séquençage institutionnel.</li>
		<li>Pour le traitement et le séquençage à base de nanofluidique, utilisez la concentration recommandée de 1 × 106 cellules/mL dans au moins 60 μL de 1x PBS + 0,04 % de BSA pour le séquençage de l’ARN monogroupe (snRNA-seq) et de 3 × 106 cellules/mL dans au moins 20 μL de 1x PBS + 0,04 % BSA pour le dosage mononucléaire de la chromatine transposase-accessible par séquençage (snATAC-seq).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+neuroepigenetics+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The future of neuroepigenetics in the human brain.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).</li>
<li>Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neuroscience. 9, 42(2008).</li>
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<li>Sakurai, K., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurogenesis-controlling+factor%2C+Pax6%2C+inhibits+proliferation+and+promotes+maturation+in+murine+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes.</a> Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).</li>
<li>Zhong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+development+of+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Decoding the development of the human hippocampus.</a> Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).</li>
<li>Pollen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+identity+of+human+outer+radial+glia+during+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular identity of human outer radial glia during cortical development.</a> Cell. 163 (1), 55-67 (2015).</li>
<li>Cvekl, A., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAX6%3A+25th+anniversary+and+more+to+learn%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">PAX6: 25th anniversary and more to learn.</a> Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).</li>
<li>Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatiotemporal+study+of+gliosis+in+relation+to+depth+electrode+tracks+in+drug-resistant+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy.</a> European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).</li>
<li>Monoranu, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+measurement+as+quality+control+on+human+post+mortem+brain+tissue%3A+a+study+of+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology+and+Applied+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).</li>
<li>Ninkovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax6+regulates+survival+of+dopaminergic+olfactory+bulb+neurons+via+crystallin+%CE%B1A%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA.</a> Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

La conception expérimentale suivant le protocole décrit devrait être finalisée après avoir pris en compte plusieurs facteurs biologiques et techniques. Les échantillons de tissus de départ sont fraîchement congelés, sans avoir été fixés, et ont de préférence un court intervalle de prélèvement post-mortem pour maximiser la récupération des noyaux. Sur la base de l’expérience, un PMI allant jusqu’à 24 h permet une récupération adéquate des noyaux; cependant, un PMI de 12 h ou moins est préférable pour optimiser la récupéra...

La complexité moléculaire des astrocytes humains reste mal définie dans les tissus primaires, nécessitant de meilleurs outils pour leur isolement et leur caractérisation à haute résolution, à la fois dans la santé et la maladie. La séparation des neurones humains intacts et de la glie de leur niche s’est avérée difficile en raison de l’accès limité à des échantillons de tissus cérébraux frais, de la nature fortement interconnectée des processus gliaux et neuronaux et de l’activation cellulaire inévitable pendant le traitement, qui limitent la caractérisation moléculaire de ces types de cellules ex vivo1 . Le tri des noyaux activés par fluorescence (FANS) est apparu comme une alternative au tri des cellules vivantes, permettant la dissociation et l’immunotagging des populations de noyaux à partir de tissus congelés. Au cours de la dernière décennie, FANS est devenu largement utilisé pour isoler et caractériser moléculairement les populations de noyaux neuronaux humains (NeuN+) dans une variété de spécimens de cerveau et de régions anatomiques 1,2,3,4.
Cependant, des méthodes similaires pour isoler des sous-populations spécifiques de noyaux gliaux du cortex humain ont été limitées, ce qui a conduit à un manque relatif de sophistication dans la compréhension de la complexité des astrocytes dans les tissus normaux et malades. À cette fin, un protocole précédemment publié a été adapté pour isoler les populations neuronales humaines à l’aide de FANS4, et une méthode a été validée pour enrichir les astrocytes (et les progéniteurs oligodendrogliaux) en utilisant une combinaison de triples anticorps, capturant les astrocytes dans des conditions reposantes et réactives5. Pour enrichir spécifiquement les astrocytes de la fraction NeuN-, des anticorps ont été utilisés contre l’un des deux facteurs de transcription connus pour être exprimés différemment dans les populations d’astrocytes, PAX6 ou SRY-box transcription factor 9 (SOX9)6,7. PAX6 est fortement exprimé au cours du développement fœtal précoce dans les progéniteurs de type glie radiale dans les zones germinales et contribue à la fois à la neurogenèse et à la gliogenèse 8,9,10,11 ainsi qu’à la spécification neuronale rétinienne 12. Chez l’adulte, PAX6 est surexprimé différentiellement dans les astrocytes humainsau repos 6 et montre une co-expression protéique avec la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) dans les astrocytes tissulaires de l’épilepsie humaine13.
Ce protocole décrit l’isolement simultané des populations de noyaux néocorticaux neuronaux et enrichis en astrocytes par FANS. Le tissu post-mortem frais (non fixé) congelé (c.-à-d. fraîchement congelé) prélevé dans le cortex adulte est d’abord dissocié mécaniquement et chimiquement. Après lyse et ultracentrifugation dans un gradient de saccharose, les composants cytoplasmiques et extracellulaires sont éliminés tandis que les noyaux sont conservés. Les noyaux sont ensuite marqués avec des anticorps nucléaires conjugués par fluorescence correspondant aux lignées cibles souhaitées et triés à l’aide de FANS. Suite à cette approche, l’enrichissement des astrocytes est démontré dans les populations PAX6+NeuN- collectées, validées à la fois par un panel qPCR ciblé ainsi que par le séquençage de l’ARN nucléaire en aval.

<table><tbody><tr><td>10x PBS pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>70013073</td><td></td></tr><tr><td>CLONE D’ANTICORPS ANTI-NEUN A60</td><td>Millipore</td><td>MAB377A5MI</td><td>anti-NeuN de souris conjugué à un composé fluorescent AF555 (excitation, 553 nm ; émission, 568 nm)</td></tr><tr><td>ANTICORPS ANTI-OLIG2 CLONE 211</td><td>Millipore</td><td>MABN50A4MI</td><td>souris anti-OLIG2 conjuguée à un composé fluorescent AF488 (excitation, 499 nm ; émission, 520 nm)</td></tr><tr><td>Bovin Albumine sérique</td><td>Fisher</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage à lignes vives</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110V</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium anhydre</td><td>Fisher</td><td>C614-3</td><td></td></tr><tr><td>Passoires à cellules, 40 & micro ; M</td><td>SP Scienceware</td><td>136800040</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phénylindole, Dichlorhydrate)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNA Library Kit</td><td>Illumina, Nextera</td><td>FC-121&ndash ; 1030</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Broyeur de tissus</td><td>WHEATON</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>FACS Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BD FACSAria III</td></tr><tr><td>Acétate de magnésium tétrahydraté</td><td>Fisher</td><td>M13-500</td><td></td></tr><tr><td>PAX6 (PAX6/496) - 100 TESTS</td><td>Novus</td><td>NBP234705J</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrateur</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Solution de décontamination</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635005</td><td>Temps de fragmentation de 2,5 minutes, comme recommandé pour les faibles valeurs d’ARN RIN.</td></tr><tr><td>Saccharose, certifié cristal, ACS, 500 mg</td><td>Fisher</td><td>S5500</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor à godet oscillant</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, solution 1M, pH 8,0, qualité biologie moléculaire, ultra-pur</td><td>Thermo Scientific</td><td>J22638AE</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td>tensioactif non ionique dans un tampon de lyse</td></tr><tr><td>TRIzol LS Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>10296028</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td>pour l’isolement de l’ARN</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter Optima XE-100</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’ultracentrifugation PP 9/16 X 3-1/2</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée UltraPure ( Sans RNAse, sans DNAse)</td><td>Invitrogen</td><td>10977023</td><td>appelé eau distillée</td></tr><tr><td>Ultrapure EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15576-028</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

Isolation of Adult Human Astrocyte Populations from Fresh-Frozen Cortex Using Fluorescence-Activated Nuclei Sorting

La complexité des astrocytes humains reste mal définie dans les tissus humains primaires, nécessitant de meilleurs outils pour leur isolement et leur caractérisation moléculaire. Le tri des noyaux activés par fluorescence (FANS) peut être utilisé pour isoler et étudier avec succès des populations de noyaux neuronaux humains (NeuN+) à partir de tissus d’archives congelés, évitant ainsi les problèmes associés à la manipulation de tissus frais. Cependant, les efforts pour isoler de la même manière l’astroglie de l’élément non neuronal (NeuN-) font défaut. Une stratégie d’immunomarquage récemment développée et validée utilise trois anticorps de facteur de transcription pour isoler simultanément des populations de noyaux neuronaux enrichis (NeuN+), astrocytes (protéine de boîte appariée 6 (PAX6)+NeuN-) et oligodendrocytes progéniteurs (OLIG2+NeuN-) à partir de tissus de néocortex humains post-mortem non malades, frais (non fixés) congelés par bouton-pression.
Cette technique s’est avérée utile pour la caractérisation des altérations du transcriptome spécifiques au type cellulaire dans le néocortex de l’épilepsie pathologique primaire. Les analyses transcriptomiques ont confirmé que les populations triées PAX6+ NeuN sont solidement enrichies pour les marqueurs pan-astrocytaires et capturent les astrocytes dans des conditions de repos et de réactivité. Cet article décrit la méthodologie FANS pour l’isolement des populations de noyaux enrichis en astrocytes du cortex humain fraîchement congelé, y compris la dissociation tissulaire en suspension à noyau unique (sn); immunomarquage des noyaux avec des anticorps conjugués par fluorescence anti-NeuN et anti-PAX6; Stratégies de contrôle DE LA FAN et mesures de contrôle de la qualité pour optimiser la sensibilité et la spécificité lors du tri et pour confirmer l’enrichissement des astrocytes; et l’approvisionnement recommandé pour le séquençage de l’accessibilité du transcriptome et de la chromatine en aval à une résolution en vrac ou en sn. Ce protocole est applicable aux échantillons corticaux humains non nécrotiques, fraîchement congelés, présentant diverses pathologies et au prélèvement de tissus post-mortem recommandé dans les 24 heures.

Les noyaux ont été prélevés dans des tissus de néocortex temporals frais (non fixés) congelés par pression avec un temps de collecte post-mortem de 12 h. Après dissociation tissulaire en suspension de noyaux, les échantillons ont été incubés avec des anticorps contre NeuN, PAX6 et OLIG2, et triés selon le contrôle illustré à la figure 1 et à la figure 2. Les noyaux ont été collectés à partir de populations triées NeuN+, PAX6+NeuN- et OLIG2+NeuN( <strong class="x...

Nous avons développé une méthode qui enrichit et isole les populations d’astrocytes humains à partir de tissus fraîchement congelés pour une utilisation dans les analyses moléculaires en aval.

Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

The complexity of human astrocytes remains poorly defined in primary human tissue, requiring better tools for their isolation and molecular ...

Ce protocole peut aider les scientifiques qui s’intéressent à l’étude de la fonction moléculaire des astrocytes humains dans leur niche native. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’isolement et l’enrichissement d’un type cellulaire spécifique, les astrocytes adultes à partir d’échantillons de tissus cérébraux humains en vrac en utilisant le tri des noyaux activés par fluorescence. Cette méthodologie peut être appliquée à l’isolement d’autres types de cellules du néocortex humain, tels que les neurones et les cellules progénitrices d’oligodendrocytes à l’aide d’autres anticorps conjugués fluorescents appropriés.Commencez à disséquer environ 200 à 400 milligrammes de tissu à partir d’un échantillon de tissu de cortex adulte humain fraîchement congelé. Placez le tissu dans un douncer en verre de sept millilitres contenant quatre millilitres de tampon de lyse glacée sur de la glace et broyez le tissu environ 50 fois. Transférer l’homogénat dans un tube en polypropylène ultracentrifuge de 12 millilitres.Utilisez une pipette de cinq millilitres pour ajouter 6,5 millilitres de tampon de saccharose glacé au fond du tube ultracentrifuge sans perturber l’interface en

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Dans cette vidéo, nous décrivons la méthode pour obtenir une préparation pure d’astrocytes à partir de souris nouvellement nées.

Isolement des astrocytes : une méthode pour obtenir une préparation pure d’astrocytes corticaux de souris

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Une technique simple pour isoler et cultiver des astrocytes murins

Cette vidéo montre la procédure d’isolement et de tri des noyaux de tissus cérébraux humains fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence (FANS), ce qui permet d’étudier différentes populations cellulaires pour diverses applications neurologiques.

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Nous décrivons ici un protocole détaillé pour générer des cultures hautement enrichies d’astrocytes dérivés de différentes régions du système nerveux central de souris postnatales et leur conversion directe en neurones fonctionnels par l’expression forcée de facteurs de transcription.

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À ce jour, les protocoles d’isolement simultané de tous les principaux types de cellules résidentes du système nerveux central à partir d’une même souris sont une demande non satisfaite. Le protocole montre une procédure applicable chez les souris naïves et expérimentales atteintes d’encéphalomyélite auto-immune pour étudier les réseaux cellulaires complexes au cours de la neuroinflammation et réduire simultanément le nombre de souris requis.

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Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement de populations d’astrocytes humains adultes à partir de cortex fraîchement congelés à l’aide du tri des noyaux activés par fluorescence

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